Este artigo descreve três preparações do sistema nervoso usando sanguessugas: gravação intracelular de neurônios no gânglio ventral, cultivando neurônios do gânglio ventral, e gravar a partir de um pedaço de pele inervados para mapear campos sensoriais.
A sanguessuga de água doce, Hirudo medicinalis, é um organismo modelo versátil, que tem sido usado para tratar de questões científicas nos campos da neurofisiologia, neuroethology e biologia do desenvolvimento. O objetivo deste relatório é o de consolidar técnicas experimentais do sistema de sanguessuga em um único artigo que será de utilidade para os fisiologistas, com experiência em outras preparações do sistema nervoso, ou para estudantes de biologia, com pouca ou nenhuma experiência em eletrofisiologia. Demonstramos como dissecar a sanguessuga para gravação intracelular de circuitos neurais identificados no gânglio. A seguir, mostram como as células individuais de função conhecida pode ser removido a partir do gânglio a ser cultivadas numa placa de Petri, e como gravar a partir desses neurónios em cultura. Então nós demonstrar como preparar um pedaço de pele inervada a ser utilizado para o mapeamento de campos sensoriais ou motoras. Estas preparações sanguessuga ainda são amplamente utilizados para tratar as propriedades elétricas básicas de networ neuralks, comportamento, sinaptogênese e desenvolvimento. Eles também são um módulo de formação adequada para a neurociência ou fisiologia laboratórios de ensino.
A preparação sanguessuga é útil para investigar a função de identificação (sensorial, motora e inter-neurónios no sistema nervoso central do animal (CNS). A propriedade útil dos neurónios sanguessuga é que a forma dos seus potenciais de acção e propriedades biofísicas são característicos para uma determinado tipo de célula (isto é, P, N, T, Rz). neurónios Além disso pode ser removido a partir do animal e cultivadas num meio adequado, no qual as células de manter as suas características eléctricas durante o tempo até 45 dias 1,2.
A vantagem do gânglio sanguessuga para aprender a fazer gravações eletrofisiológicas é que as células são caracteristicamente e confiável dispostos no gânglio em um padrão que permite a identificação de tipos de células distintas do gânglio para gânglio e de animal para animal. A localização única e morfologia de neurônios em sanguessuga gânglios foram anotados por Retzius já em 1891 3. Conhecimento do the a identidade e função de um neurónio é vantajoso para investigar circuitos neurais e para fazer experiências com um determinado tipo de célula. Devido à relativamente grande somata dos neurónios dentro de um gânglio serem visíveis com um microscópio de dissecação, e a somata pode ser empalado selectivamente com microeléctrodos para gravar as suas propriedades eléctricas.
Corantes e moléculas grandes podem ser injectados em células individuais e as propriedades do canal estudados por sujeição do emplastro. Correntes iónicas que dão origem às várias formas dos potenciais de acção característicos em diferentes neurónios foram identificadas 4-7. A partir de investigações no padrão de inervação e ramificações dos neurônios individuais dentro do CNS, as conexões sinápticas foram reproduzidas em cultura com os neurônios identificados 2,8. Os estudos em gânglios da sanguessuga forneceram uma visão sobre o desenvolvimento de circuitos funcionais que pode ser medido com a electrofisiologia, bem como com cordãe estudos do comportamento animal. A sanguessuga CNS também serviu como uma preparação valiosa para a investigação de mecanismos envolvidos com a reparação e regeneração neuronal em todo o animal e na cultura 4-6,9-12.
Em cérebros de mamíferos é uma tarefa difícil para explicar o comportamento em termos de propriedades e conexões de neurônios identificados individuais. Em princípio, pode-se esperar que o estudo de sistemas menos complexos, como a sanguessuga pode ajudar a definir mecanismos básicos usados em animais superiores. As ligações que são usados que sustentam um padrão de mergulho e 13,14 ritmicidade do coração 15, têm sido bem caracterizadas na sanguessuga. A capacidade de alguns neurônios sanguessuga para formar tanto a comunicação elétrica e química é intrigante. Algumas conexões são bidirecionais, enquanto outras são unidirecionais quimicamente, mas bidirecional eletricamente 7. Compreender as conexões sinápticas dentro do animal, bem como a recriação da mesma type de conexões em um prato de cultura são ferramentas poderosas para investigar synaptogenesis 16-18, bem como perfis farmacológico das sinapses 19. As técnicas de gravação e de estimulação intracelulares descritos aqui fornecer uma base para ensaios farmacológicos e pesquisas em neuroethology e desenvolvimento.
Além disso, o cordão nervoso ventral segmentar pode ser dissecada com um pedaço de pele inervados. Com a capacidade de manter um pedaço de pele e os neurônios vivos, campos receptivos sensoriais podem ser sondado por gravar os sinais elétricos do corpo celular (ou seja, soma) de neurônios sensoriais no respectivo gânglio abdominal no SNC. Deste modo, pode-se avaliar a sensibilidade das terminações sensoriais, aplicando diferentes graus de força sobre a pele e mapear campos receptivos: leve toque, pressão, e nocivos (doloroso) estímulos 20,21.
Uma vantagem desta sanguessuga preparação gânglio-da pele é que um can desenhar anatomicamente o mapa do campo receptivo e traçar os processos neuronais para o neurônio identificado uma vez que as respostas elétricas estão sendo gravados. As três experiências sanguessuga descritos abaixo podem ser completado várias vezes com um único espécime, o que torna este um módulo de ensino de baixo custo para laboratórios acadêmicos.
O objectivo deste conjunto de experimentos foi de 1) para ensinar e expor os princípios fundamentais de gravações intracelular de neurônios identificáveis e 2) a reconhecer as formas características de sinais elétricos que podem surgir a partir desses tipos de neurônios específicos usando sanguessugas adultos. Há uma rica história de investigações usando o sanguessuga para investigações neurofisiológicas e investigação está em curso para abordar questões de circuitos neurais e regulação de genes durante o desenvolvimento, bem como durante a reparação e regeneração sináptica 10. Neuromodulação, principalmente através de vias de aminas biogênicas, também tem sido uma direção da investigação, de sanguessuga. Pela adição de dopamina e outros agentes farmacológicos para o sistema nervoso através da solução salina, foi demonstrado que a dopamina modula redes neurais envolvidos em 23 e os padrões motores para rastrear 24,25 comportamento de tomada de decisão. Esta abordagem experimental é uma simple (e barata) maneira de incorporar a modulação para o laboratório de ensino, e ajustando a composição iônica da solução salina é uma forma eficaz de ensinar as equações de Nernst e Goldman-Hodgkin-Katz.
Para serem bem sucedidas com as preparações ganglionares é importante para que o gânglio tenso antes de tentar a picar uma soma com um eléctrodo intracelular. Caso contrário, a soma vai passar quando empurrando para baixo o pacote glial. Além disso, quando o gânglio desheathing para a remoção de neurónios por cultura, evitar a região de interesse, quando o corte através do gânglio assim somas não são danificadas à medida que são removidos. Além disso, a incubação excessiva nas enzimas podem resultar nos neurónios ser demasiado frágil para ser removido. Ele requer alguma tentativa e erro para obter um tempo de incubação ideal porque cada lote de enzimas é ligeiramente diferente nas suas acções.
Outras investigações para otimizar meios de cultura poderia melhorar esta técnica. Various factores, tais como a presença de insulina, de açúcares, ou factores de crescimento, pode ser examinada por um período de manutenção de culturas. Para determinar se as células a manter a sua capacidade de síntese de transmissores, tais como a síntese de serotonina em células Rz, de coloração de vermelho neutro pode ser aplicado para identificar processos serotonérgicos. Também a invasão da microglia tecido lesionado e regeneração pode ser quantificado por manchas nucleares dias após uma lesão.
Embora esta preparação tem muitos benefícios a oferecer ao examinar a regeneração e reparação, bem como circuitos neurais, a identificação farmacológica e molecular dos vários subtipos de receptores nas sinapses não foram totalmente caracterizados. Uma biblioteca de tag seqüência expressa está disponível 26, e do genoma sanguessuga medicinal está sendo montado 27, mas a principal limitação na sanguessuga em comparação com alguns preparativos modelo é a capacidade de modificar o genoma de genes seletivos em tipos específicos de células. Em embriões tsua limitação foi abordada pela injeção de DNA ou dsRNA para regular a expressão do gene 28. A técnica arma gene foi recentemente usada para expressar conexina invertebrados (innexin) proteínas em neurônios sanguessuga. Expressão de uma innexin de Hirudo verbana (Hve-inx6) é suficiente para a formação de junções de hiato ectópica no sanguessuga medicinal 29. A sanguessuga medicinal ou H. verbena como se fosse 30 é certo para avançar nossa compreensão da fisiologia e evolução de sinapses elétricas ao longo dos próximos anos.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |