Modèles et méthodes pour évaluer le transport des Drug Delivery Systems à travers les barrières cellulaires
Summary
De nombreuses applications thérapeutiques nécessitent un transport sûr et efficace des transporteurs de drogue et leurs cargaisons à travers les barrières cellulaires dans le corps. Cet article décrit une adaptation des méthodes établies pour évaluer la vitesse et le mécanisme de transport de nanovecteurs de médicaments (NCS) à travers les barrières cellulaires, telles que la gastro-intestinale (GI) épithélium.
Abstract
Transporteurs sous-micrométriques (nanocarriers; CN) améliorer l'efficacité des médicaments en améliorant la solubilité, stabilité, temps de circulation, le ciblage et la libération. En outre, traversant les barrières cellulaires dans le corps est crucial à la fois pour l'administration orale de CN thérapeutiques dans la circulation et le transport du sang vers les tissus, où l'intervention est nécessaire. Le transport NC à travers les barrières cellulaires est obtenue par: (i) la voie paracellulaire, par l'intermédiaire de la perturbation transitoire des jonctions qui s'imbriquent les cellules adjacentes, ou (ii) la voie transcellulaire, où les matériaux sont internalisées par endocytose et transportées à travers le corps de la cellule et sécrétée à la surface de la cellule opposée (transyctosis). Livraison à travers les barrières cellulaires peut être facilitée en couplant la thérapeutique ou de leurs supports avec des agents de ciblage qui se lient spécifiquement à des marqueurs de surface cellulaire impliquées dans le transport. Ici, nous fournissons des méthodes pour mesurer l'ampleur et le mécanisme du transport NC à travers une barrière cellulaire modèle, la WHIch est constitué d'une monocouche de gastro-intestinal (GI) de cellules épithéliales cultivées sur une membrane poreuse située dans un insert Transwell. Formation d'une barrière de perméabilité est confirmée par la mesure de la résistance trans-épithéliale électrique (TEER), le transport transépithélial d'une substance de contrôle, et l'immunomarquage des jonctions serrées. A titre d'exemple, ~ 200 nm CN polymères sont utilisés, qui portent une cargaison thérapeutique et sont revêtues d'un anticorps qui cible un déterminant de surface cellulaire. L'anticorps ou de la cargaison thérapeutique est marqué avec 125 I pour radio-isotope le traçage et les coordonnateurs nationaux marqués sont ajoutés à la chambre haute sur la monocouche de cellules pour des périodes variables. CN associés aux cellules et / ou transportés à la chambre sous-jacente peut être détectée. Mesure de libre 125 I permet la soustraction de la fraction dégradée. La voie paracellulaire est évaluée par la détermination de changements potentiels causés par le transport NC pour les paramètres de barrière décrits ci-dessus. Transcellulaire transports is déterminé en abordant l'effet de moduler endocytose et la transcytose voies.
Introduction
Barrières cellulaires dans le corps agissent comme une passerelle entre l'environnement extérieur et compartiments internes. C'est le cas pour la muqueuse épithéliale séparant la surface externe exposée de la gastro-intestinal (GI) et dans la circulation sanguine 1-3. Des barrières cellulaires représentent également l'interface entre le sang et le parenchyme et les composants cellulaires de tissus et d'organes. C'est le cas pour le revêtement endothelial interne des vaisseaux sanguins, telles que la barrière hémato-pulmonaire, la barrière hémato-encéphalique, etc 1 La capacité à traverser ces barrières cellulaires dans l'organisme est essentielle pour la distribution efficace des agents thérapeutiques et diagnostiques dans la circulation et les tissus / organes où une intervention est nécessaire.
Pour améliorer la prestation des agents thérapeutiques ou diagnostiques, ces composés peuvent être chargés dans nanocarriers sous-micrométriques (CN). Ces véhicules d'administration de médicaments peuvent être formulés avec une grande variété dechimiques et des structures pour optimiser la solubilité du médicament, la protection, la pharmacocinétique, la libération et le métabolisme de 4,5. CN peut également être fonctionnalisé par affinité ou des fractions de ciblage (par exemple, des anticorps, des peptides, des aptamères, des sucres, etc) pour faciliter l'adhésion à des zones du corps où l'effet thérapeutique est requis 2,6. Ciblage des CN déterminants exprimés à la surface des barrières cellulaires peut en outre faciliter le transport dans et / ou à travers ces garnitures 2,6.
Le rôle de transporter sélectivement les substances entre deux environnements nécessite certaines caractéristiques uniques entre les couches de cellules. Une de ces caractéristiques est la polarité cellulaire, grâce à quoi la membrane apicale en regard de la lumière de cavités varie de la membrane baso-latérale orientée vers l'interstitium des tissus, par rapport à la morphologie de la membrane et de la composition des lipides, des transporteurs, et deux récepteurs. Une autre caractéristique implique junctio intercellulairens de raccordement des cellules adjacentes. La régulation des protéines qui forment des jonctions serrées, des molécules d'adhérence en particulier de jonction (confitures), occludins et claudines, moduler la fonction de la barrière pour permettre de manière sélective ou non le transport de substances entre les cellules, appelées le transport paracellulaire, permettant le passage des matériaux à partir du lumen de l'espace basolatéral 3. Reliure de nombreux éléments naturels et synthétiques (leucocytes, des molécules, des particules et des systèmes de délivrance de médicaments) à des barrières cellulaires dans le corps peut provoquer ouverture cellule jonction, qui peut être transitoire et relativement inoffensifs ou plus prolongée et, par conséquent, dangereux avec un accès de substances indésirables à travers la barrière 2,5,7-9. Par conséquent, cette voie peut être évaluée en mesurant la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) et passive paracellulaire diffusion des molécules (ci-après appelé de fuite paracellulaire), grâce à quoi une diminution de la résistance d'un courant électrique ou une fuite paracellulaire accrue d'une inecomposé rt dans l'espace basolatéral indiquer ouverture des jonctions cellulaires, respectivement 5,10,11. En complément de ces méthodes, l'une des protéines des jonctions serrées énumérés ci-dessus peuvent être colorées pour évaluer leur intégrité, où la coloration doit apparaître concentrée aux frontières cellule-cellule tout autour de la périphérie de la cellule 5,10,12.
Alternativement, les systèmes d'administration de médicaments qui ciblent les déterminants de surface cellulaire spécifiques, tels que ceux associés à des fosses recouvertes de clathrine ou invaginations de la membrane en forme de flacon-disant cavéoles, peuvent déclencher l'absorption vésiculaire dans les cellules par endocytose, fournir une avenue pour l'administration de médicaments à des compartiments intracellulaires 5, 13. En outre, l'endocytose peut conduire à la traite des vésicules à travers le corps de la cellule de mise sur le côté basolatéral, un phénomène connu sous le nom transyctosis, ou le transport transcellulaire 14. Par conséquent, la connaissance de la cinétique et le mécanisme d'endocytose peut être utilisé pour exploiter une intracellulairend délivrance transcellulaire des médicaments, qui offre un mode de livraison relativement sûre et contrôlée par rapport à la voie paracellulaire. (Endocytose comme dans le cas de la molécule d'adhésion cellulaire (CAM) médiée) Le mécanisme d'endocytose peut être évaluée avec des modulateurs de voies classiques (clathrine et endocytose de la cavéoline-médiation, et macropinocytose) ou des voies non classiques 5,13,15 .
Attendu que le trafic intracellulaire est souvent étudiée dans des puits ou des lamelles couvre-objet classiques, l'absence d'un compartiment basolatéral s'oppose à la polarisation de la cellule et la capacité d'étudier le transport à travers les couches de cellules. Pour surmonter cet obstacle, le transport à travers des monocouches de cellules a été longuement étudié en utilisant des inserts Transwell 10,11,16,17, qui sont constitués d'une chambre supérieure (apicale), une membrane poreuse perméable, où les cellules se fixent et forment une monocouche étanche, et une plus faible (basolatérale) chambre (Figure 1). Dans cette configuration, le transport peut être mesurée dans l'apical-basolatéral à-direction par l'administration d'un traitement dans la chambre supérieure, à la suite du transport à travers la monocouche cellulaire et la membrane poreuse sous-jacente, et finalement la collecte du milieu dans la chambre inférieure, pour la quantification de matière transportée. Transport dans la direction basolatérale à apicale peut également être mesurée par administration initiale à la chambre inférieure et la collecte subséquente de la chambre supérieure 5,10,12,16. Il existe diverses techniques pour vérifier la formation de la barrière de perméabilité sur transwells, y compris des dosages TEER et de transport paracellulaire, comme décrit ci-dessus. En outre, le filtre perméable à laquelle les cellules sont mises en culture peut être enlevé pour l'analyse d'imagerie (par exemple par fluorescence, confocal, microscope électronique), que en outre la validation du modèle de monocouche de cellules ainsi que le mécanisme de transport. Le choix du type de membrane, qui est disponible en différentes tailles de pores, les matériaux, et les zones de surface, dépend de divers factors tels que la taille des substances ou objets à transporter, le type de cellule, et la méthode d'imagerie 16,18-20. Transwell inserts facilitent également la quantification précise et contrôlée du transport par rapport aux systèmes de mammifères complexes, comme les volumes des chambres et la zone de surface de la cellule sont des constantes connues. Bien que de nombreux facteurs impliqués dans la délivrance in vivo sont éliminés, y compris la présence de mucus intestinal, contrainte de cisaillement, les enzymes digestives, les cellules immunitaires, etc, cette petite échelle modèle in vitro fournit des informations préliminaires utiles concernant le transport.
A titre d'exemple pour illustrer l'adaptation de ces méthodes pour étudier le transport à travers les barrières cellulaires NC 10,11,16,17, nous décrivons ici un cas où le potentiel de transport NC à travers l'épithélium gastro-intestinal a été modélisé en évaluant passage d'une livraison de drogue de modèle système à travers une monocouche de l'adénocarcinome colorectal humain epithelial (Caco-2) des cellules. A cette fin, caunes ont été cultivées dans des inserts Transwell, sur un pore de 0,8 um en polyéthylène téréphtalate (PET) filtre (diamètre 6,4 mm), qui est transparent et peut être utilisé pour l'imagerie par microscopie. L'état de la barrière de perméabilité est validé par la mesure de la TEER, le transport apical-basolatéral à-d'une substance de contrôle, l'albumine, la microscopie à fluorescence et la visualisation d'un élément des jonctions serrées, la protéine occludine. Un modèle de polymère ciblé NC est utilisé, composé de 100 nm, les nanoparticules de polystyrène non biodégradables. CN sont recouvertes par une adsorption de surface avec un anticorps ciblant seul ou une combinaison d'un anticorps de ciblage et un cargo thérapeutique, où l'une ou l'autre composant peut être marqué avec un radio-isotope 125I pour le traçage. Dans l'exemple choisi, l'anticorps reconnaît la molécule d'adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1), une protéine exprimée à la surface de l'épithélium gastro-intestinal (et d'autres), les cellules, ce qui a été montré pour faciliter le transport intracellulaire et transcellulaire o transporteurs de drogue de f et de leurs cargaisons 21. La cargaison est l'alpha-galactosidase (α-Gal), une enzyme thérapeutique utilisé pour le traitement de la maladie de Fabry, une maladie de surcharge lysosomale génétique 22.
Les CN enrobés, de l'ordre de 200 nm de diamètre, sont ajoutés à la chambre apicale sur la monocouche cellulaire et incubées à 37 ° C pendant différentes périodes de temps, après quoi, 125 I, le CN peuvent être détectés associés à la monocouche cellulaire et / ou transportée vers la chambre basolatérale-dessous les cellules. Détermination supplémentaire de droits 125 I permet la soustraction de la fraction dégradée et l'estimation des revêtu transports NC. Le mécanisme de transport est en outre évalué en examinant les variations de la barrière de perméabilité relative à la voie paracellulaire, par l'intermédiaire des paramètres décrits ci-dessus, alors que le transport transcellulaire est déterminée en examinant les changements dans le transport lors de la modulation des voies de l'endocytose et la transcytose.
ontenu "> Ces méthodes fournissent des renseignements précieux sur les modèles de barrière cellulaire, l'ampleur et la vitesse de transport d'un système de délivrance de médicaments, et le mécanisme de ce type de transport, permettant tout à fait l'évaluation du potentiel pour l'administration de médicaments à travers les barrières cellulaires.Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant les méthodes discutées ci-dessus, un modèle cellulaire pour l'étude du transport des commandes numériques ciblées à travers les barrières cellulaires peut être établi, tel que l'exemple fourni pour Caco-2 des cellules epitheliales, ce qui est pertinent pour l'évaluation du transport de la lumière du GI dans le sang, dans le cas des systèmes d'administration de médicaments par voie orale. Mise en culture des monocouches de cellules épithéliales gastro-intestinal dans des inser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de l'Institut médical Howard Hughes et la National Science Foundation à RG, et les fonds alloués à SM par les National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) et l'American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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