腹側神経節から神経細胞を培養し、感覚のフィールドをマッピングするために神経支配の皮膚のパッチから記録、腹側神経節の神経細胞からの細胞内記録:この記事では、ヒルを使って3神経系の準備について説明します。
淡水ヒル、 ヒルドmedicinalisは 、神経生理学、神経動物行動学、発生生物学の分野で科学的問題に対処するために使用されている汎用性の高いモデル生物である。この報告書の目的は、他の神経系製剤における専門知識を持つ生理学者に使用されるであろう、あるいはほとんど、またはまったく電気生理学の経験を持つ生物学の学生に一つの記事にリーチのシステムからの実験技術を統合することです。私たちは、神経節内の識別された神経回路から細胞内に記録するためのリーチを分析する方法を示します。次に、既知の機能を個々の細胞はシャーレに培養する神経節から削除する方法を示し、どのように文化の中で、これらのニューロンから記録します。その後、我々は、感覚や運動のフィールドをマッピングするために使用される神経支配皮膚のパッチを準備する方法を示しています。これらのリーチ製剤はまだ広く神経networの基本的な電気的特性をアドレス指定するために使用されるKS、行動、シナプス形成、および開発。彼らはまた、神経科学や生理学教授の研究室のための適切なトレーニングモジュールである。
リーチの準備が特定できる(感覚、運動、動物の中枢神経系(CNS)内でインターニューロンの機能を調査するのに便利です。リーチの神経細胞の有用な特性は、その活動電位および生物物理学的特性の形状はのために特徴的であるということである所与の細胞型( すなわち P、N、T、Rz)はまた、ニューロン細胞があれ45日1,2ためのそれらの電気的特性を維持する適切な培地中で培養した動物から除去することができる。
電気生理学的記録を作る方法を学習するためのリーチの神経節の明確な利点は、細胞が特徴的にかつ確実に神経節にし、動物から動物に神経節とは異なる細胞種の同定を可能にするパターンで神経節内に配置されているということです。ユニークなロケーションとリーチ神経節の神経細胞の形態は、早ければ1891年3としてレチウスで注目された。目の知識電子同一性およびニューロンの機能は、神経回路を調査するため、所与の細胞型を用いた実験を行うのに有利である。による神経節内のニューロンの比較的大きな細胞体にそれらを解剖顕微鏡で可視であり、かつ細胞体を選択的にそれらの電気的特性を記録するための微小電極で突き刺され得る。
染料及び大分子は、個々の細胞およびパッチクランプによって研究チャネル特性に注入することができる。様々な神経細胞に特徴的な活動電位の様々な形状を生じるイオン電流は4-7同定されている。神経支配のパターンで調査し、CNS内の個々のニューロンの分岐から、シナプス結合は、識別されたニューロン2,8と文化の中で再現されている。リーチの神経節における研究では、Wholおよびでだけでなく、電気生理学を用いて測定することができる機能的な回路の開発への洞察を提供してきたE動物行動の研究。リーチは、CNSはまた、動物全体での文化4-6,9-12における神経修復および再生に関与するメカニズムを研究するための貴重な準備を務めている。
哺乳類の脳では、個々の識別された神経細胞の性質や接続の面での挙動を説明するための困難な作業である。原則として1は、リーチとしてはあまり複雑なシステムの研究では、高等動物で使用される基本的なメカニズムを定義するために助けることができることを願っています。水泳パターン13,14と心臓15のリズムの根底に使用されている接続がうまくリーチで特徴づけられている。電気的および化学的の両方の通信を形成するために、いくつかのリーチニューロンの能力が興味深い。他は単方向に化学が、双方向の電気7ている間、いくつかの接続が双方向である。動物内のシナプス結合を理解するだけでなく、同じ標準を再作成培養皿内の接続のeは、シナプス形成16〜18だけでなく、シナプス19の薬理学的プロファイリングを調査するための強力なツールです。ここで説明する細胞内記録と刺激技術は、薬理学的アッセイおよび神経動物行動学と開発研究のための基盤を提供します。
また、分節腹側神経索の神経支配、皮膚のパッチで解剖することができる。生きている皮膚のパッチと神経細胞を維持する能力、感覚受容野は、CNS内のそれぞれの腹部神経節内の感覚ニューロンの細胞体( すなわち細胞体)からの電気信号を記録することで調べることができる。それによって、1は皮膚に力を様々な程度を適用することにより、感覚終末の感度を評価し、受容野をマップすることができます。軽いタッチ、圧力、および有害(痛みを伴う)20,21を刺激。
このリーチ神経節の皮膚の準備の利点は、1 CAN解剖学的に受容野マップを描き、電気的応答が記録されて一旦同定ニューロンへの神経突起をトレースします。以下の3つのリーチ実験は、すべての学術研究室のために、このコスト効果的な教育モジュールを作る単一の検体で複数回完了することができる。
この一連の実験の目的は、1)指導、展示細胞内記録の基本原則を特定可能なニューロンからと2)大人のヒルを使用して、これらの特定の神経細胞のタイプから発生する可能性が電気信号の特徴的な形状を認識するようにすることでした。神経生理学的な調査·研究のためのリーチを使用して調査の豊かな歴史は、開発時だけでなく、シナプス修復および再生10の間、神経回路と遺伝子制御の問題に対処する上で進行中であります。ニューロモデュレーションは、特に生体アミン経路を介して、また、リーチで成功した研究の方向となっている。生理食塩水を介して中枢神経系へのドーパミンおよび他の薬理学的薬剤を添加することにより、ドーパミンが意思決定挙動24,25をクロールするためのモータ23と、パターンに関与する神経回路網を調節することが示されている。この実験的なアプローチは、あほですル(かつ安価)教授の研究室に変調を組み込むための方法、および生理食塩水のイオン化粧を調整するには、ネルンストゴールドマン·ホジキン·カッツの方程式を教えるための効果的な方法です。
神経節の準備と成功するためには、神経節前細胞内電極と細胞体を突くしようとすると張りつめていることが重要です。グリアパケットを押し下げた場合、その他の相馬が移動します。培養のための神経細胞を除去するための神経節をdesheathingとき神経を横断する際にこれらが削除されるように細胞体が損傷していないので、また、関心のある領域を避ける。また、酵素の過剰なインキュベーションは、ニューロンが削除されるにはあまりにも脆弱なものになることがあります。酵素の各バッチは、彼らの行動が若干異なるため、理想的なインキュベーション時間を達成するために、いくつかの試行錯誤が必要です。
培養培地を最適化するためのさらなる調査は、この方法を改善することができる。バリ例えば、インスリン、糖、または増殖因子の存在などのOU因子は、培養物の維持のために、より長い検査することができる。細胞は、Rzの細胞におけるセロトニン合成のような送信機を合成する能力を維持するかどうかを判断するには、ニュートラルレッド染色は、セロトニン作動性のプロセスをラベルに適用することができます。負傷し、組織再生にもミクログリア侵入が損傷後の核しみ日によって定量化することができる。
この準備は、再生および修復だけでなく、神経回路を調べるに提供する多くの利点がありますが、シナプスでの様々な受容体サブタイプの薬理学的および分子識別が十分に特徴付けられていない。発現配列タグライブラリが26用意されており、薬用ヒルゲノムは、現在27を組み立てているが、一部のモデルの製剤に比べてリーチの主な制限は、特定の細胞型に選択的な遺伝子についてゲノムを変更する機能です。胚Tにその制限は、28遺伝子発現を調節するDNAまたはdsRNAを注入することによって対処されてきた。遺伝子銃技術が最近リーチニューロンにおいて無脊椎動物コネキシン(innexin)タンパク質を発現するために使用されている。 ヒルドverbana(HVE-inx6)からinnexinの発現は、薬用ヒル29内の異所性ギャップ結合の形成のために十分である。薬用ヒル-またはHそれは30だったとしてバーベナは、今後数年間で電気シナプスの生理学と進化の理解を進めることでしょう。
The authors have nothing to disclose.
Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Tris/maleic acid | Sigma-Aldrich | ||
Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
CULTURING MATERIALS | |||
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Collagenase/Dispase | Boehringer Mannheim | 269-638 | |
Leibovitz L-15 with L-Glutamine | Gibco | 041-01415H | |
Fetal calf serum | Ready Systems Ag | ||
04-001 | |||
D-Glucose-Monohydrate | Merck | 8342 | |
Gentamycin sulfate | any supplier | 10 mg/ml | |
Glutamine | Gibco | 043-0503H | |
HEPES | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
Concanavalin A Type IV | Sigma | C 2010 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma | P 7890 | MW 15-30,000 |
Microwell plate, 60 x 10 μl | Falcon | 3034 | Flat bottom, 10 in a bag |
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
Intracellular electrode probe | |||
Faraday cage | |||
Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
Dissecting microscope (100X) | |||
Fiber optic lamp | |||
Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, Suction electrodes |
Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
Raised preparation stand | |||
Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
Computer | any company | ||
AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
LabChart7 | AD Instruments | ||
Electrical leads | any company | ||
Glass tools | make yourself | For manipulating nerves | |
Cable and connectors | any company | ||
Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
Beakers | any company | ||
Wax or modeling clay | any company or local stores | ||
Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
Plastic tip for suction electrode | local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size. |