Este artículo describe tres preparaciones del sistema nervioso usando sanguijuelas: registro intracelular de las neuronas en los ganglios ventrales, el cultivo de neuronas de los ganglios ventrales, y grabe de un parche de piel inervada asignar campos sensoriales.
La sanguijuela de agua dulce, Hirudo medicinalis, es un organismo modelo versátil que se ha utilizado para tratar las cuestiones científicas en el campo de la neurofisiología, neuroetología y la biología del desarrollo. El objetivo de este informe es la consolidación de las técnicas experimentales del sistema de sanguijuela en un solo artículo que será de utilidad para los fisiólogos, con experiencia en otras preparaciones del sistema nervioso, o para estudiantes de biología, con poca o ninguna experiencia en electrofisiología. Demostramos cómo diseccionar la sanguijuela para el registro de manera intracelular de los circuitos neuronales identificadas en el ganglio. Siguiente mostramos cómo las células individuales de función conocida se pueden quitar del ganglio a ser cultivadas en una placa de Petri, y cómo grabar desde esas neuronas en cultivo. A continuación mostramos cómo preparar un parche de piel inervada que se utilizará para el mapeo de campos sensoriales o motoras. Estas preparaciones sanguijuela siguen siendo ampliamente utilizados para hacer frente a las propiedades eléctricas básicas de Networ neuralks, el comportamiento, la sinaptogénesis, y el desarrollo. Son también un módulo de capacitación apropiados para la neurociencia o la fisiología laboratorios docentes.
La preparación de sanguijuela es útil para la investigación de la función de identificación (sensoriales, motoras y inter-neuronas dentro del sistema nervioso central de los animales (SNC). La propiedad útil de las neuronas de sanguijuela es que la forma de sus potenciales de acción y propiedades biofísicas son característicos de un dado tipo de célula (es decir, P, N, T, Rz). neuronas Por otra parte se pueden quitar del animal y se cultivaron en un medio adecuado en el que las células mantienen sus características eléctricas durante tanto tiempo como 45 días 1,2.
Una clara ventaja del ganglio sanguijuela para el aprendizaje de cómo hacer grabaciones electrofisiológicas es que las células son característicamente y fiable dispuestos en el ganglio en un patrón que permite la identificación de distintos tipos de células de ganglio a ganglio y de animal a animal. La ubicación única y la morfología de las neuronas en los ganglios sanguijuela tomó nota de Retzius ya en 1891 3. Conocimiento de the identidad y la función de una neurona es ventajoso para la investigación de los circuitos neuronales y para la fabricación de experimentos con un tipo de célula dado. Debido a la relativamente grande cuerpos celulares de las neuronas dentro de un ganglio que son visibles con un microscopio de disección, y la somata pueden ser empalados selectivamente con microelectrodos para registrar sus propiedades eléctricas.
Colorantes y grandes moléculas se pueden inyectar en células individuales y las propiedades del canal estudiados por patch clamp. Corrientes iónicas que dan lugar a las diversas formas de los potenciales de acción característicos en diferentes neuronas se han identificado 4-7. De las investigaciones en el patrón de inervación y la ramificación de las neuronas individuales dentro del sistema nervioso central, las conexiones sinápticas se han reproducido en la cultura con las neuronas identificadas 2,8. Los estudios en los ganglios sanguijuela han proporcionado información sobre el desarrollo de los circuitos funcionales que se puede medir con la electrofisiología, así como con al poe el comportamiento animal estudios. La sanguijuela CNS también ha servido como una valiosa preparación para la investigación de los mecanismos involucrados en la reparación y regeneración neuronal en todo el animal y en la cultura 4-6,9-12.
En los cerebros de mamíferos, es una tarea de enormes proporciones para explicar el comportamiento en términos de las propiedades y las conexiones de las neuronas identificadas individuales. En principio se puede esperar que el estudio de sistemas menos complejos, como la sanguijuela podría ayudar a definir los mecanismos básicos que se utilizan en los animales superiores. Las conexiones que se utilizan que subyacen a un patrón de natación 13,14 y ritmicidad del corazón 15 han sido bien caracterizados en la baluma. La capacidad de algunas neuronas de sanguijuela para formar tanto la comunicación eléctrica y química es intrigante. Algunas conexiones son bidireccionales, mientras que otras son unidireccionales químicamente pero bidireccional eléctricamente 7. La comprensión de las conexiones sinápticas en el animal, así como la recreación de la misma type de las conexiones en una placa de cultivo son herramientas poderosas para la investigación de la sinaptogénesis 16-18, así como los perfiles farmacológicos de sinapsis 19. Las técnicas de registro y estimulación intracelular aquí descritos proporcionan una base para los ensayos farmacológicos y la investigación en neuroetología y desarrollo.
