Denne artikkelen beskriver tre nervesystemet forberedelser hjelp igler: intracellulær opptak fra nevroner i ventrale ganglia, dyrking nevroner fra ventral ganglier, og opptak fra en lapp av innervated huden å kartlegge sensoriske felt.
Ferskvann igle, Hirudo medicin, er en allsidig modell organisme som har blitt brukt til å adressere vitenskapelige spørsmål innen nevrofysiologi, neuroethology, og utviklingsbiologi. Målet med denne rapporten er å konsolidere eksperimentelle teknikker fra igle systemet inn i en enkelt artikkel som vil være til nytte for fysiologer med kompetanse i andre nervesystemet forberedelser, eller til biologi studenter med liten eller ingen elektro erfaring. Vi demonstrerer hvordan å dissekere den igle for opptak intracellulært fra identifiserte nevrale kretser i ganglion. Neste vi vise hvordan de enkelte celler med kjent funksjon kan fjernes fra ganglion som skal kultiveres i en petriskål, og hvordan man skal ta opp fra disse neuroner i kultur. Deretter viser vi hvordan du kan forberede en oppdatering av innervated huden til å bli brukt for å kartlegge sensoriske eller motoriske felt. Disse igle forberedelser er fortsatt mye brukt for å løse grunnleggende elektriske egenskapene til neural nettverks, atferd, synaptogenesis, og utvikling. De er også en passende opplæringsmodul for nevrovitenskap eller fysiologi undervisning laboratorier.
Den igle preparatet er nyttig for å undersøke funksjonen av identifiserbar (sensorisk, motor-og inter-neuroner i løpet av dyrets sentralnervesystemet (CNS). Utnyttbare egenskap ved igle neuroner er at formen på deres aksjonspotensialer og biofysiske egenskaper er karakteristiske for en gitt celletype (dvs. P, N, T, Rz). Videre nevroner kan fjernes fra dyret og dyrket i et passende medium hvori cellene opprettholde sine elektriske egenskaper så lenge som 45 dager 1,2.
En klar fordel av igle ganglion for å lære hvordan å lage elektrofysiologiske opptak er at cellene er karakteristisk og pålitelig arrangert i ganglion i et mønster som gjør identifisering av forskjellige celletyper fra ganglion til ganglion og fra dyr til dyr. Den unike beliggenheten og morfologi av nevroner i igle ganglia ble bemerket av Retzius så tidlig som i 1891 3. Kunnskap om the identitet og funksjon av et neuron er fordelaktig for å undersøke nevrale kretser og for å gjøre forsøk med en gitt celletype. På grunn av den relativt store somata av neuronene innenfor en ganglion de er synlige med et disseksjonsmikroskop, og somata selektivt kan spiddet med microelectrodes for registrering av deres elektriske egenskaper.
Fargestoffer og store molekyler kan bli injisert inn i individuelle celler og kanalegenskapene studert av patch clamp. Ioniske strømninger som gir opphav til de ulike former av de karakteristiske aksjonspotensialer i ulike nerveceller har blitt identifisert 4-7. Fra undersøkelser i mønsteret av innervasjon og forgrening av enkelte nerveceller i sentralnervesystemet, har de synaptiske forbindelser blitt reprodusert i kultur med identifiserte nevroner 2,8. Studier i igle ganglia har gitt innsikt i utviklingen av funksjonelle kretser som kan måles med elektrofysiologi, så vel som med enge dyrs atferd studier. Akterliket CNS har også fungert som en verdifull forberedelse for å undersøke mekanismene som er involvert med nevronale reparasjon og regenerering i hele dyret og i kultur 4-6,9-12.
I pattedyr hjerner er det en krevende oppgave å forklare atferd i form av egenskaper og tilkoblinger av individuelle identifiserte nevroner. I prinsippet kan man håper at studiet av mindre komplekse systemer som iglen kan bidra til å definere grunnleggende mekanismer som brukes i høyere dyr. Tilkoblingene som brukes som ligger til grunn for en svømmetur mønster 13,14 og rhythmicity av hjertet 15 har blitt godt karakterisert i akterliket. Muligheten av noen igle neuroner for å danne både elektrisk og kjemisk kommunikasjon er interessant. Noen forbindelser er toveis, mens andre er enveis kjemisk men toveis elektrisk syv. Forstå det synaptiske forbindelser i dyret samt gjenskape den samme type av forbindelser i en kultur fatet er kraftige verktøy for å undersøke synaptogenesis 16-18 samt farmakologisk profilering av synapser 19. De intracellulære opptak og stimuleringsteknikker beskrevet her gi et grunnlag for farmakologiske analyser og forskning i neuroethology og utvikling.
I tillegg kan segmental ventrale nerveledning bli dissekert med en lapp av innerverte hud. Med muligheten til å holde en lapp av hud og nervecellene i live, kan sensoriske mottakelig felt bli analysert ved å registrere elektriske signaler fra cellekroppen (dvs. soma) av sensoriske nerveceller innenfor respektive mage ganglion i CNS. Dermed kan man vurdere følsomheten av de sensoriske avslutninger ved å bruke varierende grader av kraft på huden og kartlegge mottakelig felt: lett berøring, trykk, og skadelige (smertefulle) stimuli 20,21.
En fordel med denne igle ganglion-skin preparatet er at man can trekke anatomisk den mottakelig feltet kartet og spore de nevrale prosesser til den identifiserte nevron når de elektriske svarene blir registrert. De tre igle eksperimentene som er beskrevet nedenfor, kan alle bli utført flere ganger med en enkelt prøve, noe som gjør dette til et kostnadseffektivt undervisning modul for vitenskapelige laboratorier.
Hensikten med dette sett av eksperimenter var 1) å lære og viser de grunnleggende prinsipper for intracellulære opptak fra identifiserbare nevroner, og 2) å gjenkjenne de karakteristiske former av elektriske signaler som kan oppstå fra disse bestemte neuronale typer som bruker voksen igler. Det er en rik historie av undersøkelser ved hjelp av igle for nevrofysiologiske undersøkelser og forskning pågår i ta tak i saker av nevrale kretser og genregulering under utvikling så vel som under synaptiske reparasjon og regenerering 10. Neuromodulation, særlig gjennom biogene aminer trasé, har også vært en vellykket forskning retning i akterliket. Ved å legge til dopamin og andre farmakologiske midler til nervesystemet gjennom saltoppløsning, har det vist seg at dopamin modulerer nevrale nettverk som er involvert i beslutnings 23 og motoriske mønstre for gjennomgang atferd 24,25. Dette eksperimentelle tilnærming er en forenkletle (og billig) måte å innlemme modulasjon i undervisningen laboratoriet, og justering av ionisk makeup av saltvann er en effektiv måte å lære Nernst og Goldman-Hodgkin-Katz ligninger.
For å lykkes med ganglion forberedelsene er det viktig å ha ganglion stram før du prøver å dytte en soma med en intracellulær elektrode. Ellers soma vil flytte når presser ned på glial pakken. I tillegg, når desheathing ganglion for å fjerne nevroner for kultur, unngå interesseområdet når du skjærer på tvers av ganglion så Somas ikke blir skadet som de er fjernet. Dessuten kan overdreven inkubering i enzymer resultere i neuronene blir for skjør til å bli fjernet. Det krever litt prøving og feiling for å oppnå en ideell inkubasjonstid fordi hver batch av enzymer er litt annerledes i sine handlinger.
Videre undersøkelser for å optimalisere kultur media kunne forbedre denne teknikken. Varilige faktorer, slik som tilstedeværelse av insulin, sukker eller vekstfaktorer kan bli kontrollert for lengre opprettholdelse av kulturer. For å finne ut om cellene opprettholde sin evne til å syntetisere sendere, som serotonin syntese i Rz celler, kan nøytrale røde flekker brukes til å merke serotonerge prosesser. Også microglial invasjon til skadde og gjenoppfriske vev kan kvantifiseres ved atom flekker dager etter en skade.
Selv om dette preparatet har mange fordeler å tilby i å undersøke regenerering og reparasjon samt nevrale kretser, farmakologiske og molekylær identifisering av de ulike reseptorundertyper ved synapser er ikke fullstendig karakterisert. En uttrykt sekvenssignal bibliotek er tilgjengelig 26, og den medisinske igle genomet blir nå montert 27, men den viktigste begrensning i igle forhold til noen modell preparater er evnen til å modifisere genomet for selektivt gener i spesifikke celletyper. I embryo tbegrensningen hans er løst ved å injisere DNA eller dsrna å regulere genuttrykket 28. Genet pistol teknikken har nylig blitt brukt til å uttrykke virvelløse connexin (innexin) proteiner i igle nevroner. Uttrykk for en innexin fra Hirudo Verbana (Hve-inx6) er tilstrekkelig for dannelsen av ektopiske gap veikryss i medisinsk igle 29. Den medisinske igle-eller H. verbena som det var 30 er sikker på å fremme vår forståelse av fysiologi og utviklingen av elektriske synapser i løpet av de neste årene.
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |