I artikeln beskrivs tre nervsystemet preparat använda blodiglar: intracellulär inspelning från neuroner i ventrala ganglier, odling av nervceller från ventrala ganglier, och spelar in från en lapp av innerveras hud att kart sensoriska områden.
Sötvatten igel, Hirudo medicin, är en mångsidig modell organism som har använts för att behandla vetenskapliga frågor inom områdena neurofysiologi, neuroethology, och utvecklingsbiologi. Målet med denna rapport är att konsolidera experimentella tekniker från igel systemet till en enda artikel som kommer att vara till nytta för fysiologer med expertis inom andra nervsystemet preparat, eller till biologi studenter med liten eller ingen elektrofysiologi erfarenhet. Vi visar hur man dissekera blodigel för inspelning intracellulärt från identifierade nervbanor i ganglion. Nästa visar vi hur enskilda celler med känd funktion kan tas bort från ganglion som odlas i en petriskål, och hur du spelar in från dessa nervceller i kultur. Sedan visar vi hur man förbereder en lapp av innerveras skal som ska användas för att kartlägga sensoriska eller motoriska områden. Dessa igel förberedelser fortfarande i stor utsträckning används för att ta itu med grundläggande elektriska egenskaper neural nätverksks, uppförande, synaptogenesis och utveckling. De är också en lämplig utbildningsmodul för neurovetenskap och fysiologi undervisningslaboratorier.
Den igel beredningen är användbar för att undersöka funktionen av identifierbar (sensoriska, motoriska och inter-neuroner inom djurets centrala nervsystemet (CNS). Den användbara egenskapen hos blodigel neuroner är att formen på deras verkningspotentialer och biofysikaliska egenskaper är karaktäristiska för en given celltyp (dvs. P, N, T, Rz). Dessutom nervceller kan avlägsnas från djuret och odlas i ett lämpligt medium för cellerna behålla sina elektriska egenskaper så länge som 45 dagar 1,2.
En tydlig fördel med blodigel ganglion för att lära sig att göra elektrofysiologiska inspelningar är att cellerna är karakteristiskt och tillförlitligt arrangerade i ganglion i ett mönster som gör det möjligt att identifiera olika celltyper från ganglion till ganglion och från djur till djur. Den unika läge och morfologi av nervceller i igel ganglier noterades av Retzius redan 1891 3. Kunskap om the identitet och funktion av en neuron är fördelaktig för att utreda nervbanor och för att göra försök med en given celltyp. På grund av den relativt stora somata av neuronerna inom en ganglion de är synliga med ett dissektionsmikroskop och somata selektivt kan spetsas med mikroelektroder för registrering av deras elektriska egenskaper.
Färgämnen och stora molekyler kan injiceras in i individuella celler och kanalegenskaperna som studerats av patch clamp. Jonströmmar som ger upphov till de olika formerna av de karakteristiska aktionspotentialer i olika nervceller har identifierats 4-7. Från undersökningar i mönstret av innervation och förgrening av enskilda nervceller inom CNS, har synapsförbindelser återgivits i kultur med identifierade nervceller 2,8. Studier i akterliket ganglierna har gett insikt i utvecklingen av funktionella kretsar som kan mätas med elektrofysiologi samt med groe djurens beteende studier. Blodigeln CNS har också fungerat som en värdefull förberedelse för att undersöka mekanismer som är involverade med neuronal reparation och förnyelse i hela djuret och i kultur 4-6,9-12.
I däggdjurshjärnor är det en svår uppgift att förklara beteende när det gäller egenskaper och anslutningar för enskilda identifierade nervceller. I princip kan man hoppas att studera mindre komplexa system såsom blodigeln kan bidra till att definiera grundläggande mekanismer som används i högre djur. Anslutningarna som används som ligger bakom en simtur mönster 13,14 och rhythmicity av hjärtat 15 är väl karakteriserade i akterliket. Förmågan hos vissa igel nervceller för att bilda både elektrisk och kemisk kommunikation är spännande. Vissa anslutningar är dubbelriktad medan andra är enkelriktade kemiskt men dubbelriktad elektriskt 7. Förstå synapsförbindelser inom djur och återskapa samma type av anslutningar i en odlingsskål är kraftfulla verktyg för att undersöka synaptogenesis 16-18 samt farmakologisk profilering av synapser 19. De intracellulära inspelning och stimuleringstekniker som beskrivs här ger en grund för farmakologiska analyser och forskning i neuroethology och utveckling.
Dessutom kan den segmentventrala nerv sladd dissekeras med en lapp av innerveras hud. Med möjligheten att hålla en bit hud och nervceller vid liv, kan sensoriska receptiva fält sonderas genom att spela in elektriska signaler från cellkroppen (dvs. soma) av sensoriska neuroner inom respektive buken ganglion i CNS. Därmed kan man bedöma hur känsliga de sensoriska ändelser genom att tillämpa olika grader av kraft på huden och karta receptiva fält: lätt beröring, tryck och skadligt (smärtsam) stimuli 20,21.
En fördel med denna igel ganglion-hudpreparat är att en can dra anatomiskt den receptiva fältkartan och spåra neuronala processerna till den identifierade neuron när de elektriska svaren spelas in. De tre leech experiment som beskrivs nedan kan alla fyllas flera gånger med ett enda prov, vilket gör detta till en kostnadseffektiv undervisning modul för akademiska laboratorier.
Syftet med denna uppsättning experiment var 1) att lära och ställa ut de grundläggande principerna för intracellulära inspelningar från identifierbara nervceller och 2) för att känna igen de karakteristiska former av elektriska signaler som kan uppstå just dessa neuronala typer med hjälp av vuxna blodiglar. Det finns en rik historia av undersökningar med hjälp av blodigel för neurofysiologiska undersökningar och forskning pågår för att ta itu frågor av neurala kretsar och genreglering under utveckling och under synaptiska reparation och förnyelse 10. Neuromodulering, särskilt genom biogena amin vägar, har också varit en framgångsrik forskning riktning i akterliket. Genom att lägga till dopamin och andra farmakologiska medel till nervsystemet genom koksaltlösning, har det visat sig att dopamin modulerar neurala nätverk som är inblandade i beslutsfattandet 23 och motoriska mönster för krypande beteende 24,25. Denna experimentella metod är en simple (och billigt) sätt att införliva modulation i undervisningen laboratorium, och justera den joniska makeupen av koksaltlösning är ett effektivt sätt att lära Nernsts och Goldman-Hodgkin-Katz ekvationer.
För att lyckas med ganglion preparat är det viktigt att ha ganglion sträckt innan du försöker peta en soma med en intracellulär elektrod. Annars soma rör sig när man trycker ner på gliaceller paketet. Dessutom, när desheathing ganglion för borttagning av nervceller för kultur, undvika regionen av intresse när man skär igenom ganglion så SOMAS inte skadas när de tas bort. Dessutom kan överdriven inkubation i de enzymer resultera i neuronerna att vara alltför sköra för att tas bort. Det kräver lite trial and error för att uppnå en perfekt inkubationstid eftersom varje sats av enzymer är något annorlunda i sina handlingar.
Ytterligare undersökningar för att optimera odlingsmedia skulle kunna förbättra denna teknik. Varikunde undersökas OU faktorer, såsom närvaro av insulin, socker eller tillväxtfaktorer för längre underhåll av kulturer. För att avgöra om cellerna behålla sin förmåga att syntetisera sändare, till exempel serotonin syntes i Rz celler, kan neutral röd färgning användas för att märka serotonerga processer. Också microglial invasion till skadade och regenerera vävnad kan kvantifieras genom nukleära fläckar dagar efter en skada.
Även om detta preparat har många fördelar att erbjuda för att undersöka förnyelse och reparation samt neurala kretsar, den farmakologiska och molekylära identifiering av de olika receptorsubtyper vid synapser har inte fullt karakteriserats. En uttryckt sekvens tag bibliotek är tillgängligt 26 och den medicinska blodigeln genomet närvarande monteras 27, men den största begränsningen i igel jämfört med vissa modell förberedelser är förmågan att ändra arvsmassan för selektiva gener i specifika celltyper. I embryon tsin begränsning har tagits upp genom att injicera DNA eller dsRNA att reglera genuttrycket 28. Den genkanon teknik har nyligen använts för att uttrycka invertebrate connexin (innexin) proteiner i blodigel neuroner. Expression av en innexin från Hirudo verbana (Hve-inx6) är tillräcklig för bildningen av ektopiska gap junctions i läkemedlet akterlik 29. Läkemedlet igel-eller H. verbena så att säga 30 är säker på att förbättra vår förståelse av fysiologi och utveckling av elektriska synapser under de närmaste åren.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |