Summary
В этой статье описываются три нервные препараты системные помощью пиявок: внутриклеточный запись из нейронов в вентральной ганглиев, культивирование нейроны от брюшной ганглиях, а записи с пятачке иннервируемой кожи к карте сенсорные поля.
Abstract
Пресноводных пиявка, Hirudo MEDICINALIS, является универсальным модельным организмом, который был использован для решения научных вопросов в области нейрофизиологии, нейроэтологии и биологии развития. Цель этого доклада заключается в консолидации экспериментальные методы из системы пиявки в одну статью, которая будет полезна для физиологов, имеющих опыт в других нервных препаратов системы, или биологии студентов с небольшим опытом или вообще электрофизиологии. Мы показываем, как препарировать пиявку для записи внутри клетки от выявленных нейронных цепей в ганглии. Далее показано, как отдельные клетки из известной функции могут быть удалены из ганглия быть культивировали в чашке Петри, и как записывать из этих нейронов в культуре. Тогда мы показали, как подготовить участок иннервируемой кожи, которые будут использоваться для отображения сенсорных или моторных полей. Эти пиявки препараты по-прежнему широко используется для решения основных электрических свойств нервной Networкс, поведение, синапсов и развитие. Они также соответствующий учебный модуль для нейронауки или физиологии учебных лабораторий.
Introduction
Подготовка пиявка полезен для изучения функцию идентификационной (сенсорные, моторные и взаимодействий нейронов внутри животного центральной нервной системы (ЦНС). Полезное свойство пиявок нейронов является то, что форма их потенциалов действия и биофизических свойств характерны для Данный тип клеток (т.е. P, N, T, Rz). Более того нейроны могут быть удалены из животного и культивируют в подходящей среде, в которой клетки поддерживать свои электрические характеристики тех пор, пока 45 дней 1,2.
Явное преимущество пиявки ганглии для обучения, как сделать электрофизиологические записи является то, что клетки характерно и надежно расположены в ганглии в шаблон, который позволяет идентифицировать отдельных типов клеток от ганглия до ганглии и от животного к животному. Уникальное расположение и морфология нейронов в ганглиях пиявки были отмечены Retzius еще в 1891 3. Знание гое идентичность и функция нейрона является выгодным для исследования нейронных цепей и для проведения экспериментов с заданным типом клеток. Из-за относительно большой somata нейронов в пределах ганглия они видны с препаративным микроскопом, и somata может быть селективно наколотой с микроэлектродов для записи их электрические свойства.
Красители и большие молекулы могут быть введены в отдельные клетки и свойств канала, изученных патч зажима. Ионные токи, которые приводят к различным формам характерных потенциалов действия в различных нейронах были определены 4-7. Из исследований в структуре иннервации и разветвленности отдельных нейронов в ЦНС, синаптические соединения были воспроизведены в культуре с определенных нейронов 2,8. Исследования, проведенные в пиявки ганглиев обеспечили понимание развития функциональных схем, которые могут быть измерены с электрофизиологических а также с Wholэ поведение животных исследования. Пиявка ЦНС также служил в качестве ценного препарата для исследования механизмов, участвующих с нейронной ремонта и регенерации в целое животное и в культуре 4-6,9-12.
В мозгах млекопитающих это сложная задача, чтобы объяснить поведение в терминах свойств и связей отдельных, определенных нейронов. В принципе можно надеяться, что изучение менее сложных систем, таких как пиявки могут помочь определить основные механизмы, используемые в высших животных. Соединения, которые используются, лежащие в основе у кромки образец 13,14 и ритмичность сердца 15 были хорошо охарактеризованы в пиявки. Способность некоторых пиявки нейронов, чтобы сформировать как электрические и химические связи интригует. Некоторые соединения двунаправленный то время как другие являются однонаправленными химически но двунаправленный электрически 7. Понимание синаптических связей в рамках животного, а также воссоздания же Typэ соединений в культуре блюдо являются мощными инструментами для исследования синаптогенез 16-18, а также фармакологическое профилирование синапсов 19. Внутриклеточные методы записи и стимуляции, описанные здесь, обеспечивают основу для фармакологических анализов и исследований в нейроэтологии и развития.
Кроме того, сегментарный брюшная нервная цепь можно разрезать с пятачке иннервируемой кожи. С возможностью, чтобы сохранить участок кожи и нейроны в живых, сенсорные рецептивные поля могут быть проверены путем записи электрических сигналов от тела клетки (то есть сомы) сенсорных нейронов в пределах соответствующего брюшной ганглий в ЦНС. Таким образом, можно оценить чувствительность сенсорных окончаний, применяя различные степени силы на коже и карта рецептивные поля: легкое прикосновение, давление и вредных (болезненные) раздражители 20,21.
Преимущество этого препарата пиявки ганглий-кожи является то, что один CAн привлечь анатомически восприимчивой карты поля и проследить нейронные процессы с идентифицированным нейрона раз записываются электрические ответы. Три эксперименты пиявка, описанные ниже, могут быть завершены несколько раз с одного образца, что делает этот экономически эффективное модуль обучения для академических лабораториях.
Protocol
1. Подготовка электродов и солевого раствора
- Подготовка физиологический раствор и электроды прежде чем животное расчленена. Раствор Рингера пиявка состоит из следующих действий: 115,3 мМ NaCl, 1,8 мМ CaCl 2, 4,0 мМ KCl, 10 мМ Трис / малеиновой кислоты или HEPES. Отрегулируйте рН до 7,4.
- Подготовьте провод Ag-Cl погружением очищенный серебряной проволоки в небольшом количестве отбеливателя в течение 20 мин или до тех пор, пока проволока имеет гладкую темно-серый отделку. Вымойте провод дистиллированной водой перед использованием. Затем поместите провод в держатель пипетки, который подключается к усилителю.
- Подготовьте острый стеклянный электрод из боросиликатного стекла с помощью пипетки съемник. Сопротивление электрода должен быть порядка 20 МОм.
- Засыпка пипетки с 3 М растворе ацетата калия и вставьте его на в держатель пипетки.
- Для внеклеточного электрода подготовить резкое стеклянную пипетку, как описано выше, перерыв наконечник обратнопотирая еще один резкий пипетки около острым краем. Тогда огонь полировать кончик так, чтобы он не рвет связки. Пластиковые внеклеточные электроды также будет работать, пока есть хороший контакт между электродом и нерва.
- Вставьте внеклеточный записи электрод в держатель пипетки (с Ag-Cl проволоки), который оснащен резиновой трубки и шприца для всасывания. С помощью шприца, чтобы привлечь физиологический раствор в электрод по крайней мере на уровне серебряной проволоки.
- Настройка оборудования (усилителя и стимулом изолятор) и параметры записи программное обеспечение, следуя инструкции к конкретной единицы записи сигнала. Смотреть Leksrisawat др. 22., Чтобы просмотреть подробную информацию о оборудовании, используемых в экспериментах, описанных ниже.
2. Брюшной Ганглий Рассечение
- Проанализируйте пиявку в большом силиконового эластомера вдоль блюдо с раствором пиявки Рингера. Если животное растягивается в продольном направлении он будетлегче удалить брюшной нервной (см. рис 1А).
- С # 10 или # 11 размера скальпелем, сделать продольный разрез с очень мелкой сокращения вентральной срединной линии. О средней 2/3rd вентральной разреза показан на рисунке 1b. Старайтесь не прорезать черный чулок (вентральный синус крови), пока животное не будет полностью открыт, а синус крови растягивается без перегибов. Этот синус кровь проходит вдоль животного вдоль вентральной средней линии. VNC содержится внутри этого кровеносного сосуда.
- После того, как кожа была сокращена на всю длину животного использовать тонких ножниц радужной оболочки ник синус крови (рис. 2). Слип одно лезвие ножниц тонкие диафрагмы под пазухи и немного поднять лезвие, чтобы отделить его от нервной ткани. Вырезать пазухи длину VNC, избегая при этом нервные корешки, сегментные нервы, или связки между ганглиев.
- Затем удалите часть брюшной нервной путемрезки корни дистальных туда, где кровеносный сосуд присоединяется корни. Повторите эту процедуру для каждого ганглия по длине брюшной нервной.
- Передача сегмент одного или двух ганглиев в меньшей чашки Петри. Ганглии или один ганглий необходимо возлагали тугой с некоторым слабину.
- Pin связки и корни так ганглий глиальных оболочка слегка растягивается, чтобы предотвратить нейрон клеточных тел передвигаться, когда пронзая через глиальных оболочки и в нейрон интересов. Штыри должны быть помещены через черный синуса для корней и в середине двух связок, чтобы минимизировать повреждение аксонов (рис. 3).
- Поместите чашку Петри с подготовкой под микроскопом и закрепите его с воском на дно тарелки, чтобы предотвратить движение.
- Осторожно сфокусировать луч света с помощью зеркала и легкую конденсатор видеть нейроны как на фиг.4А (схематически показано на фиг.4В
- Чтобы отправить внутриклеточной регистрации в Rz, T, P, и N нейронов, осторожно поместите кончик электрода по ячейке интереса и осторожно опустите кончик до ямочка не видно в глиальных оболочкой.
- Нажмите на держатель электрода или манипулятор (очень осторожно) так, чтобы кончик электрода "поп" в клетку интересов.
- Введите короткие импульсы (30-40 мс) положительного тока (1-10 нА) в клетку, чтобы вызвать потенциал действия.
3. Культивирование Нейроны из брюшной ганглия Подготовка
- Прикрепите ганглиев брюшной стороне в чистую посуду, содержащего L-15 с эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) (рис. 3). Pin корни, так что ганглии слегка растягивается, как это сделано выше для внутриклеточных записей. С тонкой ножницы, ник глиальных капсула на одном конце, скольжения один ножницы лезвие под капсулой, а затем вырезать через глиальных капсулыкак показано на фиг.5А.
- Добавить 100 мкл аликвоты коллагеназы / диспаза к блюду и место на шейкере в течение 15 мин. Изучите клетки, перемещая питательных сред вокруг открытых клеточных тел. Вернуться на клетки шейкере в течение еще 15 мин или дольше, пока клетки не выйти с минимальными всасывания.
- Используйте пипетку, прикрепленный к шприцу, чтобы мягко извлечения клеток из ганглии. Своих полировать пипетки так, чтобы она слегка больше, чем диаметр тела клетки. Для Rz клеток в взрослом пиявки, диаметр должен быть примерно 50 мкм.
- Подготовьте разнообразные пипеток с разными диаметрами без нити накала, это уменьшает шансы на клетках торчащие внутри пипетки. Храните пипетки во флакон, содержащий 80% этанола (этанол) с помощью ватного шарика на дне для защиты советов от сколов. Не забудьте вымыть EtOH из пипетки со средой до аспирации клетки.
- После обработки фермента, промытьфермент-содержащие среду с L-15 (с ФТС) 2x. Определить клетки интерес и аккуратно нарисовать их в пипетку, потянув за шприц (рис. 6а). Разряд Аспирированную клетки в другом блюде, который содержит L-15 (с ФТС).
- До сих пор все процедуры не были нестерильные. Выполните следующие шаги в стерильных капот. Поместите 3-4 крупные капли стерильной L-15 (с FCS) в различных местах внутри стерильную чашку Петри.
- Внесите клетки в одном из до-упомянутых капель, дуя их вокруг в капле, чтобы вымыть их. Повторите это последовательно в 3 или 4 капли среды.
- Поместите клетки в чистом чашку Петри с L-15 (с ФТС).
- Инкубируйте клетки в течение 1-24 часов при комнатной температуре. После этого чистые клетки могут быть покрыты. Задержите клетки в течение нескольких часов или на ночь внеклеточный матрикс отрывается легко. Пластина клетки сразу генерировать длинные процессы.
- Используйте стерильную подложку для покрытия микропланшетным Д.И. ш и дайте ему полностью высохнуть (в течение ночи) до культивирования эксперименты.
- После того, как антенна была покрыта, мыть блюдо осторожно стерильной водой, а затем с небольшим количеством среды L-15. Не забывайте использовать решение L-15 без ФТС добавил, чтобы позволить клеткам прилипать к блюду. Носитель может быть слегка изменено на L-15 с FCS после того, как клетки приклеена к подложке. Если клетки должны быть использованы несколько часов после посева, а затем переключения носителя, с L-15 с FCS не является необходимым.
- Поместите клетки рядом друг с другом во время посева, чтобы вызвать быстрое синаптогенез (фиг.6В). После 24 часа в сутки меры физиологической активности в парах нейронов.
- Используйте внутриклеточные электрофизиологических методов для записи RP или синаптические реакции в культуре пар клеток (стимулирует 1 нейрон через внутриклеточных электродов и записи ответов в ходе парного клетки, используя вторую внутриклеточный электрод).
- Прикрепите пиявки спинной стороной вниз в эластомера вдоль блюдо, как описано выше.
- Pin кожу в одну сторону с корнями на другой стороне отрубленной ганглии (рис. 7а, увеличивается на фиг.7В) или сделать окно на вентральной части пиявки над ганглии (рис. 7С) со всеми корнями к телу стены нетронутыми.
- После получения стабильного внутриклеточного запись в одном из сенсорных клеток (Т, Р, N) использовать небольшой стеклянный стержень, который был Fire полированного чтобы они слегка касались кожи в том же сегменте. Если нейрон записывается от N является клетка затем большее давление будет необходимо наносить на кожу. В большинстве случаев, N клетка будет реагировать только если кожа зажат с помощью пинцета. По этой причине эти клетки должны быть пытались в прошлом, как можно повредить кожу или смещать внутриклеточный перекодирование, нарушая препарат в такой манере.
- Надо бытьспособны быстро эскиз кожу и ганглий с деталями достаточно достаточно, чтобы карта, где коснулась могут быть использованы для определения восприимчивой области для конкретного нейрона. После записи из многих Т и Р клеток, как это возможно на обеих сторонах ганглии попробовать N клеток.
- Для того чтобы исследовать, если сенсорные нейроны имеют процессы, которые проходят через связок в ростральной или хвостового образом, а затем из корней в смежном сегменте на кожу, связки между ганглиев можно вырезать и рецептивные поля пересмотрены в отношении распространение обнаружения. В основном один рассматривает, если имело любая потеря в рецептивного поля.
5. Потребители инъекционных флуоресцентных красителей
- Подготовьте пиявки ганглий, как описано выше.
- Наполните микроэлектрода раствором Lucifer желтый-CH (3,0%) и хлорида лития (300 мм).
- Прокалывание один из сенсорных клеток или Rz клеток на брюшной стороне ганглии, как описановыше.
- Введите краситель в клетку путем передачи отрицательный ток (3NA) через электрод в течение 15 мин. Установите длительность импульса до 100 мс и частоты 2 Гц.
- Визуализации нейронов красителя заполненные путем возбуждения красителя с ртутной лампы и фильтра набора FITC / GFP.
Representative Results
Внутриклеточные записи с сенсорных нейронов в пиявки ганглии характеризуются их различных напряжение времени следов, показанных на фиг.4С. Отдыхает клеточной мембраны потенциал у здоровых пиявка ганглиозных клеток является -45 до -60 мВ. Если потенциалы меньше (менее отрицательным) следует изменить стеклянный электрод, или, если потенциал все еще остается низким, перейти на другой сегмент нервной цепочки. Спонтанные потенциалы действия с малой амплитудой может означать, что электрод находится в двигательных нейронов. В этом случае в стенке ганглий тела тока инжекции могут быть использованы для определения, если нейрон иннервирует любой из мышц все еще прикрепленные к коже. Кольцевое пространство монтажник двигательных нейронов (AE) находится на брюшной стороне ганглии (рис. 4В), и это приведет к тому, колец (хребты или сегментов), чтобы подняться, активизируя кольцо монтажник мышцы.
Потребители инъекционных тока в сенсорных клеток должны вызывать потенциал действияс при характерных сигналов, показанных на фиг.4С. Если сигналы выглядят по-разному это может быть связано с несбалансированным моста или компенсации смещения емкости. Следует обратиться к руководству, которое сопровождает блок сбора сигналом для подробной информации о том, как сбалансировать мост внутри клетки. Обратите внимание, артефакты стимула в начале и в конце импульсов тока на фиг.4С. Это, как артефакты выглядеть, когда мост сбалансирован.
Первичные культуры нейронов от пиявки ганглии образуют электрические и химические синапсы в блюдо. Первоначально электрические свойства культивируемых клеток не совсем такой же, как они находятся в естественных условиях. Однако через несколько дней импульсы почти неотличимы от тех, которые записаны в ганглии. Это показано на рисунке 6C с парой Rz клеток. Через 7 ч в культуре амплитуда синаптических потенциалов 1-2 мВ. После 56 часов в культуральной сиnaptic потенциалы были больше, чем 10 мВ (топ следы в фиг.6С). Форма потенциала действия также изменяется после 56hr в культуре. При описанных условиях эти клетки являются жизнеспособными в течение нескольких дней.
Межклеточной коммуникации может быть продемонстрирована путем стимулирования нервных корешков или связок и записи с нейронами в ганглии. Стимулирование эти нервы генерирует надежные синаптические потенциалы и потенциалы действия в различных ганглиозных клеток. Следы на рисунке 8B были записаны из клетки Retzius в ганглии, которая была удалена от животного и закрепленные в блюдо. Черный след была вызвана подпороговой стимулом, который распространяется с внеклеточного электрода к связки. Увеличение напряжения стимул вызвал ячейку стрелять потенциал действия (красный след). Флуоресцентные красители или пероксидазой хрена может быть введен в этих клетках для изучения их морфологии. Люцифер желтый вводили в Rzнейрон пропусканием тока через отрицательный электрод. В качестве альтернативы можно вводить краситель с помощью затяжек давления воздуха. 9А показывает краситель вскоре после начала инъекции. Тридцать минут спустя краситель уже был рассеянный в нервных корешков (рис. 9B). Тип красителя зависит от приложения, например небольшие красители молекулярной массой, которые могут проходить через щелевые контакты используются для идентификации электрических синапсов.
Рисунок 1. . Брюшной пиявка рассечение (А) Животное тщательно возлагали брюшной стороне в эластомера вдоль блюдо, наполненный пиявки физиологического раствора (В) мелкой разрез охватывающих переднюю:. Задняя ось сделана только сбоку от средней линии, чтобы не повредить нерв шнур. Черная пазухи крови (который содернс брюшной нервной) можно легко увидеть. Обратите внимание на одной открытой ганглий, который белый по сравнению с оболочкой. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Рассечение черной пазухи. Кровеносного сосуда (стрелка) следует аккуратно вырезать на одной стороне, чтобы разоблачить брюшной нервной (двойной стрелкой). Оставьте сегменты кровеносного сосуда нетронутыми вокруг сегментных корней для использования в качестве ручки, чтобы манипулировать брюшной нервной при передаче между вскрытия и записи блюд. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Изолированный участок брюшной нервной. Закрепление брюшной нервной осколками кровеносных сосудов, оставшиеся на сегментарных корней и на концах сегментарных связок выставляет ганглии для электрофизиологических записей. Тугой растяжение ганглиев позволяет увидеть идентифицируемые тела клетки и позволит легче проникновение глиальных оболочки с резким стеклянного электрода. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Сотовый анатомия пиявки ганглии. (A) В идеале клетки Retzius (R) и другие крупные органы клеток (P-прессЮр, T-Touch, N-ноцицептивная, AE-кольцо монтажник) будут четко видны, если микроскоп и свет конденсатор настроены должным образом. (Б) Схематическое изображение клеток в ганглии. Незначительные различия в расположении РРОС будет происходить в каждой ганглии из-за того, как ганглий растягивается и возлагали подтянутой. (С) Потенциалы действия, записанные от сомы этих нейронов имеют характерные сигналы. Эти шипы были вызвала путем введения положительный ток в клеточную (прямоугольного импульса, наложенными на напряжение времени следы). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 5. Desheathing ганглия удалять отдельные органы клеток. (А) глиальных оболочкадолжны быть тщательно вырезать через ганглий, чтобы не повредить клетки интерес. Красная линия указывает разрез, чтобы избежать удара сому нейронов Rz. Открывая оболочку дает пищеварительных ферментов доступ к матрице соединительной ткани. (В) Здоровые органы сотовые выпуклые из ганглия после глиальных оболочка была открыта. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 6. Культивирование нейроны от пиявки ганглия. (A) Клетки отсасывали из ганглия с помощью микропипетки и переносили в чашку, содержащую питательные среды. (B) Размещение нескольких ячеек около друг друга будет увеличивать скорость синаптогенеза между идентифицируемых нейронов. Здесь стум из двух нейронов сформировали синапс. (С) Нейроны в культуральной выставке немного различные электрические свойства. Верхние следы показывают синаптические потенциалов, вызванных стимулирования смежную ячейку 7 ч и 56 ч после того как клетки высевали. Нижние следы вызывали путем введения ток непосредственно в одной из ячеек Rz. Обратите внимание на увеличение синаптической амплитуды потенциала и изменить в потенциала действия сигнала после 56 ч в культуре. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 7. Ганглий тела подготовка стены пиявка для отображения рецептивных полей. (А) Один из подходов заключается в удалении целый раздел стенки тела вместе с 1-3 ганглиев. Здесь корни с одной стороны есть бвырезать ееп и ганглий был прижат в стороны. (В) возлагали из ганглий при большем увеличении. (С) Другой подход заключается в создании небольшое окно в стенке тела и записи из неповрежденной ганглиев в то время отображения рецептивное поле . (DG) Каждый из сенсорных нейронов показывает характерный ответ на механической стимул. (D) легкое прикосновение вызывает активность в Т-клетках, но не в Р или N клеток. (Е) Т-клеточный ответ выключается в ответ на сильнее стимулы, уступив активации P клетки. Как стимул крепнет п ячеек становится активирован (FG). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Figurе 8. вызванной активности в пиявки ганглия. внеклеточной стимуляции связок может быть использован для синаптическую передачу в нервной цепочки. (A) Это делается путем присоединения всасывающего электрода к одной из связок и применение малого напряжения. Резкое стеклянный электрод (стрелка) можно увидеть пронзая ячейку Retzius в ганглии. (В) Напряжение времени следы показывающие стимул артефакт, за которым следует синаптической потенциального (черный) и потенциал действия (красного цвета). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 9. Инъекционных красителя в пиявки нейронов. (А) Люцифер желтый может быть введен в сомы, передав ток беспересадочныйтьфу запись микроэлектрод. Ртутная лампа и FITC фильтр множество, то может быть использован для визуализации флуоресценции. (В) краситель диффундирует в Rz аксоны около 30 минут после инъекции. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Discussion
Цель этой серии экспериментов было 1) учить и демонстрировать основные принципы внутриклеточных записей из идентифицируемых нейронов и 2) признать характерные формы электрических сигналов, которые могут возникнуть в связи с этим конкретным типов нейронов с помощью взрослых пиявок. Существует богатая история исследований с помощью пиявки для нейрофизиологических исследований и исследования продолжаются в решение вопросов нейронной схемы и регуляции генов во время развития, а также во время синаптической восстановления и регенерации 10. Нейромодуляция, в частности через биогенных аминов путей, также был успешным направлением исследований в пиявки. Добавляя допамин и другие фармакологические препараты для нервной системы через солевой раствор, было показано, что дофамин модулирует нейронных сетей, участвующих в процессе принятия решений 23 и шаблоны моторные для обхода поведение 24,25. Этот экспериментальный подход является простофиляле (и недорогой) способ включить модуляцию в преподавательской лаборатории, и корректировки ионной состав солевого раствора является эффективным способом, чтобы научить уравнений Нернста и Goldman-Ходжкина-Кац.
Чтобы быть успешным с ганглиозных препаратов важно иметь ганглий тугой до попытки ткнуть сому с внутриклеточным электродом. В противном случае сома будет двигаться, когда нажав на глиальных пакета. Кроме того, при desheathing ганглия для удаления нейронов для культуры, избежать область интереса при резке через ганглий так Somas не повреждены, поскольку они не будут удалены. Кроме того, чрезмерное инкубации в ферментов может привести к нейроны слишком хрупкими быть удалены. Это требует некоторых проб и ошибок достичь идеального времени инкубации потому что каждая серия ферментов немного отличается в своих действиях.
Дальнейшие исследования для оптимизации питательных сред может улучшить эту технику. ВариOUS факторы, такие как присутствие инсулина, сахара, или факторов роста, могут быть рассмотрены в течение более длительного поддержания культур. Чтобы определить, клетки поддерживать свою способность к синтезу передатчиков, таких как синтез серотонина в клетках Rz, нейтральный красный окрашивание может быть применен для обозначения серотонинергические процессы. Также микроглии вторжение в травмированной и регенерации ткани может быть количественно ядерные пятна дней после травмы.
Хотя этот препарат имеет много преимуществ, чтобы предложить в изучении регенерации и ремонт, а также нервной схемы, фармакологический и молекулярная идентификация различных подтипов рецепторов в синапсах не были полностью охарактеризованы. Выразил последовательность библиотеки тегов доступно 26, и медицинской пиявки генома в настоящее время собраны 27, но основным ограничением в пиявки по сравнению с некоторыми модельных препаратов является возможность изменять геном для селективных генов в специфические типы клеток. В эмбрионов тего ограничение было решить путем введения ДНК или дсРНК регулировать экспрессию генов 28. Техника пистолет ген был недавно используется для выражения беспозвоночных коннексин (innexin) белков в пиявки нейронов. Экспрессия innexin от Hirudo verbana (Hve-inx6) является достаточным для формирования внематочной щелевых соединений в медицинской пиявки 29. Медицинской пиявки или H. вербена как бы 30, несомненно, продвижения нашего понимания физиологии и эволюции электрических синапсов в течение ближайших нескольких лет.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B.
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B.
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