Además, el cable de segmentaria nervioso ventral puede ser diseccionado con un parche de piel inervada. Con la capacidad de mantener un parche de piel y las neuronas vivas, campos receptores sensoriales se puede probar mediante el registro de las señales eléctricas desde el cuerpo celular (es decir, soma) de las neuronas sensoriales dentro respectiva ganglio abdominal en el SNC. De esta manera se puede evaluar la sensibilidad de las terminaciones sensoriales mediante la aplicación de diversos grados de fuerza en la piel y asignar campos receptivos: ligero toque, presión y nociva (dolorosa) estímulos 20,21.
Una ventaja de esta preparación ganglio-piel sanguijuela es que uno CAn dibujar anatómicamente el mapa de campo receptivo y rastrear los procesos neuronales de las neuronas identificadas vez se están grabando las respuestas eléctricas. Los tres experimentos sanguijuela se describen a continuación pueden ser completados en múltiples ocasiones con un solo ejemplar, que hace de este un módulo de enseñanza rentable para los laboratorios académicos.
El propósito de esta serie de experimentos fue de 1) para enseñar y exponer los principios fundamentales de registros intracelulares de las neuronas identificables y 2) reconocer las formas características de las señales eléctricas que pueden surgir de estos tipos neuronales particulares utilizando sanguijuelas adultas. Hay una rica historia de las investigaciones utilizando la sanguijuela para las investigaciones neurofisiológicas y la investigación está en curso para hacer frente a las cuestiones de los circuitos neuronales y la regulación génica durante el desarrollo, así como durante la reparación y regeneración 10 sináptica. La neuromodulación, en particular a través de vías de aminas biógenas, también ha sido una línea de investigación con éxito en la sanguijuela. Mediante la adición de dopamina y otros agentes farmacológicos en el sistema nervioso a través de la solución salina, se ha demostrado que la dopamina modula redes neuronales implicados en la toma de decisiones 23 y los patrones de motor para el rastreo comportamiento 24,25. Este enfoque experimental es un simple (y barata) manera de incorporar la modulación en el laboratorio de enseñanza, y el ajuste de la composición iónica de la solución salina es una manera efectiva de enseñar a las ecuaciones Nernst y Goldman-Hodgkin-Katz.
Para tener éxito con las preparaciones ganglionares que es importante contar con el ganglio tenso antes de tratar de meter un soma con un electrodo intracelular. De lo contrario, el soma se moverá al ejercer presión sobre el paquete glial. Además, cuando desheathing el ganglio para la eliminación de las neuronas para el cultivo, evitar la región de interés al cortar a través del ganglio somas de modo no están dañados, ya que se eliminan. Además, la incubación excesiva en las enzimas puede resultar en las neuronas ser demasiado frágiles para ser eliminado. Se requiere un poco de ensayo y error para lograr un momento ideal de incubación, ya que cada lote de enzimas es ligeramente diferente en sus acciones.
Más investigación para optimizar los medios de cultivo podría mejorar esta técnica. VariOUS factores, tales como la presencia de insulina, azúcares, o factores de crecimiento podrían ser examinados por más tiempo el mantenimiento de cultivos. Para determinar si las células mantienen su capacidad de sintetizar transmisores, tales como la síntesis de serotonina en las células Rz, tinción de rojo neutro se puede aplicar a etiquetar procesos serotoninérgicos. Invasión También microglial al tejido lesionado y la regeneración se puede cuantificar por manchas nucleares días después de una lesión.
Aunque esta preparación tiene muchos beneficios para ofrecer en el examen de la regeneración y reparación, así como los circuitos neuronales, la identificación farmacológica y molecular de los diversos subtipos de receptores en las sinapsis no se han caracterizado completamente. Una biblioteca de etiquetas de secuencia expresada está disponible 26, y el genoma sanguijuela medicinal está siendo ensamblado actualmente 27, pero la principal limitación en la sanguijuela en comparación con algunas preparaciones modelo es la capacidad de modificar el genoma de los genes selectivos en tipos de células específicos. En embriones tsu limitación se ha abordado mediante la inyección de ADN o ARN de doble cadena para regular la expresión del gen 28. La técnica de pistola génica se ha utilizado recientemente para expresar conexina invertebrados (innexin) las proteínas en las neuronas de sanguijuela. Expresión de un innexin de Hirudo verbana (Hve-inx6) es suficiente para la formación de uniones intercelulares ectópicos en la sanguijuela medicinal 29. La sanguijuela-o medicinal H. verbena por así decirlo 30 es seguro para avanzar en nuestra comprensión de la fisiología y la evolución de las sinapsis eléctricas en los próximos años.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |