Summary
La coopération entre un oncogène RAS activé comme V12 et des mutations dans les gènes de polarité cellulaire comme bourrée, à provoquer une croissance de la tumeur chez la drosophile, où les cellules tumorales présentent également des comportements invasives. Voici un protocole simple pour l'induction et l'observation des tumeurs bénignes et envahissantes est présenté.
Abstract
Drosophila a éclairé notre compréhension de la base génétique du développement normal et la maladie au cours des dernières décennies et aujourd'hui, il continue de contribuer énormément à notre compréhension des maladies complexes 1-7. La progression des tumeurs d'une bénigne à un état métastatique est un événement complexe 8 et a été modélisée chez la drosophile pour nous aider à mieux comprendre la base génétique de cette maladie 9. Ici, je présente un protocole simple pour induire génétiquement, observer et ensuite analyser la progression des tumeurs chez les larves de drosophile. La technique d'induction des tumeurs est basé sur le système de marcm 10 et exploite la coopération entre un oncogène activé, Ras V12 et la perte de gènes de polarité de la cellule (bourrée, et des disques à grande létale larves de géant) pour générer des tumeurs invasives 9. Je démontre comment ces tumeurs peuvent être visualisées dans les larves intactes etcomment ceux-ci peuvent être disséqués pour une analyse ultérieure. Le protocole simplifié présenté ici devrait permettre à cette technique pour être utilisé par les chercheurs intéressés à comprendre le rôle d'un gène dans l'invasion tumorale.
Introduction
La progression des tumeurs d'une bénigne à un état métastatique est un processus de sage étape qui se caractérise par l'évasion de mécanismes protecteurs présents dans le corps 8. Par exemple les cellules tumorales dans le corps doivent être en mesure d'échapper à l'apoptose et le système immunitaire, la percée de la matrice extracellulaire spécialisée (ECM) appelée membrane basale, et de surmonter tous les contrôles sociaux imposés par les cellules environnantes 8. C'est grâce à une progression pas à pas sage que les cellules cancéreuses acquièrent la capacité de migrer et de coloniser des sites distants dans un processus appelé métastase. Notre compréhension de la façon dont la cellule tumorale surmonte les barrières imposées par le corps est encore à ses balbutiements, cependant, l'image qui émerge de la recherche effectuée points ainsi loin d'une utilisation répétée des processus normaux de développement et des voies de signalisation par les cellules cancéreuses 11-13.
La mouche des fruits Drosophila melanogaster a énormément contribué à notre understanding du développement normal et la maladie par l'utilisation de techniques génétiques sophistiquées développées au cours des dernières décennies 14-17. En utilisant la mutagenèse et les outils de surexpression nous sommes arrivés à une meilleure compréhension des différents oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs 18-22. Cependant, les métastases de la tumeur est le résultat d'une coopération entre plusieurs lésions génétiques qui ont été étudiés principalement dans des modèles de culture de cellules 23,24, ainsi que différents modèles de xénogreffe 25-27. Ces modèles quoique puissante ont leurs limites car ils ne reproduisent pas entièrement aux conditions énoncées dans un organisme vivant. En outre, les modèles transgéniques disponibles chez la souris sont encombrants et peu propice à l'analyse génétique de comportement invasif 28,29. Plusieurs études ont tenté de comprendre l'invasion des cellules tumorales chez la drosophile 30,31. Ces techniques utilisent principalement la transplantation de tumeurs primaires aux hôtes et reposent sur le suivi de la tratumeurs nsplanted pour invasion des tissus voisins 32,33. Une technique puissante appelée marcm 10 a été adapté par Pagliarini et Xu pour modéliser l'invasion tumorale chez la drosophile 9. Cette modélisation élégante génétique de l'invasion tumorale a exploité la coopération entre un oncogène activé et la perte de la polarité cellulaire. La puissance de cette modélisation réside dans le fait que les tumeurs invasives sont créés dans un organisme intact contournant ainsi le besoin d'une transplantation de tissus. Pour provoquer la coopération oncogène, un oncogène Ras activé comme V12 est exprimée dans les clones de cellules dans le disque d'eye-antennaire larvaire. En raison de la technique de marcm ces clones sont également marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP) pour une visualisation facile et sont publiés homozygotes pour les mutants de la polarité de la cellule tels que les larves létale géant, bourrée, et des disques de grandes. Résulte GFP étiqueté tumeurs invasives dans l' complexe céphalique. Dans ce rapport, jedémontrer comment provoquer, et de visualiser ces tumeurs invasives à la fois dans le cadre d'une larve intact et dans disséquée complexe céphalique. L'induction de tumeurs présentée ici utilise des réactifs sur le deuxième chromosome de Drosophila. Dans le tableau 2, je fournis une liste de stocks sur X et 3 e chromosomes qui peuvent être utilisés dans le même but. Je crois que ce protocole simplifié fera cette technique facilement accessibles aux chercheurs qui s'intéressent à la compréhension de la base moléculaire de la progression tumorale.
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Protocol
Une. L'induction de tumeurs non invasives bénignes
- Utiliser les stocks énumérés dans le tableau 2 pour l'induction de tumeurs bénignes.
- Préparer un levain pour la "tester" le bilan de la génotype suivante: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
- Préparer un levain pour la "testé" le bilan de la génotype suivant: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
- Recueillir dix filles vierges du "testeur" actions et dix mâles de la souche "testé".
- Traverser les hommes et les femmes de la "tester" et le stock "testé" en les plaçant à la fois dans un flacon avec de la nourriture à la mouche.
- Placez la croix dans un incubateur à 25 ° C et laisser les mâles et les femelles pour s'accoupler et pondre des œufs pendant 24-48 h.
- Vérifiez les flacons pour la ponte suffisante et la présence de larves de premier stade de s'assurer que la culture n'est pas en train de s'assécher.
- Ajouter quelques gouttes d'autoclavel'eau distillée à la culture pour le garder humide (si la culture est en train de s'assécher).
- Continuer à surveiller la culture et répétez l'étape 1.7.1 si nécessaire.
- Respecter errant troisième stade larvaire sous un stéréomicroscope de fluorescence, comme indiqué à l'article 3.
2. L'induction de tumeurs invasives
- Utiliser les stocks énumérés dans le tableau 2 pour l'induction de tumeurs invasives.
- Utilisez la culture de départ de l'étape 1.2 ci-dessus du génotype suivante: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
- Préparer un levain pour la "testé" le bilan de la génotype suivant: w; lgl 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
- Recueillir dix filles vierges du "testeur" actions et dix mâles de la souche "testé".
- Traverser les hommes et les femmes de la "tester" et le stock "testé" en les plaçant à la fois dans un flacon à la mouche food.
- Placez la croix dans un incubateur à 25 ° C et laisser les mâles et les femelles pour s'accoupler et pondre des œufs pendant 24-48 h.
- Vérifiez les flacons pour la ponte suffisante et la présence de larves de premier stade de s'assurer que la culture n'est pas en train de s'assécher.
- Ajouter quelques gouttes d'eau distillée à l'autoclave à la culture pour le garder humide (si la culture est en train de s'assécher).
- Continuer à surveiller la culture de la sécheresse et répétez l'étape 2.7.1 si nécessaire.
- Respecter troisième stade larvaire sous un stéréomicroscope de fluorescence, comme indiqué à l'article 3.
3. Observation de tumeurs bénignes et envahissantes
- Utilisez troisième stade larvaire pour l'isolement de tumeur bénigne et la visualisation.
- Mouillez un pinceau dans de l'eau distillée, et l'utilisation de ce pinceau gratter un peu de larves de troisième stade de la paroi du flacon de culture.
- Placer les larves dans une lame de dépression avec du PBS 1X, puis en utilisant une peinture humide brosse ferraillee de tout produit alimentaire de l'épiderme larvaire.
- Placer les larves dans une boîte de Petri et laisser au congélateur à -20 ° C pendant 30 min pour immobiliser la larve.
- Autre méthode pour immobiliser les larves à l'aide FLYNAP.
- Placez une baguette de FLYNAP trempé dans FLYNAP le flacon de 3.1.3.2 et après avoir branché le let flacon flacon bouché avec larves reposer pendant 30 à 40 min.
- Placez la larve immobilisé sur une lame de verre, ajouter une goutte d'huile d'halocarbures lumière, couvrir avec un couvercle en verre et observer sous un stéréomicroscope de fluorescence avec la possibilité de visualiser la protéine fluorescente verte (GFP).
- Les larves de palier de tumeur bénigne va émettre une fluorescence verte dans la région antérieure, où le complexe est présent céphalique.
- Sélectionnez jour 10 larves (après induction) de la culture définie à l'étape 2 ci-dessus pour l'observation de tumeurs invasives. Jour 10 larves sont choisis parce que les larves d'appui de tumeur invasive ont un l prolongéestade Arval et généralement ne parviennent pas à pupariate.
- Suivez les étapes 3.1.1 à 3.1.4, sauf qu'au lieu de la troisième journée stade de l'utilisation des larves de 10 larves.
- Le jour 10 larves de palier de la tumeur invasive une fluorescence verte dans la région antérieure, où le complexe est présent céphalique.
- Si le microscope à fluorescence est équipé d'un appareil photo numérique, puis prendre des photos des larves d'appui de tumeur bénigne et invasive fluorescent.
4. Dissection de l'Observation complexe et plus céphalique de tumeurs bénignes et envahissantes
L'épiderme translucides de la chenille, il est difficile d'observer l'étendue de l'invasion des tumeurs. Ainsi, l'étendue de l'invasion est mieux visualisé par la dissection du complexe céphalique de la larve. Les étapes suivantes devraient être utilisés pour disséquer le complexe céphalique.
- L'utilisation d'un pinceau humide sélectionner troisième stade larvaire (pour les tumeurs bénignes) et le jour 10 larves (pour les tumeurs invasives) felon les flacons de culture respectives.
- Placer les larves dans un puits d'une plaque de dissection contenant du PBS 1X froid. Utilisez un pinceau pour racler les particules de nourriture de l'épiderme larvaire.
- Transfert larves propre pour un nouveau puits de la boîte de dissection contenant du PBS 1X froid.
- Vérification de la présence de fluorescence de la GFP en utilisant un microscope stéréoscopique capable de détecter la fluorescence. Jeter les larves de roulement non-GFP.
- Ajouter 1,0 ml de PBS 1X froid à un nouveau puits sur le plat de dissection et l'aide d'une paire de pinces transférer une larve portant soit des tumeurs bénignes ou envahissantes (le protocole de dissection reste le même pour ces deux types de tumeurs).
- Maintenir la chenille vers le bas en utilisant une paire de forceps environ 2/3rds de l'extrémité antérieure.
- Utilisez l'autre paire de pinces et intelligemment séparer le 1/3ème postérieure de la larve et jetez-le.
- Lâchez antérieure 2/3rds de la larve. Comme la pression à l'intérieur de la chenille est libérée du contenu de lalarve suinter hors de la cavité du corps.
- Utiliser une paire de pinces pour retirer le tube digestif, le corps gras et les autres composants internes de la larve qui ont suinté de la cavité du corps.
- Utilisez une paire de pinces pour tenir le crochet de la bouche de la larve et le pousser dans l'épiderme larvaire et en utilisant l'autre paire de pinces inverser la larve complètement.
- Utilisez la pince pour enlever délicatement et soigneusement le corps gras, les glandes salivaires, l'intestin, le complexe de disque de l'aile et des tubes de la trachée. Le complexe céphalique, devrait maintenant être visible attaché à l'hameçon de la bouche de la larve à l'envers. Les hémisphères du cerveau et la corde nerveuse ventrale (VNC) seraient toujours liée à l'épiderme larvaire par les nerfs émanant de la VNC.
- Utilisez une paire de pinces pour briser doucement les connexions entre les nerfs céphaliques et l'épiderme larvaire.
- Comme les connexions nerveuses entre la VNC et l'épiderme larvaires sont brisées et le corps de l'excès de graisse et d'autres tissus retirés, la co céphaliquemplex deviendrait clairement visible et sera fixé à l'épiderme larvaire seulement à l'embouchure crochets.
- Le complexe céphalique peut être laissée dans l'épiderme larvaire si le complexe doit être fixé pour les applications en aval comme la coloration des anticorps ou pour la visualisation plus tard.
- Si aucune autre applications en aval seraient effectuées alors le complexe céphalique peut être détaché de l'épiderme larvaire et placé dans une goutte de glycérine à base de milieu de montage pour observation et l'analyse. Utilisez Vectashield que les médias de montage.
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Representative Results
Par suite du protocole présenté ici, l'utilisateur sera en mesure d'induire des tumeurs bénignes par la surexpression d'un oncogène activé dans l'oeil disque imaginai antennaire larvaire. L'utilisateur sera également en mesure d'induire des tumeurs invasives dans le disque antennaire de l'oeil en surexprimant un oncogène activé dans les clones de cellules mutantes également pour un gène de la polarité cellulaire. Les tumeurs peuvent être facilement visualisés à l'aide d'un microscope stéréoscopique fluorescent comme "green fluorescent" tissu dans son ensemble que les larves ou céphaliques dans les complexes qui ont été disséqués hors de la cavité du corps larvaire (figure 1). Les tumeurs bénignes sont localisées dans le complexe de disque antennaire de l'oeil en tant que clones de cellules GFP-positives alors que les tumeurs invasives vont entraîner une prolifération massive de tumeurs et de la migration ultérieure de tumeurs invasives GFP-positives à la VNC et les autres organes contigus. Dans> 10 jours de larves (dérivé du génotype de la tumeur invasive) des tumeurs secondaires positifs et individuelles GFP floation dans la cavité du corps de la larve peut également être observée. En outre, tandis que les larves portant les tumeurs bénignes pupariate à temps, ceux portant les tumeurs invasives ont une période larvaire prolongée et ne parviennent pas à pupariate. Ces larves de palier de la tumeur invasive peut être facilement observé comme "larves géant" avec une cavité corporelle remplie de fluide.
Figure 1. . Des tumeurs bénignes et envahissantes chez la drosophile AB panneau gauche: vert fluorescent larve de tumeurs bénignes et envahissantes, respectivement panneau de droite AB:. Complexes céphaliques disséqués de larves portant soit des tumeurs bénignes ou envahissantes respectivement A) Les tumeurs bénignes sont localisés à l'oeil-antennaire. disque où ils sont induits. Notez que le tissu marqué de la GFP n'a pas migré vers les organes contigus commela corde nerveuse ventrale (VNC). Comparer ce B. B) des tumeurs complexes céphaliques portant envahissantes d'une larve de 10 jours. Notez la prolifération de tissu tumoral (vert) et également l'invasion des organes contigus comme le VNC et les crochets de la bouche par le tissu tumoral (indiqué par une flèche rouge). L'invasion des organes contigus par le tissu tumoral invasif est indiqué par une flèche. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Un système de classification des tumeurs invasives basées sur la mesure de la migration sur la VNC. Le schéma de la VNC est représenté avec la mesure de la migration de la tumeur représentée avec la couleur de remplissage vert. Le numéro associé à lala gravité de la migration est donnée ci-dessus chaque schéma.
| Chromosome | souche de génotype testeur | Testé souche de génotype | Référence | |
| Les tumeurs bénignes | Tumeurs invasives | |||
| 1 | w, Bain-GAL80, FRT19A; ey-FLP5, Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP | w, FRT19A; SAMU-Ras V12 | dlg m52, FRT19A/FM7C; SAMU-Ras V12 | Pagliarini et Xu, 2003 |
| 2 | y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP | w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO | w; lgl 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO | Pagliarini et Xu, 2003 |
| 3 | y, w, ey-FLP1; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP;FRT82B, Bain-GAL80 | w; SAMU-Ras V12; FRT82B | w; SAMU-Ras V12; FRT82B, scrib 1 / TM6Tb | Pagliarini et Xu, 2003 |
Tableau 2. Le génotype des stocks nécessaires pour induire les tumeurs bénignes et envahissantes. Toutes les actions ont été décrits dans la référence indiquée. Les stocks doivent être demandés au laboratoire de Tian Xu.
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Discussion
Le cancer est une maladie complexe avec une bien meilleure compréhension aujourd'hui que dans le passé. Cependant, il reste encore beaucoup à apprendre et expliqué avant que nous ayons une image complète des mécanismes sous-jacents. Le protocole simple présenté ici, il est possible d'induire des tumeurs bénignes et génétiquement invasives dans un organisme entier, puis l'étude de la biologie associée à la progression des tumeurs dans ce modèle. La plupart des techniques existantes de Drosophila et d'autres organismes ou l'autre utilisent un système de culture à base de cellules pour comprendre la tumorigenèse et la métastase ou un système qui emploie la transplantation de tissus de tumeurs primaires dans des hôtes adultes de 23 à 27. Tant la cellule et sur la base des techniques de transplantation ont leurs limites. Par exemple, la technique de transplantation est encombrant et prend du temps et peut entraîner la transplantation de tissus non tumoraux dans l'hôte. Il pourrait en résulter la production d'artefacts expérimentaux. En outre, culte de la cellulesystèmes basés ure sont que des approximations de l'environnement réel qui existe dans un organisme entier. Cette limitation rend difficile à imiter la tumeur très important et l'interaction de micro-environnement qui joue un rôle critique dans la progression tumorale et les métastases 34. La technique présentée ici a été utilisé avec succès par plusieurs groupes de recherche pour étudier la base génétique et moléculaire de la progression tumorale chez la drosophile. Par exemple, en utilisant cette technique, il a été démontré que la voie de JNK est régulée à la hausse à la fois dans les tumeurs invasives et est également nécessaire pour la progression de tumeurs 35,36. Dans une autre étude du rôle de la métalloprotéase matricielle dans la progression tumorale a été démontrée dans ce modèle 12,37 génétique.
Les étapes critiques associés au protocole présenté ici commencent avec le génotype correct des stocks utilisés pour l'induction des tumeurs bénignes et invasives. Il faut prendre soin de s'assurer que ceux-ciles stocks ne sont pas "brisent". Les stocks peuvent être vérifiés périodiquement pour la présence de jaune (y -) les mouches qui serait le signe d'un effondrement du stock. Cela semble indiquer que la cassette de FLP-Out dans le marcm testeur stock a spontanément flippé et serait donc exprimant Gal4 constitutive. Ceci peut être évité en conservant des stocks en double dans des flacons et à 18 ° C. En outre, comme les tumeurs sont provoquées, le jour où les larves doit être vérifiée pour les tumeurs bénignes et envahissantes est également critique. Bien que les larves de roulement de tumeur bénigne suivre un calendrier de développement qui est très similaire au type sauvage larves, l'histoire avec les tumeurs invasives portant larves est différente. L'affichage de larves d'appui de tumeur invasive étendu stade larvaire et certains ne parviennent pas à pupariate. En effet, cette propriété de nymphose contre nymphose échoué a été utilisé comme une mesure de suppression de tumeur invasive par Menut et al. 38 En raison de l'étendue des larvesstade de larves d'appui de tumeur invasive, il est essentiel d'observer les tumeurs invasives journée autour de 8-10 après induction pour de meilleurs résultats. Au jour 8-10 migration de la tumeur assez s'est passé sur la VNC de sorte qu'il est facilement observable au microscope stéréo. Au-delà de 10 jours, tandis que la tumeur peut être observé, il commence à engloutir complètement la VNC ce qui rend difficile d'orienter le complexe céphalique de spécimens disséqués. Une autre étape critique associée à la visualisation de tumeurs dans l'ensemble des larves est la capacité à immobiliser les larves. Les deux FlyNap et des températures réduites peuvent être utilisées pour immobiliser les larves comme indiqué dans le protocole détaillé. Enfin, si les complexes céphaliques disséqués doivent être colorées avec un anticorps puis les dissections doivent être effectuées sur de la glace et les complexes doivent être fixés dans les trente minutes.
La technique présentée ici peut être utilisée par les chercheurs pour comprendre la contribution des gènes suspectés de jouer un rôle dans la progression tumorale.En utilisant ce modèle génétique de la régulation de la place d'un gène peut être étudiée in situ par les techniques de marquage d'anticorps, soit par l'utilisation de la RT-PCR. On peut aussi tenter de comprendre si un gène est nécessaire pour la progression de la tumeur en utilisant ce modèle, en combinaison avec des mutants du gène en question ou de réactifs ARNi. Par exemple, un réactif ARNi pour un gène à être testé pour la suppression des tumeurs pourrait être présent sur le chromosome 3 e. Dans ce cas, le testeur et la combinaison d'actions testé pour le chromosome 2 pourraient être utilisés (tableau 2) seulement après l'ARNi portant 3ème chromosome a été franchi dans le stock testé. Une fois cet objectif atteint alors le testeur et actions testé pour le chromosome 2 peuvent être croisées et de suppression des tumeurs invasives analysés. Une suppression de phénotype tumoral invasif suggère l'implication d'un gène dans le processus invasif. Cependant, la suppression du phénotype invasif peut pas être complètement pénétrant et c'est pour cette raison que jeprésenter un schéma de classification pour les tumeurs invasives basées sur la mesure de la migration des tumeurs sur la VNC (Figure 2). Utilisant ce système de classification, on peut comparer facilement les tumeurs invasives de tumeurs invasives où un gène soupçonné d'être impliqué dans l'invasion a été renversé. Analyse de plusieurs complexes céphaliques peut donner une meilleure idée de l'étendue de la suppression de comportement envahissant.
Alors que le protocole présenté ici peut être utilisé en combinaison avec effet de choc d'un ou deux gènes pour étudier l'effet des gènes sur la progression tumorale, passes rabattues simultanées de plus de deux gènes, il est techniquement difficile à réaliser. Enfin, une modification de cette technique a été utilisée par Wu et al. À 39 comprendre les effets de la juxtaposition des cellules exprimant l'oncogène activé contre les cellules qui étaient mutant pour les gènes de polarité de la cellule. La technique par Wu et al. Était une modification au niveau des réactifs génétiques houtefois l'expérience utilisé dissection de complexes céphaliques pour la visualisation des tumeurs. Ainsi, le procédé de disséquer complexes céphaliques présentées ici pourrait être utile pour les scientifiques qui tentent d'utiliser la technique modifiée présentée par Wu et al. Ainsi.
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Disclosures
Je n'ai rien à divulguer.
Acknowledgments
Recherche dans mon laboratoire est soutenu par le Département WKU des fonds de démarrage de biologie, WKU Fondation de la recherche de la CRPA-je accorder # 11-8032 et par une subvention KBRIN-ZONE financé grâce à une subvention de parent de l'Institut national de sciences médicales générales des National Institutes de la Santé sous le numéro d'attribution 5P20GM103436-13. Je tiens également à remercier le Dr Tian Xu dans le laboratoire duquel j'ai été présenté à cette technique et le Dr Raymond Pagliarini qui le premier a créé cette technique dans le laboratoire Xu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
| Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
| Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
| 1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
| Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
| Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
| A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
| Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
| Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. | |||
References
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