本文介绍了三种神经系统准备采用水蛭:细胞内记录从腹侧神经节的神经元,从腹侧神经节神经元培养,并从神经支配的皮肤感觉映射字段的补丁记录。
淡水水蛭, 医用水蛭 ,是一个已经被用来解决在神经生理学,神经行为学和发育生物学等领域的科学问题一个多才多艺的模式生物。本报告的目的是为了巩固从水蛭系统实验技术成一个单一的文章,将用来生理学家具有专长的其他神经系统制剂,或生物学的学生很少或根本没有电的经验。我们将演示如何解剖水蛭来自于神经节确定的神经回路在细胞内记录。接下来,我们显示如何已知功能的单个细胞可从神经节在培养皿中进行培养,以及如何从在培养这些神经元来记录被删除。然后,我们演示了如何准备支配的皮肤被用于映射感觉或运动领域的一个补丁。这些水蛭制剂仍然被广泛使用,以解决神经网络结构的基本电性能KS,行为,突触和发展。他们还对神经科学和生理学教学实验室适当的培训模块。
水蛭制剂是研究识别(感觉,运动和动物的中枢神经系统(CNS)内跨神经元的功能非常有用。水蛭神经元的有用的特性是它们的动作电位和生物物理特性的形状特征的给定的细胞类型( 例如 P,N,T,RZ)。另外的神经元可以从在适当的培养基中,将细胞保持它们的电特性进行了长达45天的1,2动物和培养被删除。
水蛭神经节学习如何做电生理记录的一个显着优点是细胞特征性和可靠地安排在一个模式,可以让神经节识别不同类型的细胞从神经节神经节,并从动物到动物。独特的地理位置和水蛭神经节神经元的形态进行注意到Retzius早在1891年3。知识次方ë身份和一个神经元的功能是有利的侦查神经回路和用于制备实验用给定的细胞类型。由于神经节它们与解剖显微镜可见,与胞体可与微电极,用于记录它们的电学性能被选择性地刺穿内神经元的相对大的胞体。
染料分子和大分子可注入单个细胞,并研究通过膜片钳信道特性。离子电流,在各种神经元的特征动作电位的各种形状产生已确定4-7。从神经支配的格局和分支中枢神经系统内单个神经元的调查,突触连接已经转载于文化与鉴定神经元2,8。研究中的水蛭神经节提供了洞察功能电路的开发,可以与电测量以及与wholË动物行为的研究。水蛭中枢神经系统还曾担任调查涉及神经元的修复和再生,在整个动物和文化4-6,9-12机制的一个重要前提。
在哺乳动物的大脑是一个艰巨的任务,在属性和个人识别神经元的连接方面解释的行为。原则上我们可以希望,不太复杂的系统,如水蛭的研究可能有助于确定在高等动物中使用的基本机制。所使用的背后游泳图案13,14和15心脏节律的连接得到了很好的特征水蛭。一些水蛭的神经元形成电气和化学通讯的能力是耐人寻味。有些连接是双向的,而有些则是单向的化学性质,但双向电7。了解动物中的突触连接,以及重新创建相同的典型E在培养皿中的连接是调查突触16-18以及19突触药理分析的强大工具。这里所描述的细胞内记录和刺激技术提供了药理实验和研究神经行为学和发展的基础。
此外,该段腹神经索可解剖与神经支配的皮肤补丁。以保持贴剂的皮肤和神经元存活的能力,感官感受域可以通过从在CNS各自腹腔神经节内的感觉神经元的细胞体( 即胞体)记录的电信号被探测。从而可以通过应用不同程度的力在皮肤上评估感觉神经末梢的敏感性和地图感受野:轻轻一碰,压力和有毒(痛苦的)刺激20,21。
这水蛭神经节皮制剂的优点是,一个CAÑ画解剖感受野地图和跟踪神经元的过程来确定的神经元一旦电反应被记录。下述三种水蛭的实验都可以完成多次使用一个单一的标本,这使得这是一个成本有效的教学模块教学实验室。
这组实验的目的是1)从识别的神经元教,并表现出细胞内记录的基本原则和2)认识到的电信号,可以产生用成年水蛭这些特定类型的神经元的特征形状。有调查采用水蛭的神经生理学研究丰富的历史和研究工作正在进行中处理的神经回路,并在突触的修复和再生10在开发过程中,以及基因调控的问题。神经调节,特别是通过生物胺的途径,也于水蛭是一个成功的研究方向。通过盐溶液加入多巴胺等药物制剂的神经系统,它已经表明,多巴胺调节参与决策23和运动模式的爬行行为24,25神经网络。这种实验方法是简体乐和廉价的方式来把调制成教学实验室,并调节盐溶液的离子构成是教导能斯特和戈德曼霍奇金 – 卡茨方程的有效方法。
为了取得成功与神经节筹备工作有神经节之前,试图戳躯体与细胞内电极拉紧是非常重要的。否则,在神经胶质包推下来时,躯体会移动。此外,desheathing神经节用于培养神经元中除去时,在整个神经节切割时所以胞体不被损坏,因为它们将被删除避免感兴趣区域。此外,过度的温育中的酶可导致神经元太脆弱被删除。它需要一些试验和错误,以达到理想的孵化时间,因为每批酶略有不同在他们的行动。
进一步的调查,以优化培养基可以改善这个技术。变量项因素的影响,如胰岛素,糖,或生长因子的存在下,可以检查对更长的维护文化。以确定是否细胞保持它们的合成发射机,如五羟色胺的合成在RZ细胞的能力,中性红染色可以应用于标记的血清素的过程。还小胶质细胞浸润至受伤和再生组织可以通过核污渍日受伤后进行量化。
虽然这种制剂有很多好处,提供在研究再生与修复,以及神经系统的电路,在突触的药理学和分子鉴定的各种受体亚型还没有得到充分的特点。一个表达序列标签库可用26和医用水蛭基因组中,目前正在组装27,但在水蛭的主要限制相比,一些模型制剂是修改的基因组中选择性基因在特定细胞类型的能力。在胚胎吨他的限制已经解决了注射DNA或双链RNA来调节基因表达28。基因枪技术最近被用于表达无脊椎动物连接蛋白(innexin)的蛋白质在神经元的水蛭。从水蛭verbana(HVE-inx6)的innexin的表情足以异位间隙连接的医用水蛭29的形成。医用水蛭-或H。马鞭草因为它是30是一定要推进我们的生理和电突触的演变,在未来几年的理解。
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |