В этой статье описываются три нервные препараты системные помощью пиявок: внутриклеточный запись из нейронов в вентральной ганглиев, культивирование нейроны от брюшной ганглиях, а записи с пятачке иннервируемой кожи к карте сенсорные поля.
Пресноводных пиявка, Hirudo MEDICINALIS, является универсальным модельным организмом, который был использован для решения научных вопросов в области нейрофизиологии, нейроэтологии и биологии развития. Цель этого доклада заключается в консолидации экспериментальные методы из системы пиявки в одну статью, которая будет полезна для физиологов, имеющих опыт в других нервных препаратов системы, или биологии студентов с небольшим опытом или вообще электрофизиологии. Мы показываем, как препарировать пиявку для записи внутри клетки от выявленных нейронных цепей в ганглии. Далее показано, как отдельные клетки из известной функции могут быть удалены из ганглия быть культивировали в чашке Петри, и как записывать из этих нейронов в культуре. Тогда мы показали, как подготовить участок иннервируемой кожи, которые будут использоваться для отображения сенсорных или моторных полей. Эти пиявки препараты по-прежнему широко используется для решения основных электрических свойств нервной Networкс, поведение, синапсов и развитие. Они также соответствующий учебный модуль для нейронауки или физиологии учебных лабораторий.
Подготовка пиявка полезен для изучения функцию идентификационной (сенсорные, моторные и взаимодействий нейронов внутри животного центральной нервной системы (ЦНС). Полезное свойство пиявок нейронов является то, что форма их потенциалов действия и биофизических свойств характерны для Данный тип клеток (т.е. P, N, T, Rz). Более того нейроны могут быть удалены из животного и культивируют в подходящей среде, в которой клетки поддерживать свои электрические характеристики тех пор, пока 45 дней 1,2.
Явное преимущество пиявки ганглии для обучения, как сделать электрофизиологические записи является то, что клетки характерно и надежно расположены в ганглии в шаблон, который позволяет идентифицировать отдельных типов клеток от ганглия до ганглии и от животного к животному. Уникальное расположение и морфология нейронов в ганглиях пиявки были отмечены Retzius еще в 1891 3. Знание гое идентичность и функция нейрона является выгодным для исследования нейронных цепей и для проведения экспериментов с заданным типом клеток. Из-за относительно большой somata нейронов в пределах ганглия они видны с препаративным микроскопом, и somata может быть селективно наколотой с микроэлектродов для записи их электрические свойства.
Красители и большие молекулы могут быть введены в отдельные клетки и свойств канала, изученных патч зажима. Ионные токи, которые приводят к различным формам характерных потенциалов действия в различных нейронах были определены 4-7. Из исследований в структуре иннервации и разветвленности отдельных нейронов в ЦНС, синаптические соединения были воспроизведены в культуре с определенных нейронов 2,8. Исследования, проведенные в пиявки ганглиев обеспечили понимание развития функциональных схем, которые могут быть измерены с электрофизиологических а также с Wholэ поведение животных исследования. Пиявка ЦНС также служил в качестве ценного препарата для исследования механизмов, участвующих с нейронной ремонта и регенерации в целое животное и в культуре 4-6,9-12.
В мозгах млекопитающих это сложная задача, чтобы объяснить поведение в терминах свойств и связей отдельных, определенных нейронов. В принципе можно надеяться, что изучение менее сложных систем, таких как пиявки могут помочь определить основные механизмы, используемые в высших животных. Соединения, которые используются, лежащие в основе у кромки образец 13,14 и ритмичность сердца 15 были хорошо охарактеризованы в пиявки. Способность некоторых пиявки нейронов, чтобы сформировать как электрические и химические связи интригует. Некоторые соединения двунаправленный то время как другие являются однонаправленными химически но двунаправленный электрически 7. Понимание синаптических связей в рамках животного, а также воссоздания же Typэ соединений в культуре блюдо являются мощными инструментами для исследования синаптогенез 16-18, а также фармакологическое профилирование синапсов 19. Внутриклеточные методы записи и стимуляции, описанные здесь, обеспечивают основу для фармакологических анализов и исследований в нейроэтологии и развития.
Кроме того, сегментарный брюшная нервная цепь можно разрезать с пятачке иннервируемой кожи. С возможностью, чтобы сохранить участок кожи и нейроны в живых, сенсорные рецептивные поля могут быть проверены путем записи электрических сигналов от тела клетки (то есть сомы) сенсорных нейронов в пределах соответствующего брюшной ганглий в ЦНС. Таким образом, можно оценить чувствительность сенсорных окончаний, применяя различные степени силы на коже и карта рецептивные поля: легкое прикосновение, давление и вредных (болезненные) раздражители 20,21.
Преимущество этого препарата пиявки ганглий-кожи является то, что один CAн привлечь анатомически восприимчивой карты поля и проследить нейронные процессы с идентифицированным нейрона раз записываются электрические ответы. Три эксперименты пиявка, описанные ниже, могут быть завершены несколько раз с одного образца, что делает этот экономически эффективное модуль обучения для академических лабораториях.
Цель этой серии экспериментов было 1) учить и демонстрировать основные принципы внутриклеточных записей из идентифицируемых нейронов и 2) признать характерные формы электрических сигналов, которые могут возникнуть в связи с этим конкретным типов нейронов с помощью взрослых пиявок. Существует богатая история исследований с помощью пиявки для нейрофизиологических исследований и исследования продолжаются в решение вопросов нейронной схемы и регуляции генов во время развития, а также во время синаптической восстановления и регенерации 10. Нейромодуляция, в частности через биогенных аминов путей, также был успешным направлением исследований в пиявки. Добавляя допамин и другие фармакологические препараты для нервной системы через солевой раствор, было показано, что дофамин модулирует нейронных сетей, участвующих в процессе принятия решений 23 и шаблоны моторные для обхода поведение 24,25. Этот экспериментальный подход является простофиляле (и недорогой) способ включить модуляцию в преподавательской лаборатории, и корректировки ионной состав солевого раствора является эффективным способом, чтобы научить уравнений Нернста и Goldman-Ходжкина-Кац.
Чтобы быть успешным с ганглиозных препаратов важно иметь ганглий тугой до попытки ткнуть сому с внутриклеточным электродом. В противном случае сома будет двигаться, когда нажав на глиальных пакета. Кроме того, при desheathing ганглия для удаления нейронов для культуры, избежать область интереса при резке через ганглий так Somas не повреждены, поскольку они не будут удалены. Кроме того, чрезмерное инкубации в ферментов может привести к нейроны слишком хрупкими быть удалены. Это требует некоторых проб и ошибок достичь идеального времени инкубации потому что каждая серия ферментов немного отличается в своих действиях.
Дальнейшие исследования для оптимизации питательных сред может улучшить эту технику. ВариOUS факторы, такие как присутствие инсулина, сахара, или факторов роста, могут быть рассмотрены в течение более длительного поддержания культур. Чтобы определить, клетки поддерживать свою способность к синтезу передатчиков, таких как синтез серотонина в клетках Rz, нейтральный красный окрашивание может быть применен для обозначения серотонинергические процессы. Также микроглии вторжение в травмированной и регенерации ткани может быть количественно ядерные пятна дней после травмы.
Хотя этот препарат имеет много преимуществ, чтобы предложить в изучении регенерации и ремонт, а также нервной схемы, фармакологический и молекулярная идентификация различных подтипов рецепторов в синапсах не были полностью охарактеризованы. Выразил последовательность библиотеки тегов доступно 26, и медицинской пиявки генома в настоящее время собраны 27, но основным ограничением в пиявки по сравнению с некоторыми модельных препаратов является возможность изменять геном для селективных генов в специфические типы клеток. В эмбрионов тего ограничение было решить путем введения ДНК или дсРНК регулировать экспрессию генов 28. Техника пистолет ген был недавно используется для выражения беспозвоночных коннексин (innexin) белков в пиявки нейронов. Экспрессия innexin от Hirudo verbana (Hve-inx6) является достаточным для формирования внематочной щелевых соединений в медицинской пиявки 29. Медицинской пиявки или H. вербена как бы 30, несомненно, продвижения нашего понимания физиологии и эволюции электрических синапсов в течение ближайших нескольких лет.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |