Summary
Dit artikel beschrijft drie zenuwstelsel bereidingen met behulp van bloedzuigers: intracellulaire opname van neuronen in ventrale ganglia, het kweken neuronen van ventrale ganglia, en het opnemen van een patch van geïnnerveerde huid sensorische gebieden in kaart.
Abstract
De zoetwater bloedzuiger, Hirudo medicinalis, is een veelzijdig model organisme dat is gebruikt om wetenschappelijke vragen op het gebied van neurofysiologie, neuroethology en ontwikkelingsbiologie te pakken. Het doel van dit rapport is om experimentele technieken uit de bloedzuiger systeem te consolideren in een enkel artikel dat van nut fysiologen met expertise in andere zenuwstelsel voorbereidingen zal zijn, of om de biologie studenten met weinig of geen ervaring elektrofysiologie. We laten zien hoe je de bloedzuiger voor het opnemen van intracellulair geïdentificeerd neurale circuits in het ganglion ontleden. Vervolgens laten we zien hoe de individuele cellen van bekende functie van het ganglion worden gekweekt in een petrischaal, en het opnemen van die neuronen in cultuur kan worden verwijderd. Dan laten we zien hoe je een patch van geïnnerveerde huid te worden gebruikt voor het in kaart brengen zintuiglijke of motorische velden te bereiden. Deze bloedzuiger voorbereidingen worden nog steeds veel gebruikt om de elementaire elektrische eigenschappen van neurale netwer pakkenks, gedrag, synaptogenese, en ontwikkeling. Ze zijn ook een passende opleiding module voor neurowetenschappen of fysiologie onderwijs laboratoria.
Introduction
De bloedzuiger preparaat bruikbaar voor het onderzoeken van de functie van identificeerbare (sensorische, motorische en inter-neuronen in het centrale zenuwstelsel van het dier (CNS). De nuttige eigenschap van bloedzuiger neuronen is dat de vorm van de actiepotentialen en biofysische eigenschappen zijn kenmerkend voor een bepaald celtype (dat wil zeggen P, N, T, Rz). Bovendien neuronen kunnen worden verwijderd uit het dier en gekweekt in een geschikt medium waarin de cellen behouden hun elektrische karakteristieken voor zolang als 45 dagen 1,2.
Een duidelijk voordeel van de bloedzuiger ganglion om te leren elektrofysiologische opnames is dat cellen karakteristiek en betrouwbaar zijn gerangschikt in de ganglion in een patroon waarmee identificatie van verschillende celtypen van ganglion tot ganglion en van dier tot dier. De unieke locatie en de morfologie van neuronen in bloedzuiger ganglia werden opgemerkt door Retzius al in 1891 3. Kennis van the identiteit en functie van een neuron is voordelig voor onderzoeken neurale circuits en experimenten die met een bepaald celtype. Door de relatief grote somata van neuronen in een ganglion ze zichtbaar met een dissectie microscoop en de somata selectief worden gespietst met micro-elektroden voor het opnemen van hun elektrische eigenschappen.
Kleurstoffen en grote moleculen worden geïnjecteerd in individuele cellen en kanaaleigenschappen bestudeerd door patch clamp. Ionische stromen die aanleiding geven tot de verschillende vormen van de kenmerkende actiepotentialen in verschillende neuronen geïdentificeerd 4-7. Uit onderzoek in het patroon van innervatie en vertakking van individuele neuronen in het CZS, hebben de synaptische verbindingen overgenomen in cultuur met geïdentificeerde neuronen 2,8. Studies in de bloedzuiger ganglia hebben inzicht gegeven in de ontwikkeling van functionele circuits die kan worden gemeten met de elektrofysiologie en met groe dierlijk gedrag studies. De bloedzuiger CNS heeft ook gediend als een waardevolle voorbereiding voor het onderzoeken van de mechanismen die betrokken zijn bij neuronale herstel en regeneratie in het hele dier en in cultuur 4-6,9-12.
In zoogdieren hersenen is het een lastige taak om gedrag te verklaren in termen van de eigenschappen en de aansluitingen van de individuele geïdentificeerde neuronen. In principe kan men hopen dat de studie van minder complexe systemen zoals de bloedzuiger kan helpen basismechanismen die in hogere dieren definiëren. De verbindingen die worden gebruikt die een duik patroon 13,14 en ritme van het hart 15 ten grondslag liggen zijn goed gekarakteriseerd in het achterlijk. Het vermogen van sommige bloedzuiger neuronen elektrische en chemische communicatie vormen is intrigerend. Sommige verbindingen zijn bidirectioneel, terwijl anderen zijn unidirectionele chemisch maar bidirectionele elektrisch 7. Inzicht in de synaptische verbindingen binnen het dier, evenals opnieuw de zelfde type van verbindingen in een cultuur schotel zijn krachtige instrumenten voor het onderzoeken synaptogenese 16-18 alsook farmacologische profilering van synapsen 19. De intracellulaire opname en stimulatie technieken die hier beschreven vormen een basis voor farmacologische testen en onderzoek in neuroethology en ontwikkeling.
Daarnaast kan de segmentale buikzenuwkoord worden ontleed met een patch van geïnnerveerde huid. Met de mogelijkheid om een stukje huid en de neuronen in leven kunnen sensorische receptieve velden worden gesondeerd door het opnemen van elektrische signalen van het cellichaam (dwz soma) van sensorische neuronen in respectievelijke abdominale ganglion in het CZS. Daardoor kan men de gevoeligheid van de sensorische eindes te beoordelen door het toepassen van verschillende gradaties van kracht op de huid en in kaart receptieve velden: lichte aanraking, druk, en schadelijke (pijnlijke) prikkels 20,21.
Een voordeel van deze bloedzuiger ganglion huid preparaat dat een can trekken anatomisch het receptieve veld kaart en teken de neuronale processen om de geïdentificeerde neuron zodra de elektrische reacties worden geregistreerd. De drie bloedzuiger hieronder beschreven experimenten kunnen allemaal meerdere keren worden aangevuld met een enkel exemplaar, dat dit een kosteneffectieve lesmodule zorgt voor academische laboratoria.
Protocol
1. Bereiding van elektroden en zoutoplossing
- Bereid fysiologische zoutoplossing en elektroden voor het dier is ontleed. Leech Ringer-oplossing bestaat uit het volgende: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl2, 4,0 mM KCl, 10 mM Tris / maleïnezuur of HEPES. Breng de pH op 7,4.
- Bereid een Ag-Cl draad door dompelen gereinigde zilverdraad in een kleine hoeveelheid bleekmiddel voor 20 minuten of totdat de draad een gladde donkergrijze afwerking. Was de draad met gedestilleerd water voor het gebruik. Plaats vervolgens de draad in een micropipet houder die wordt aangesloten op de versterker.
- Bereid een scherpe glas elektrode van borosilicaatglas met een pipet trekker. De weerstand elektrode moet in de orde van 20 MQ.
- Opvulling van de pipet met 3 M kaliumacetaat oplossing en plaats in in de micropipet houder.
- Voor een extracellulaire elektrode bereiden een scherpe glazen pipet, zoals hierboven beschreven, breek de punt terug doorwrijven andere scherpe pipet in de buurt van de scherpe rand. Brand vervolgens polijst de tip zodat het niet scheurt de connectieven. Plastic extracellulaire elektroden zal ook zolang er is goed contact tussen de elektrode en de zenuw werken.
- Plaats de extracellulaire elektrode in een micropipet houder (Ag-Cl draad) die is voorzien van een rubberen buis en spuit voor afzuiging. De spuit met zoutoplossing trekken in de elektrode ten minste op het niveau van de zilverdraad.
- Installeren van de hardware (versterker en stimulus isolator) en software opname parameters door het volgen van de handleiding van uw specifiek signaal opname-eenheid. Zie Leksrisawat et al.. 22 tot en met details over de apparatuur die wordt gebruikt in de hieronder beschreven experimenten bekijken.
2. Ventrale ganglion Dissection
- Ontleden de bloedzuiger in een grote silicone-elastomeer beklede schaal met bloedzuiger Ringer-oplossing. Als het dier in langsrichting wordt gerekt zalmakkelijker om de buikzenuwkoord (zie figuur 1A) te verwijderen.
- Met # 10 of # 11 size scalpel een longitudinale incisie met zeer ondiepe sneden in het ventrale middellijn. Omstreeks het midden 2/3e van de ventrale snede wordt weergegeven in figuur 1B. Probeer niet te snijden door de zwarte kous (de ventrale bloed sinus), totdat het dier volledig is geopend en het bloed sinus wordt uitgerekt zonder knikken. Dit bloed sinus loopt de lengte van het dier langs de ventrale middellijn. De VNC is opgenomen binnenkant van deze bloedvat.
- Nadat de huid is gesneden van de volledige lengte van het dier gebruiken de boete iris schaar om nick het bloed sinus (figuur 2). Slip een blad van de boete iris schaar onder de sinus en het mes om het te scheiden van het zenuwweefsel lichtjes verhogen. Snijd de sinus van de lengte van de VNC, terwijl het vermijden van de zenuwwortels, segmentale zenuwen, of de connectieven tussen ganglia.
- Verwijder vervolgens een deel van de buikzenuwkoord doorsnijden van de wortels distale waar het bloedvat sluit de wortels. Herhaal dit proces voor elk ganglion over de lengte van de buikzenuwkoord.
- Breng een segment van een of twee ganglia een kleinere petrischaal. De ganglia of de enige ganglion moet strak met wat speling te worden vastgemaakt.
- Speld de connectieven en de wortels zodat het ganglion gliale schede iets wordt uitgerekt om te voorkomen dat het neuron cellichamen van bewegen wanneer gespietst door de gliale schede en in het neuron van belang. De pennen worden geplaatst door de zwarte sinus van de wortels en in het midden van de twee connectoren op beschadiging van axons (figuur 3) te minimaliseren.
- Plaats de petrischaal met de voorbereiding onder de microscoop en zet deze met was op de bodem van de schotel om verplaatsing te voorkomen.
- Richten de lichtbundel voorzichtig met een spiegel en lichte condensor de neuronen zien zoals in figuur 4A (schematisch weergegeven in figuur 4B
- Om een intracellulaire opname van de Rz, T, P en N neuronen, zorgvuldig plaats de punt van de elektrode in de cel plaats toe en laat de punt tot een uitholling gezien in de gliale schede.
- Tik de elektrode houder of manipulator (heel voorzichtig), zodat de elektrode tip "pops" in de cel van belang.
- Injecteren korte pulsen (30-40 msec) van positieve stroom (1-10 nA) in de cel om actiepotentialen te roepen.
3. Kweken neuronen van het ventrale ganglion Voorbereiding
- Speld de ganglia ventrale zijde naar boven in een schone schotel met L-15 met foetaal kalfsserum (FCS) (Figuur 3). Speld de wortels zodat de ganglia enigszins uitgerekt zoals hierboven gedaan voor intracellulaire opnames. Met fijne schaar, nick de gliale capsule aan de ene kant, zet een schaar mes onder de capsule, daarna dwars door de gliale capsulezoals getoond in figuur 5A.
- Voeg 100 ul aliquot van Collagenase / Dispase om de schotel en leg ze op een shaker gedurende 15 minuten. Onderzoek cellen in door de kweekmedia rond de blootgestelde cellichamen. De terugkeer van de cellen naar de shaker nog 15 min of langer totdat de cellen naar buiten komen met minimale zuigkracht.
- Gebruik een pipet bevestigd aan een injectiespuit zachtjes extraheren cellen van het ganglion. Brand polijst de pipetpunt zodat het iets groter dan de diameter cellichaam. Voor Rz cellen in een volwassen bloedzuiger, moet de diameter van ongeveer 50 urn.
- Bereid een verscheidenheid van pipetten met verschillende diameters zonder filament omdat dit vermindert de kans dat de cellen steken in de pipet. Bewaar de pipetten in een fles met 80% ethanol (EtOH) met behulp van een katoenen bal aan de onderkant om de tips te beschermen tegen chippen. Vergeet niet om de EtOH wassen van de pipet met medium voor het opzuigen van cellen.
- Na het enzym behandeling, was deenzym-bevattend medium met L-15 (met FCS) 2x. Identificeer de cellen van belang en ze zachtjes te trekken in de pipet door het trekken van de spuit (figuur 6A). Ontladen van de opgezogen cellen in een ander gerecht die L-15 bevat (met FCS).
- Tot nu alle procedures waren niet-steriel. Voer de volgende stappen in een steriele kap. Plaats 3-4 grote druppels steriel L-15 (met FCS) op verschillende locaties in een steriele petrischaal.
- Pipetteer de cellen in een van de hiervoor genoemde druppels, blazen ze rond de druppel te wassen. Herhaal deze in serie 3 of 4 druppels drager.
- Plaats cellen in een schone petrischaal gevuld met L-15 (met FCS).
- Incubeer de cellen gedurende 1-24 uur bij kamertemperatuur geroerd. Daarna de schone cellen kunnen worden verzilverd. Bij het verlaten van de cellen gedurende enkele uren of een nacht de extracellulaire matrix komt gemakkelijk af. Plate de cellen onmiddellijk langer processen te genereren.
- Gebruik steriel substraat voor het bekleden van een microwell di sh en laat het volledig drogen ('s nachts) voor het kweken van experimenten.
- Nadat de schaal is bekleed, was de schaal voorzichtig met steriel water en vervolgens met een kleine hoeveelheid van het L-15 medium. Vergeet niet om de L-15-oplossing te gebruiken zonder de FCS toegevoegd om de cellen te hechten aan het gerecht. Het medium kan voorzichtig worden gewijzigd in L-15 met FCS nadat de cellen gehecht aan het substraat. Als de cellen worden gebruikt een paar uur na uitplaten, dan schakelen het medium L-15 met FCS is niet noodzakelijk.
- Plaats de cellen naast elkaar op het uitplaten snelle synaptogenesis (figuur 6B) induceren. Na 24 uur maatregel fysiologische activiteit in paringen van neuronen.
- Gebruik intracellulaire elektrofysiologische technieken om RP of synaptische reacties opnemen in gekweekte paren van cellen (stimuleren 1 neuron door een intracellulaire elektrode en opnemen reacties van de gepaarde cel met behulp van een 2 intracellulaire elektrode).
- Speld de bloedzuiger dorsale zijde in een elastomeer beklede schaal zoals hierboven beschreven.
- Speld de huid aan een kant met wortels op de andere kant van het gescheiden ganglion (fig. 7A, vergroot in figuur 7B) of een venster op het ventrale aspect van de bloedzuiger over een ganglion (fig. 7C) met de wortels het lichaam wand intact.
- Na het verkrijgen van een stabiele intracellulaire opname in een van de zintuigcellen (T, P, N) met een kleine glazen staaf die is vuur gepolijst om de huid in hetzelfde segment licht aan te raken. Als het neuron wordt opgenomen uit een N-cel dan meer druk moeten worden toegepast op de huid. In de meeste gevallen zal de N cel alleen reageren als de huid wordt geknepen met een pincet. Daarom deze laatste cellen moet worden geprobeerd als een huid kan beschadigen of verdringen intracellulaire hercoderen van het preparaat zodanig verstoren.
- Men moetstaat om snel de huid en ganglion voldoende gegevens voldoende schetsen die een kaart waar men aangeraakt kan worden gebruikt om het receptieve veld bepalen voor een bepaald neuron. Na het opnemen van zo veel T-en P-cellen mogelijk aan beide zijden van een ganglion probeer de N cellen.
- Om te onderzoeken of de sensorische neuronen hebben processen die reizen door de connectieven in een rostrale of caudale wijze en vervolgens uit de wortels in het aangrenzende segment van de huid, kan de connectieven tussen ganglia worden gesneden en de receptieve velden opnieuw onderzocht met betrekking tot de verspreiding van detectie. In principe een onderzoekt of er een verlies in het receptieve veld is.
5. Het injecteren van fluorescente kleurstoffen
- Bereid een bloedzuiger ganglion zoals hierboven beschreven.
- Vul een micro-elektrode met een oplossing van Lucifer geel-CH (3,0%) en lithiumchloride (300 mM).
- Spietsen een van de sensorische cellen of Rz cellen aan de buikzijde van het ganglion beschrevenhierboven.
- Injecteer kleurstof in de cel door het passeren negatieve stroom (3Na) door de elektrode voor 15 minuten. Stel de pulsduur van 100 msec en de frequentie 2 Hz.
- Visualiseer de kleurstof gevuld neuronen door spannende de kleurstof met een kwiklamp en een FITC / GFP filter set.
Representative Results
Intracellulaire opnamen van sensorische neuronen in de bloedzuiger ganglion worden gekenmerkt door hun verschillende spanningsafhankelijke tijd sporen in figuur 4C. De rust celmembraanpotentiaal in gezonde bloedzuiger ganglion cellen is -45 tot -60 mV. Als potentials zijn kleiner (minder negatief) moet men het glas elektrode te veranderen, of als het potentieel is nog steeds laag, ga dan naar een ander segment van de zenuw koord. Spontane actiepotentialen met kleine amplitude kunnen aangeven dat de elektrode in motorneuronen. Als dit gebeurt in het ganglion-lichaamswand een stroom injectie kan worden bepaald of het neuron innerveert geven de spieren nog op de huid. De annulus erector motor neuron (AE) is aan de buikzijde van het ganglion (Figuur 4B) en het zal de annuli (ribbels of segmenten) doen stijgen door het activeren van de annulus erector spieren.
Het injecteren van stroom in de zintuigcellen moet actiepotentiaal roepens met de kenmerkende golfvormen in figuur 4C. Als de golfvormen er anders uit zou kunnen te wijten zijn aan een onevenwichtige brug of gecompenseerd capaciteit compensatie. Men moet de handleiding die het signaal acquisitie unit begeleidt voor meer informatie over de brug in evenwicht te brengen in een cel te raadplegen. Let op de stimulusartefacten aan het begin en einde van de huidige pulsen in figuur 4C. Dit is hoe de artefacten te kijken toen de brug in evenwicht is.
Primaire culturen van neuronen uit de bloedzuiger ganglion vormen elektrische en chemische synapsen in de schotel. Aanvankelijk was de elektrische eigenschappen van de gekweekte cellen niet precies hetzelfde als in vivo. Echter na een paar dagen de impulsen bijna niet te onderscheiden van die die in de ganglion. Dit blijkt uit figuur 6C met een paar Rz cellen. Na 7 uur in de cultuur van de amplitude van synaptische potentialen was 1-2 mV. Na 56 uur in cultuur synaptic mogelijkheden waren groter dan 10 mV (top sporen in figuur 6C). De vorm van de actiepotentiaal verandert ook na 56hr in kweek. Onder de beschreven omstandigheden deze cellen levensvatbaar enkele dagen.
Intercellulaire communicatie kan worden aangetoond door het stimuleren van de zenuwwortels of connectoren en opnemen van neuronen in de ganglion. Het stimuleren van deze zenuwen genereert robuuste synaptische potentialen en actiepotentialen in verschillende ganglion cellen. Sporen in fig. 8B zijn opgenomen van een Retzius cel in een ganglion die was verwijderd uit het dier en vastgemaakt in een schotel. De zwart spoor werd opgeroepen door een stimulus subdrempel aangebracht met een extracellulaire elektrode naar de bindweefsel. Het verhogen van de stimulus spanning veroorzaakt de cel een actiepotentiaal (rood trace) ontslaan. Fluorescerende kleurstoffen of mierikswortelperoxidase kan worden geïnjecteerd in deze cellen hun morfologie bestuderen. Lucifer geel werd geïnjecteerd in een Rzneuron door het passeren van een negatieve stroom door de elektrode. Een alternatief is de kleurstof injecteren met wolkjes luchtdruk. Figuur 9A toont de kleurstof kort na de injectie begonnen. Dertig minuten later de kleurstof al had verspreid in de zenuwwortels (figuur 9B). Het type kleurstof afhankelijk van de toepassing, bijv. laag molecuulgewicht kleurstoffen die kunnen passeren gap junctions worden gebruikt om elektrische synapsen identificeren.
Figuur 1. . Ventrale bloedzuiger dissectie (A) Het dier wordt grondig gespeld ventrale kant naar boven in een met elastomeer beklede schotel gevuld met bloedzuiger zoutoplossing (B) Een ondiepe incisie verspreid over de anterior:. Posterior as is net lateraal van de middellijn gemaakt om beschadiging van de zenuw koord. De zwarte bloed sinus (die containersns de buikzenuwkoord) kan gemakkelijk worden gezien. Let op de ene blootgesteld ganglion dat is wit in vergelijking met de schede. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Dissectie van de zwarte sinus. Het bloedvat (pijl) zorgvuldig worden gesneden enerzijds met de buikzenuwkoord (dubbele pijl) bloot. Verlaat segmenten van het bloedvat intact rond de segmentale wortels voor gebruik als een handvat om de buikzenuwkoord manipuleren bij de overdracht tussen dissectie en opnemen van gerechten. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Geïsoleerd gedeelte van de buikzenuwkoord. Pinning de buikzenuwkoord het bloedvat fragmenten nog op de segmentele wortels en aan de uiteinden van de gesegmenteerde connectieven onthult de ganglia voor elektrofysiologische opnames. Een strak strekken van de ganglia maakt het mogelijk om de identificeerbare cel lichamen zien en zal een gemakkelijkere penetratie van de gliale schede mogelijk met een scherp glas elektrode. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Cellulaire anatomie van de bloedzuiger ganglion. (A) Idealiter zou de Retzius cellen (R) en andere grote cellichamen (P-drukure, zal T-touch, N-nociceptieve, AE-annulus erector) duidelijk zichtbaar zijn als de microscoop en licht condensor correct zijn ingesteld. (B) Schematische weergave van cellen in het ganglion. Kleine verschillen in de plaats van de SOMA zal optreden in elke ganglion wijten aan hoe de ganglion wordt gespannen en vastgezet strak. (C) Actiepotentialen opgenomen vanaf het soma van deze neuronen hebben karakteristieke golfvormen. Deze pieken werden opgeroepen door het injecteren van positieve stroom in de cel (plein puls overlappen de spanning-tijd sporen). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 5. Desheathing de ganglion individuele cellichamen verwijderen. (A) De glia omhulseldient zorgvuldig te worden dwars door de ganglion aan schadelijke cellen van belang te voorkomen. De rode lijn geeft een snede om te voorkomen dat het raken van de soma van de Rz neuronen. Het openen van het omhulsel geeft de spijsverteringsenzymen toegang tot het bindweefsel matrix. (B) Gezonde cellichamen bolling van het ganglion na de gliale schede is geopend. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 6. Kweken neuronen uit de bloedzuiger ganglion. (A) Cellen worden opgezogen uit het ganglion behulp van een micropipet en overgebracht naar een schaaltje met kweekmedium. (B) plaatsen van meerdere cellen dichtbij elkaar zal de snelheid van synaptogenesis tussen identificeerbare neuronen vergroten. Hier de stumps van twee neuronen hebben een synaps gevormd. (C) Neuronen in cultuur vertonen iets andere elektrische eigenschappen. De top sporen tonen synaptische potentialen opgeroepen door het stimuleren van de aangrenzende cel 7 uur en 56 uur nadat de cellen werden uitgeplaat. De onderste sporen werden opgewekt door het injecteren van stroom direct in een van de Rz cellen. Let op de toename van de synaptische mogelijke amplitude en verander in de actiepotentiaal golfvorm na 56 uur in de cultuur. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 7. De bloedzuiger ganglion-lichaamswand voorbereiding voor kartering receptieve velden. (A) Een benadering is om een volledige sectie van de lichaamswand verwijderen met 1-3 ganglia. Hier de wortels op een zijde zijn bEEN snit en het ganglion is vastgehouden, naar de zijkant. (B) Een vastgepind uit ganglion bij hogere vergroting. (C) Een andere benadering is om een klein venster te maken in het lichaam muur en record uit de intacte ganglia, terwijl het toewijzen van een receptieve veld . (DG) Elk van de sensorische neuronen vertoont een karakteristieke reactie op een mechanische prikkel. (D) een lichte aanraking roept activiteit in T-cellen maar niet in P of N cellen. (E) De T-celreactie uitgeschakeld in reactie sterker stimuli, om plaats te activatie van de P cel. Als de prikkel wordt sterker de N cellen wordt geactiveerd (FG). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figure 8. Opgeroepen activiteit in de bloedzuiger ganglion. extracellulaire stimulatie van de connectoren kunnen worden gebruikt om synaptische transmissie rijden de zenuwkoord. (A) Dit wordt gedaan door het aanbrengen van een zuig elektrode een van de connectieven en toepassen van een kleine spanning. De scherpe glas elektrode (pijl) kan gezien worden gespietst een Retzius cel in het ganglion. (B) Voltage-time sporen die de stimulus artefact, gevolgd door een synaptische potentiaal (zwart) en een actiepotentiaal (rood). Klik hier voor vergroting afbeelding .
Figuur 9. Injecteren kleurstof in bloedzuiger neuronen. (A) Lucifer geel kan in het soma worden geïnjecteerd door het passeren van de huidige doorgaandugh de opname micro-elektrode. Een kwiklamp en FITC filter set kan vervolgens worden gebruikt om de fluorescentie te visualiseren. (B) Dye heeft verspreid in de Rz axonen ongeveer 30 minuten na de injectie. Klik hier voor grotere afbeelding .
Discussion
Het doel van deze reeks experimenten was 1) de fundamentele beginselen van intracellulaire opnames leren en vertonen van herkenbare neuronen en 2) aan de karakteristieke vormen van elektrische signalen die kunnen voortvloeien uit deze specifieke neuronale typen met behulp van volwassen bloedzuigers herkennen. Er is een rijke geschiedenis van onderzoeken met behulp van de bloedzuiger voor neurofysiologische onderzoeken en het onderzoek is aan de gang in de aanpak van vraagstukken van neurale circuits en genregulatie tijdens de ontwikkeling als tijdens synaptische en regeneratie 10. Neuromodulatie, met name door biogene amine trajecten, is ook een succesvol onderzoek richting het achterlijk. Door het toevoegen van dopamine en andere farmacologische middelen aan het zenuwstelsel door de zoutoplossing, is aangetoond dat dopamine moduleert neurale netwerken die betrokken zijn bij de besluitvorming 23 en motorische patronen voor kruipende gedrag 24,25. Deze experimentele aanpak is een simple (en goedkope) manier om modulatie te nemen in het onderwijs laboratorium, en het aanpassen van de ionische samenstelling van de zoutoplossing is een effectieve manier om de Nernst en Goldman-Hodgkin-Katz vergelijkingen leren.
Om succesvol met de ganglion preparaten is het belangrijk om voor gebruik van een soma porren met een intracellulaire elektrode het ganglion strak. Anders wordt de soma zal bewegen bij het duwen naar beneden op de gliale pakket. Bovendien, als desheathing het ganglion voor het verwijderen van neuronen voor cultuur, vermijd het gebied van belang bij het snijden over het ganglion dus SOMA niet worden beschadigd als ze worden verwijderd. Ook kan overmatige incubatie in de enzymen resulteren in de neuronen zijn te kwetsbaar te worden verwijderd. Het vereist wat trial and error om een ideale incubatietijd bereiken omdat elke partij van enzymen is iets anders in hun acties.
Nader onderzoek naar de cultuur media te optimaliseren kan deze techniek te verbeteren. Varischillende factoren, zoals de aanwezigheid van insuline, suikers of groeifactoren kunnen worden onderzocht langer onderhoud van culturen. Om te bepalen of de cellen behouden hun vermogen zenders, zoals serotonine synthese in Rz cellen synthetiseren, kan neutraal rood kleuring toegepast serotonerge processen label. Ook microglia invasie van de benadeelden en regenererende weefsel kan worden gekwantificeerd door nucleaire vlekken dagen na een blessure.
Hoewel dit preparaat vele voordelen bieden bij het onderzoek regeneratie en herstel en neurale circuits, de farmacologische en moleculaire identificatie van de verschillende receptor subtypes bij synapsen zijn niet volledig gekarakteriseerd. Een expressed sequence tag bibliotheek beschikbaar 26 en de medicinale bloedzuiger genoom wordt momenteel geassembleerd 27, maar de belangrijkste beperking leech vergelijking met sommige model preparaten is de mogelijkheid om het genoom selectieve genen in specifieke celtypen te wijzigen. In embryo tzijn beperking is aangepakt door het injecteren van DNA of dsRNA om genexpressie 28 te regelen. Het gen gun techniek is onlangs gebruikt om invertebrate connexine (innexin) eiwitten tot expressie in neuronen bloedzuiger. Expressie van een innexin uit Hirudo verbana (Hve-inx6) is voldoende voor de vorming van een buitenbaarmoederlijke gap junctions in de medicinale bloedzuiger 29. De medicinale bloedzuiger-of H. verbena als het ware 30 is zeker om ons begrip van de fysiologie en de evolutie van elektrische synapsen in de komende jaren vooruit.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
| Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
| Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
| 04-001 | |||
| D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
| Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
| Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
| HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
| Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T |  AD Instruments |
27T | |
| Head stage | AD Instruments |
Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments |
||
| Electrical leads | any company | ||
| Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | any company | ||
| Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |
References
- Fuchs, P. A., Nicholls, J. G., Ready, D. F. Membrane properties and selective connexions of identified leech neurones in culture. J Physiol. 316, 203-223 (1981).
- Ready, D. F., Nicholls, J. Identified neurones isolated from leech CNS make selective connections in culture. Nature. 281, 67-69 (1979).
- Blackshaw, S. E. Neurobiology of the Leech. Muller, K. J., Nicholls, J. G., Stent, G. S. , Cold Spring Harbor Laboratory. 51-78 (1981).
- Drapeau, P., Sanchez-Armass, S. Parallel processing and selection of the responses to serotonin during reinnervation of an identified leech neuron. J Neurobiol. 20, 312-325 (1989).
- Garcia, U., Grumbacher-Reinert, S., Bookman, R., Reuter, H. Distribution of Na+ and K+ currents in soma, axons, and growth cones of leech Retzius neurones in culture. J. Exp. Biol. , 1-17 (1990).
- Cooper, R. L., Miguel Fernandez, de, Adams, F., B, W., Nicholls, J. G. Synapse formation inhibits expression of calcium currents in purely postsynaptic cells. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 217-222 (1992).
- Liu, Y., Nicholls, J. Steps in the development of chemical and electrical synapses by pairs of identified leech neurons in culture. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. , 236-253 (1989).
- Fernandez de Miguel, F., Cooper, R. L., Adams, W. B. Synaptogenesis and calcium current distribution in cultured leech neurons. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 247, 215-221 (1992).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Multifunctional pattern-generating circuits. Annu. Rev. Neurosci. 31, 271-294 (2008).
- Macagno, E. R., Muller, K. J., Deriemer, S. A. Regeneration of axons and synaptic connections by touch sensory neurons in the leech central nercoys system. J. Neurosci. 5, 2510-2521 (1985).
- Becker, T., Macagno, E. R. CNS control of a critical period for peripheral induction of central neurons in the leech. Development. 116, 427-434 (1992).
- Marin-Burgin, A., Kristan, W. B., French, K. A. From Synapses to behavior: Development of a sensory-motor circuit in the leech. Dev. Neurobiol. 68, 779-787 (2008).
- Kristan, W. B. The Neurobiology of Swimming in the leech. Trends Neurosci. 6, 84-88 (1983).
- Brodfuehrer, P. D., Friesen, W. O. From stimulation to undulation: a neuronal pathway for the control of swimming in the leech. Science. 234, 1002-1004 (1986).
- Arbas, E. A., Calabrese, R. L. Slow oscillations of membrane potential in interneurons that control heartbeat in the medicinal leech. J. Neurosci. 7, 3953-3960 (1987).
- Ching, S. Synaptogenesis between identified neurons. , McGill University. (1995).
- Kristan, W. B., Eisenhart, F. J., Johnson, L. A., French, K. A. Development of neuronal circuits and behaviors in the medicinal leech. Brain Res. Bull. 53, 561-570 (2000).
- French, K. A. Gap junction expression is required for normal chemical synapse formation. J. Neurosci. 30, 15277-15285 (2010).
- Li, Q., Burrell, B. D. Two forms of long-term depression in a polysynaptic pathway in the leech CNS: one NMDA receptor-dependent and the other cannabinoid-dependent. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Behav. Physiol. 195, 831-841 (2009).
- Nicholls, J. G., Baylor, D. A. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech. J. Neurophysiol. 31, 740-756 (1968).
- Yau, K. W. Receptive fields, geometry and conduction block of sensory neurones in the central nervous system of the leech. J. Physiol. 263, 513-538 (1976).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Crisp, K. M., Mesce, K. A. Beyond the central pattern generator: amine modulation of decision-making neural pathways descending from the brain of the medicinal leech. J. Exp. Biol. 209, (2006).
- Puhl, J. G., Mesce, K. A. Dopamine activates the motor pattern for crawling in the medicinal leech. J. Neurosci. 28, 4192-4200 (2008).
- Crisp, K. M., Gallagher, B. R., Mesce, K. A. Mechanisms contributing to the dopamine induction of crawl-like bursting in leech motoneurons. J. Exp. Biol. 215, 3028-3036 (2012).
- Macagno, E. R., et al. Construction of a medicinal leech transcriptome database and its application to the identification of leech homologs of neural and innate immune genes. BMC Genomics. 11, 407 (2010).
- Kandarian, B., et al. The medicinal leech genome encodes 21 innexin genes: different combinations are expressed by identified central neurons. Dev. Genes Evol. 222, 29-44 (2012).
- Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and ectopic gene expression in the medicinal leech. J. Vis. Exp. (14), e697 (2008).
- Firme, C. P., Natan, R. G. 3rd, Yazdani, N., Macagno, E. R., Baker, M. W. Ectopic expression of select innexins in individual central neurons couples them to pre-existing neuronal or glial networks that express the same innexin. J. Neurosci. 32, 14265-14270 (2012).
- Siddall, M. E., Trontelj, P., Utevsky, S. Y., Nkamany, M., Macdonald, K. S. Diverse molecular data demonstrate that commercially available medicinal leeches are not Hirudo medicinalis. Proc. Biol. Sci. 274, 1481-1487 (2007).
