מאמר זה מתאר שלוש הכנות מערכת עצבים באמצעות עלוקות: הקלטה תאית מהנוירונים בגרעיני הגחון, culturing נוירונים מגרעיני הגחון, והקלטה מתיקון של עור מעוצבבים למפה שדות חושיים.
העלוקה המים המתוקים, Hirudo medicinalis, הוא אורגניזם מודל צדדי כי נעשה שימוש כדי לענות על שאלות מדעיות בתחומים של נוירופיזיולוגיה, neuroethology, וביולוגיה התפתחותית. מטרת דו"ח זה היא לבסס את ניסיוני בטכניקות ממערכת העלוקה למאמר אחד שיהיה שימוש לפיזיולוגים עם מומחיות בהכנות מערכת עצבים אחרות, או לסטודנטים לביולוגיה עם ניסיון אלקטרופיזיולוגיה קטן או לא. אנו מדגימים כיצד לנתח את העלוקה להקלטת intracellularly ממעגלים עצביים שזוהו בגנגליון. הבא אנו מראים כיצד תאים בודדים של פונקציה ידועה ניתן להסיר מהגנגליון להיות מתורבת בצלחת פטרי, ואיך להקליט מאלו נוירונים בתרבית. ואז אנחנו מדגימים כיצד להכין פיסת עור מעוצבבים לשמש למיפוי שדות חושיים או מוטוריים. הכנות עלוקה אלה עדיין נמצאים בשימוש נרחב לטיפול בתכונות חשמליות בסיסיות של רשתות תקשורת עצביותKS, התנהגות, synaptogenesis, ופיתוח. הם גם מודול הכשרה מתאים למעבדות הוראת מדעי המוח או פיזיולוגיה.
הכנת העלוקה היא שימושית חוקר את הפונקציה של זיהוי, מוטורי (חושית ובין תאי עצב במערכת העצבים המרכזי של בעלי החיים (CNS). הרכוש שימושי של נוירונים עלוקה הוא שהצורה של פוטנציאל הפעולה שלהם ומאפייני biophysical אופייניות עבור נתנו סוג התא ניתן להסיר (כלומר P, N, T, Rz). נוירונים יתר על כן מבעלי החיים והתרבית במדיום מתאים שבו התאים לשמור על המאפיינים החשמליים שלהם במשך זמן רב ככל 45 ימים 1,2.
יתרון בולט של הגנגליון העלוקה ללימוד איך לעשות קלטות אלקטרו הוא שתאים אופייני ובאמינות מסודר בגנגליון בצורה שמאפשרת זיהוי של סוגי תאים שונים מהגנגליון לגנגליון ומבעלי החיים לבעלי חיים. המיקום והמורפולוגיה של תאי עצב בגרעיני עלוקה הייחודיים צוינו על ידי Retzius כבר 1891 3. ידע של הזהות אלקטרוני ותפקוד של הנוירון הוא יתרון עבור חוקרים מעגלים עצביים ועל ביצוע ניסויים בסוג תא נתון. בשל somata הגדול יחסית של תאי העצב בתוך הגנגליון הם נראים עם מיקרוסקופ לנתח, וsomata יכול להיות משופד באופן סלקטיבי עם microelectrodes להקלטת התכונות החשמליים שלהם.
צבעים ומולקולות גדולות יהיו ניתן להזריק לתוך תאים בודדים ומאפייני ערוץ שנחקרו על ידי מהדק תיקון. זרמים יוניים שיוצרים צורות השונות של פוטנציאל הפעולה האופייני בתאי עצב שונים זוהו 4-7. מחקירות בדפוס של עצבוב והסתעפות של נוירונים בודדים בתוך מערכת העצבים המרכזית, הקשרים סינפטיים שוחזרו בתרבות עם נוירונים שזוהו 2,8. מחקרים בגרעיני העלוקה סיפקו תובנה הפיתוח של מעגלים פונקציונליים שניתן למדוד עם אלקטרופיזיולוגיה, כמו גם עם וולדואר התנהגות בעלי חיים לימודים. CNS העלוקה כיהן גם כהכנה חשובה לחקר מנגנונים מעורבים עם תיקון עצבי והתחדשות בכל בעלי החיים ובתרבות 4-6,9-12.
במוחם של יונקים הוא משימה מרתיעה כדי להסביר את ההתנהגות במונחים של התכונות וקשרים של נוירונים שזוהו פרט. באופן עקרוני אפשר לקוות שהמחקר של מערכות מורכבות פחות כגון העלוקה יכול לעזור להגדיר את המנגנונים בסיסיים המשמשים בבעלי חיים גבוהים יותר. הקשרים המשמשים שעומדים בבסיס דפוס לשחות 13,14 וקצביות של הלב 15 היו מאופיינים גם בעלוקה. היכולת של נוירונים מסוימים עלוקה כדי ליצור שתי תקשורת החשמלית וכימית היא מסקרן. קשרים חלקם דו כיוונית ואילו אחרים הם חד כיווני כימיים אבל כיוונית חשמלי 7. הבנת הקשרים סינפטיים בתוך בעלי החיים, כמו גם ליצור מחדש את אותו typדואר של חיבורים בצלחת תרבות הם כלים רבי עוצמה לחקירת synaptogenesis 16-18, כמו גם פרופיל תרופתי של סינפסות 19. טכניקות ההקלטה וגירוי תאיים המתוארות כאן לספק בסיס למבחנים תרופתיים ומחקר בneuroethology ופיתוח.
בנוסף, חוט עצב הגחון המגזרי יכול להיות גזור עם פיסת עור מעוצבבים. עם היכולת לשמור על פיסת עור ותאי העצב בחיים, יכולים להיות נחקר שדות פתוחים חושיים על ידי הקלטת אותות חשמליים מהגוף התא (כלומר סומה) של נוירונים חושיים בתוך הגנגליון בטן המתאים במערכת העצבים המרכזית. וכך אפשר להעריך את הרגישות של הסופים חושיים על ידי יישום בדרגות שונות של כוח על העור ולמפות שדות פתוחים: מגע קל, לחץ, ורעיל (כואב) גירויים 20,21.
יתרון של הכנת עור הגנגליון עלוקה זו הוא כי ca אחדn לצייר אנטומית את מפת השדה פתוחה ולעקוב אחר התהליכים עצביים לנוירון זיהה מייד את תגובות החשמל מתועדות. שלושה ניסויי העלוקה מתוארים להלן כולם יכולים להיות סיימו מספר פעמים עם דגימה אחת, מה שהופך את מודול הוראה זו עלות אפקטיבית למעבדות אקדמיות.
המטרה של קבוצה זו של ניסויים הייתה 1) ללמד ולהציג את עקרונות היסוד של הקלטות תאיים מתא עצב הניתן לזיהוי ו2) להכיר בצורות האופייניות של אותות חשמליים שיכול לנבוע מסוגים עצביים בפרט אלה באמצעות עלוקות מבוגרים. יש היסטוריה עשירה של חקירות באמצעות העלוקה לחקירות נוירופיזיולוגיות ומחקר מתמשך בהתמודדות עם שאלות של מעגלים עצביים וויסות הגנים במהלך התפתחות, כמו גם במהלך תיקון והתחדשות 10 הסינפטי. Neuromodulation, במיוחד דרך מסלולים האמינים ביוגני, הייתה גם כיוון מחקר מוצלח בעלוקה. על ידי הוספת דופמין וסוכנים תרופתיים אחרים למערכת העצבים דרך תמיסת מלח, זה כבר הוכיח כי דופמין מודולציה רשתות עצביות מעורבות ב23 ודפוסים מוטוריים לזחילת התנהגות 24,25 קבלת החלטות. גישה ניסויית זה היא פתיle דרך לשלב אפנון למעבדה ההוראה (ולא יקר), והתאמת האיפור היוני של תמיסת מלח היא דרך יעילה ללמד משוואות נרנסט וגולדמן הודג'קין כץ.
כדי להצליח עם הכנות הגנגליון חשוב לי הגנגליון מתוח לפני שתנסה לתקוע סומה עם אלקטרודה תאית. אחרת סומה תעבור כאשר דוחף כלפי מטה על מנות גליה. בנוסף, כאשר desheathing הגנגליון להסרת תאי עצב לתרבות, להימנע מהאזור של עניין, כאשר חוצה את הגנגליון כך somas אינם פגומים כפי שהם יוסרו. כמו כן, דגירה מוגזמת באנזימים עלולה לגרום לתאי העצב להיות שבירים מדי כדי להסירו. זה דורש קצת ניסוי וטעייה כדי להגיע לזמן דגירה אידיאלי כי כל מנה של אנזימים שונה במקצת במעשיהם.
חקירה נוספת כדי לייעל את התקשורת והתרבות יכולה לשפר את הטכניקה הזו. ואריגורמים מפוקפקים, כגון הנוכחות של אינסולין, סוכרים, או גורמי גדילה יכולים להיבחן לתחזוקה ארוכה יותר של תרבויות. כדי לקבוע אם תאים לשמור על כושר שלהם כדי לסנתז משדרים, כגון סינתזת סרוטונין בתאי Rz, מכתים אדום ניטראלי יכול להיות מיושם על תווית תהליכי serotonergic. פלישה גם microglial לרקמה פגועה והתחדשות ניתן לכמת על ידי ימי כתמים גרעיניים לאחר פציעה.
למרות שיש הכנה זו יתרונות רבים להציע בבחינת התחדשות ותיקון, כמו גם מעגלים עצביים, זיהוי התרופתי ומולקולרי של תת קולט השונים בסינפסות לא היה מאופיין במלואו. ספריית תג רצף הביעה נגיש 26, והגנום העלוקה הרפואי בימים אלה התאספו 27, אך המגבלה העיקרית בעלוקה בהשוואה לכמה הכנות מודל היא היכולת לשנות את הגנום לגנים סלקטיבית בתאים מסוגים מסוימים. בt עובריםהגבלתו טופלה על ידי הזרקת DNA או dsRNA לווסת ביטוי גנים 28. לאחרונה טכניקת אקדח הגן נעשתה שימוש כדי להביע connexin חסר חוליות (innexin) חלבונים בתאי עצב עלוקה. ביטוי של innexin מHirudo verbana (hve-inx6) מספיק להיווצרות של צמתים פער מחוץ לרחם בעלוקה הרפואית 29. העלוקה או המרפא H. ורבנה כפי שהיו 30 הוא בטוח כדי לקדם את הבנת הפיסיולוגיה והאבולוציה של סינפסות חשמליות בשנים הבאות שלנו.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |