Summary
Muchas aplicaciones terapéuticas requieren un transporte seguro y eficiente de los portadores de fármacos y sus cargas a través de barreras celulares en el cuerpo. En este artículo se describe una adaptación de los métodos establecidos para evaluar la tasa y el mecanismo de transporte de nanovehículos drogas (NCS) a través de barreras celulares, tales como el tracto gastrointestinal (GI) epitelio.
Abstract
Portadores Sub-micrométricas (Nanocarriers; CN) mejorar la eficacia de los medicamentos mediante la mejora de la solubilidad, estabilidad, tiempo de circulación, la orientación, y la liberación. Además, atravesar las barreras celulares en el cuerpo es crucial tanto para la administración oral de los CN terapéuticos en la circulación y el transporte de la sangre a los tejidos, donde se necesita la intervención. NC transporte a través de barreras celulares se logra mediante: (i) la ruta paracelular, a través de la interrupción transitoria de las uniones que se entrelazan las células adyacentes, o (ii) la ruta transcelular, donde los materiales son internalizados por endocitosis, transportados a través del cuerpo celular, y secretada en la superficie de la célula opuesta (transyctosis). Entrega a través de barreras celulares puede facilitarse mediante el acoplamiento de la terapéutica o de sus portadores con agentes de direccionamiento que se unen específicamente a los marcadores de la superficie celular implicadas en el transporte. Aquí, ofrecemos métodos para medir el alcance y el mecanismo de transporte de Carolina del Norte a través de una barrera de células modelo, WHICH consta de una monocapa de gastrointestinal (GI) las células epiteliales cultivadas en una membrana porosa situada en un inserto Transwell. La formación de una barrera de permeabilidad se confirmó mediante la medición de la resistencia transepitelial eléctrica (TEER), el transporte transepitelial de una sustancia de control, y la inmunotinción de las uniones estrechas. Como un ejemplo, se utilizan 200 ~ CN polímero nm, y que llevan una carga terapéutico y están recubiertos con un anticuerpo que se dirige a un determinante de la superficie celular. El anticuerpo terapéutico o de carga se marca con 125I para el rastreo de radioisótopos y los CN marcados se añaden a la cámara superior sobre la monocapa de células durante períodos variables de tiempo. NCs asociados a las células y / o transportados a la cámara subyacente puede ser detectado. Medición de free 125 I permite la sustracción de la fracción de degradado. La ruta paracelular se evalúa mediante la determinación de cambios potenciales causados por el transporte del NC para los parámetros de barrera descritas anteriormente. Transcelular i transportes determinar examinando el efecto de la modulación de la endocitosis y transcitosis vías.
Introduction
Barreras celulares en el cuerpo actúan como una puerta de enlace entre el ambiente externo y compartimentos internos. Este es el caso para el revestimiento epitelial que separa la superficie expuesta externamente del tracto gastrointestinal (GI) y el torrente sanguíneo 1-3. Barreras celulares también representan la interfaz entre el torrente sanguíneo y el parénquima y componentes celulares de los tejidos y órganos. Este es el caso para el revestimiento endotelial interior en los vasos sanguíneos, tales como la barrera sangre-de pulmón, la barrera sangre-cerebro, etc 1 La capacidad de atravesar estas barreras celulares en el cuerpo es crucial para la entrega eficaz de los agentes terapéuticos y de diagnóstico en la circulación y tejidos / órganos donde se necesita la intervención.
Para mejorar el suministro de agentes terapéuticos o de diagnóstico, estos compuestos se pueden cargar en nanovehículos sub-micrométricos (NCS). Estos vehículos de administración de fármacos se pueden formular con una variedad dequímicas y estructuras para optimizar la solubilidad del fármaco, la protección, la farmacocinética, la liberación y el metabolismo de 4,5. CN también se puede funcionalizar con afinidad o restos de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpos, péptidos, azúcares aptámeros, etc) para facilitar la adhesión a las áreas del cuerpo donde se requiere la acción terapéutica 2,6. Focalización de los Comités Nacionales de los determinantes expresados en la superficie de las barreras celulares puede facilitar aún más el transporte en y / oa través de estos forros de 2,6.
El papel de transportar selectivamente sustancias entre dos entornos requiere ciertas características únicas entre las capas de células. Una de estas características es la polaridad celular, por lo que la membrana apical dirigida a la luz de las cavidades varía desde la membrana basolateral orientada hacia el intersticio de tejido, con respecto a la morfología de la membrana y la composición de los lípidos, transportistas y receptores 2. Otra característica implica junctio intercelularns conectan células adyacentes. La regulación de las proteínas que forman las uniones estrechas, moléculas de adhesión sobre todo de unión (mermeladas), occludins y claudins, modulan la función de barrera para permitir o no el transporte de sustancias entre las células, conocidas como el transporte paracelular, que permite el paso de materiales desde la luz a el espacio basolateral 3. La unión de muchos elementos naturales y sintéticos (leucocitos, moléculas, partículas y sistemas de administración de fármacos) a barreras celulares en el cuerpo puede inducir la apertura de células-unión, que puede ser transitoria y relativamente inocuo o más prolongada y, por lo tanto, peligroso con el acceso de sustancias no deseadas a través de la barrera 2,5,7-9. Por consiguiente, esta vía se puede evaluar mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la difusión paracelular pasiva de las moléculas (en este documento denominado fugas paracelular), por lo que la disminución de la resistencia a una corriente eléctrica o el aumento de las fugas paracelular de un INEcompuesto rt en el espacio basolateral indican apertura de los cruces de células, respectivamente 5,10,11. Para complementar estos métodos, cualquiera de las proteínas de unión estrecha enumerados anteriormente se puede teñir para evaluar su integridad, donde la tinción debe aparecer concentrada en las fronteras de célula-célula todo alrededor de la periferia de la célula 5,10,12.
Alternativamente, los sistemas de administración de fármacos que se dirigen a los determinantes específicos de la superficie celular, tales como los asociados a depresiones revestidas de clatrina o invaginaciones de membrana forma de matraz llamadas caveolas, pueden desencadenar la captación vesicular en células por endocitosis, proporcionando una vía para la administración de fármacos a los compartimentos intracelulares 5, 13. Además, la endocitosis puede conducir a tráfico de vesículas de todo el cuerpo de la célula para la liberación en el lado basolateral, un fenómeno conocido como transyctosis, o el transporte transcelular 14. Por lo tanto, el conocimiento de la cinética y el mecanismo de endocitosis puede ser utilizado para explotar un intracelularND administración de fármacos transcelular, que ofrece un modo relativamente seguro y controlado de entrega en comparación con la ruta paracelular. (Endocitosis, tales como el caso de la molécula de adhesión celular (CAM)-mediada) El mecanismo de la endocitosis se puede evaluar con moduladores de la vía clásica (clatrina y la endocitosis mediada por caveolina, y macropinocitosis) o rutas no clásicos 5,13,15 .
Considerando que el tráfico intracelular se estudia a menudo en pozos o cubreobjetos estándar, la ausencia de un compartimento basolateral se opone a la polarización celular y la capacidad de estudiar el transporte a través de capas de células. Para superar este obstáculo, el transporte a través de monocapas de células se ha estudiado durante mucho tiempo el uso de insertos Transwell 10,11,16,17, que consisten en una cámara superior (apical), una membrana permeable poroso donde las células se unen y forman una monocapa apretado, y una menor (basolateral) cámara (Figura 1). En esta configuración, el transporte se puede medir en el-apical a basolateral dirección mediante la administración de un tratamiento en la cámara superior, después del transporte a través de la monocapa de células y la membrana porosa subyacente, y finalmente recoger el medio en la cámara inferior para la cuantificación de material transportado. Transporte en la dirección basolateral a apical también se puede medir por la administración inicial a la cámara inferior y la recogida posterior de la cámara superior 5,10,12,16. Existen diversas técnicas para verificar la formación de barrera de permeabilidad en los cultivos polarizados, incluyendo la TEER y ensayos de transporte paracelular, como se describió anteriormente. Además, el filtro permeable en el que se cultivan las células se puede quitar para análisis de imágenes (por ejemplo, por fluorescencia, confocal, microscopía electrónica), como una validación adicional del modelo de monocapa celular, así como el mecanismo de transporte. La selección del tipo de membrana, que está disponible en diferentes tamaños de poros, materiales, y áreas de superficie, depende de varios factors, tales como el tamaño de las sustancias u objetos a ser transportados, tipo de célula, y el método de formación de imágenes 16,18-20. Transwell inserciones también facilitan la cuantificación controlada y precisa de transporte en comparación con los sistemas de mamíferos complejos, como volúmenes de las cámaras y el área de superficie de la célula son constantes conocidas. Mientras que se eliminan muchos factores involucrados en la entrega en vivo, incluyendo la presencia de moco intestinal, tensión de cizallamiento, enzimas digestivas, las células inmunes, etc, esta pequeña escala modelo in vitro proporciona información preliminar útil en materia de transporte.
Como ejemplo para ilustrar la adaptación de estos métodos para estudiar el transporte NC a través de barreras celulares 10,11,16,17, describimos aquí un caso en que el potencial de transporte NC a través del epitelio GI fue modelado mediante la evaluación de paso de un modelo de administración de fármacos sistema a través de una monocapa de células Caco-(2) células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humana. Para este propósito, Cells se cultivaron en insertos Transwell, en un 0,8 micras de poro de tereftalato de polietileno (PET) filtro (6,4 mm de diámetro), que es transparente y puede ser utilizado para obtener imágenes de microscopía. El estado de la barrera de permeabilidad se valida mediante la medición de la TEER, el transporte apical a basolateral de una sustancia de control, la albúmina, y la visualización microscopía de fluorescencia de un elemento de las uniones estrechas, la proteína ocludina. Se utiliza un modelo de polímero específica Carolina del Norte, que consta de 100 nm, las nanopartículas de poliestireno no biodegradables. CN están recubiertas por adsorción superficial con un anticuerpo dirigido solo o una combinación de un anticuerpo dirigido y una carga terapéutica, donde cualquiera de los componentes puede ser marcado con 125I para el rastreo de radioisótopos. En el ejemplo seleccionado, el anticuerpo reconoce molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una proteína expresada en la superficie de células epiteliales GI (y otros), células que se ha demostrado para facilitar intracelular y transcelular o transporte portadores de fármacos f y sus cargas 21. La carga es la alfa-galactosidasa (α-Gal), una enzima terapéutica utilizada para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, una enfermedad de depósito lisosomal genética 22.
Los CN recubiertos, de alrededor de 200 nm de tamaño, se añaden a la cámara apical sobre la monocapa de células y se incubaron a 37 ° C durante períodos variables de tiempo, después de lo cual 125 I en los CN puede ser detectada asociada a la monocapa de células y / o transportados a la cámara basolateral por debajo de las células. Determinación adicional de free 125 I permite la sustracción de la fracción degradada y la estimación de los transportes recubierto NC. El mecanismo de transporte se evaluó adicionalmente mediante el examen de los cambios en la permeabilidad de la barrera perteneciente a la ruta paracelular, a través de los parámetros descritos anteriormente, mientras que el transporte transcelular se determina mediante el examen de los cambios en el transporte cuando la modulación de las vías de endocitosis y transcitosis.
ontenido "> Estos métodos proporcionan información valiosa acerca de los modelos de barrera celular, el alcance y la velocidad de transporte de un sistema de administración de medicamentos, y el mecanismo de este tipo de transporte, lo que en conjunto la evaluación de las posibilidades de la administración de fármacos a través de barreras celulares.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. El cultivo de una monocapa de células en Transwell inserciones
- En un nivel de bioseguridad 2 células campana de cultivo estéril, coloque 0,8 mm de poro PET Transwell inserciones en una placa de 24 pocillos (4 pozos por condición, para la significación estadística) con fórceps. Todos los materiales que entran en la campana deben ser esterilizadas con etanol.
Nota: El tamaño de poro del filtro tiene que ser seleccionado de acuerdo con el tamaño medio de la NC utilizado, para permitir el transporte a través de la membrana. Además, para obtener resultados estadísticamente significativos, cada condición experimental requiere un mínimo de cuatro repeticiones (pozos) dentro del mismo experimento, y un mínimo de 3 experimentos independientes.
- Preparar medio de cultivo celular que contiene medio DMEM suplementado con 4,5 g / L de glucosa, suero bovino fetal al 15%, y 1% pen-strep, y el calor a 37 ° C en un baño de agua.
- Diluir adenocarcinoma colorrectal epitelial humana (Caco-2) células en medio celular y el lugar200-400 l de la solución de células en el (apical) cámara superior del inserto Transwell, a una densidad de 1,5 x 10 5 células / cm 2. Llene el (basolateral) cámara baja con 700 a 900 l de medio celular.
- Células de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2, y 95% de humedad durante 16-21 días, reemplazando el medio en la cámara superior e inferior, cada 3-4 días, utilizando los volúmenes indicados en el paso 1.3. Reemplazar medio en el orden siguiente para mantener la presión por encima de (en vez de debajo) de la monocapa de células: Aspirar el medio desde la cámara inferior, aspirar el medio de la cámara superior, llenar la cámara superior con medio fresco, y llenar la cámara inferior con medio fresco.
2. Validación de la GI epitelial Permeabilidad Barrera Usando resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y La inmunotinción de uniones estrechas
- Para el almacenamiento a corto plazo (menos de 2 semanas), se sumergen los electrodos en una solución STX100 electrolitoción (0,1-0,15 M KCl o NaCl). Conectar el cable del electrodo al electrodo de puerto en el metro EVOM voltios-ohmios de modo que el sistema es internamente en cortocircuito y la simetría del electrodo se mantiene. Para el almacenamiento a largo plazo, enjuagar con dH 2 O y almacenar en una condición seco y oscuro.
- Para esterilizar los electrodos, se sumergen en etanol durante 15 minutos y dejar secar al aire durante 15 segundos. Alternativamente, los electrodos pueden ser almacenados en una campana de UV. Enjuagar los electrodos en una solución estéril de electrolito (solución salina tampón de fosfato, PBS) o solución M de KCl o NaCl 0,1-0,15, antes de cada medición de la resistencia.
- Con el medidor de voltios-ohmios establece en el ajuste de la resistencia, colocar verticalmente electrodos en un pozo que contiene el inserto Transwell, con el electrodo corto en la cámara superior y el largo electrodo en la cámara inferior de tocar la parte inferior del pozo. Una vez que la lectura se estabilice EVOM, registre el valor de la resistencia (dado en ohmios; Ω) para cada pozo.
- Calcular la resistividad (resistance normalizó a la zona; Ω × 2 cm) de las muestras de restar la resistencia de fondo (TEER de insertos transwell sin células) y multiplicando por área de superficie de la membrana. Los valores de resistividad son más a menudo en la literatura. (Véase el debate)
- Repetir las mediciones cada 1-2 días hasta que la TEER valores de aumento de hasta un máximo y meseta, indicando la formación de una barrera de permeabilidad, que típicamente toma de 2-3 semanas desde el momento de Platting celular. Valores y el tiempo necesario para lograr la integridad de la barrera Meseta TEER pueden variar en función del número de pases celulares.
- Para verificar la presencia de uniones estrechas en monocapas de células con alta TEER (igual o por encima del valor umbral para la formación de la barrera), fijar las células por incubación con frío 2% de paraformaldehído durante 15 min. A continuación, lavar las células con PBS y se incuban durante 30 min a temperatura ambiente con 1 mg / ml de anti-ocludina. Lavar las células de nuevo con PBS y se incuban durante 30 min a temperatura ambiente con 7,5 g / ml fanticuerpos secundarios luorescently marcados. Utilice pozos con bajo TEER como un control negativo para la formación de la barrera.
Nota: Como sustituto para el anti-ocludina, se pueden usar anticuerpos frente a proteínas de unión estrecha alternativos.
- Escindir con cuidado la membrana de filtro en la que se adjunta la monocapa fijo, y montar en portaobjetos para formación de imágenes utilizando epifluorescencia o microscopía confocal.
3. Evaluar Transepitelial Transporte de Portadores focalizados
- Marcar el anticuerpo (anticuerpo de ratón monoclonal contra ICAM-1, anti-ICAM, en este ejemplo) que apunta con 125 I, como se ha descrito previamente 7. Utilice ensayo de Bradford para estimar la concentración de proteínas y un contador gamma para determinar 125I contenido en el anticuerpo, a continuación, calcular la actividad específica en cuentas por minuto (CPM) / mg de anticuerpo marcado.
Nota: Para el control de la especificidad, returba el procedimiento mediante el etiquetado de IgG de ratón, que se utiliza para preparar los CN recubiertos no dirigidas. Para estudiar el transporte de una carga terapéutica, repita el procedimiento de etiquetado de la carga, por ejemplo, alfa-galactosidasa (α-Gal) en este ejemplo. Las alternativas pueden ser utilizados para el agente de dirección, el control no específico, o de carga terapéutica. Los métodos alternativos también pueden ser utilizados para etiquetar compuestos y estimar la concentración de los homólogos marcados.
- Acoplar el marcado objetivo de anticuerpos (anti-ICAM en nuestro ejemplo) a la superficie de los Comités Nacionales. En este ejemplo, incubar nanobeads de poliestireno (diámetro 100 nm) durante 1 hora a temperatura ambiente con 125 I-anti-ICAM para permitir la adsorción superficial, tal como se describe 7.
Nota: Para el control no específica utilizar 125I-IgG. Para rastrear el transporte de una carga, utilice una combinación de focalización de anticuerpos y 125 de carga que llevan la etiqueta (α-Gal en nuestro ejemplo).
- Se centrifuga a 13.000 g durante 3 min y retirar las contrapartes no-revestidos en el sobrenadante por aspiración. Resuspender el sedimento que contiene los CN recubiertos usando 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS mediante pipeteo, y se somete a ultrasonidos a baja potencia para interrumpir agregados de partículas potenciales (20-30 breves pulsos).
- Para la caracterización de Carolina del Norte, medir el tamaño, la polidispersidad, y ζ-potencial de partículas recubiertas utilizando dispersión dinámica de luz (siguiendo las instrucciones del proveedor), y cuantificar el número de marcado con 125I de metas de moléculas de anticuerpo (por ejemplo anti-ICAM) en la superficie de la partícula usando un contador gamma.
Nota: Estos métodos se pueden repetir para las contrapartes no específicas y terapéuticas. El tamaño de partículas recubiertas oscila alrededor de 200 nm.
- Añadir 125 CN I-anticuerpo (por ejemplo, 125 I-anti-ICAM NCs; 56 nCi / ml) a la cámara superior por encima de confluentes Caco-2 monocapas con la TEER y# 8805; 350 Ω × 2 cm (ver Discusión) sobre el fondo (16 a 21 días después de la siembra). Incubar a 37 ° C durante uno o más de tiempo deseado intervalos. Mida TEER (Sección 2.3), antes y después de la incubación para evaluar los efectos de los Comités Nacionales sobre la permeabilidad de la barrera.
Nota: Este procedimiento se puede repetir para las contrapartes no específicas y terapéuticas.
- Recoger medio de las cámaras superior e inferior y lavar una vez con 0,5 ml de DMEM a 37 ° C (cámara superior) o 1 ml dH 2 O (cámara baja). Recoger los lavados para la medición del contenido total de radioisótopo utilizando un contador gamma.
- Para la medición de la fracción de células, escindir el filtro permeable, por ejemplo, utilizando una hoja de afeitar para cortar alrededor de los bordes, y se incuba en un tubo contador gamma con 1% de Triton X-100 durante 10 min (para liberar el contenido de celdas), antes de la medición de células total asociada a la radiactividad.
- Para medir 125 me rearrendado de los CN durante el transporte o debido a la degradación potencial, primera mezcla 300 l de muestra (de las fracciones superiores, inferiores o celulares) con 700 l de BSA al 3% en PBS y 200 l de ácido tricloroacético (TCA). Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Mientras tanto este tiempo, medir la radiactividad total de esta muestra en un contador gamma.
- Centrifugar las muestras de TCA en 3000 xg durante 5 minutos para separar la proteína intacta (gránulo) de la proteína degradada o 125I fracción (sobrenadante). Cuantificar la radiactividad de la fracción libre de 125I y restar este valor de la radioactividad total medida antes de la centrifugación. Esto proporcionará la cantidad de proteína marcada que no se degrada.
4. Mecanismo de Transepitelial Transporte de Nanocarriers focalizados
- Etiqueta albúmina con 125I como se describe en la Sección 3.1 y se informó anteriormente 7.
Nota: La albúmina es un 66,5kDa de proteínas y, por lo tanto, una sustancia relativamente grande. Aunque un control válido para el transporte pasivo de objetos más grandes (por ejemplo, 200 nm CN usado aquí), que debe ser sustituido con moléculas de trazador inerte más pequeñas cuando se estudia el transporte de portadores de fármacos más pequeños (véase la discusión).
- Para evaluar el transporte paracelular utilizando albúmina de fugas paracelular, de cultivo de Caco-2 monocapas sobre Transwell inserciones como se describió anteriormente.
- Para el medio de cámara superior por encima de la monocapa de células, añadir ya sea solo 125 I-albúmina (control negativo que muestra el nivel basal de fugas), o 125 CN anticuerpos dirigidos I-albúmina y no radiomarcados (como se describe en la Sección 3.5). Se incuba a 37 ° C para el intervalo de tiempo seleccionado (s), que debe coincidir con los examinados al probar el transporte NC. Mida TEER (Sección 2.3) antes, durante y después de la incubación, se recogen todas las fracciones para el total de 125 I y 125 I gratuitas mediciones como se indica. en la Sección 3 Nota: adición concomitante de 125 de control de la I-albúmina y no radiomarcado CN IgG puede ser utilizado como un control.
- Como control positivo para la apertura de las uniones intercelulares, añadir medios de células que contiene 5 mM de H 2 O 2 a las cámaras superior e inferior de la pieza de inserción Transwell, y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Luego, mida TEER (Sección 2.3) y añadir 125 I-albúmina a la cámara superior de los intervalos de tiempo seleccionados. Medir la TEER en varios puntos de tiempo a lo largo de la incubación para identificar la TEER decaimiento valor causada por H 2 O 2 inducida por la apertura de las uniones de las células.
- En experimentos paralelos, evaluar el transporte transcelular, también llamado transcitosis, de 125 corresponsales nacionales orientados I incubando confluentes Caco-2 monocapas, ya sea con 50 monodansylcadaverine M (MDC; inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina), 1 mg / ml filipin (inhibidor de caveolar endocitosis mediada), Wortmann 0,5 Men (inhibidor de la fosfatidilinositol 3 quinasa [PI3K], que participan en macropinocitosis), o 20 mM [5 - (N-etil-N-isopropil) amilorida] (EIPA, inhibidor de macropinocitosis y endocitosis mediada por CAM 15).
Nota: 125 I-IgG de los CN y 125 I-albúmina pueden ser utilizados como controles negativos para el efecto de estos inhibidores, y otros métodos (por ejemplo, técnicas de siRNA) pueden proporcionar una inhibición más selectiva.
- Medir la TEER (Sección 2.3) antes, durante, y después de la incubación de las células con inhibidores y materiales radiomarcados, como un control adicional para el efecto de los inhibidores de la permeabilidad monocapa.
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Representative Results
Como validación de nuestro modelo celular para estudiar el transporte transepitelial de los CN dirigidos, la Figura 2 muestra que Caco-2 monocapas de células en placas a una densidad de 1,5 × 10 5 células / cm 2 alcanzado la confluencia ~ Día 12 y se mantienen la integridad de la monocapa hasta el día 18, indicado por la TEER (Figura 2A). Este fue validado por la presencia de uniones estrechas ocludina-positivo (Figura 2B) en monocapas con alta TEER (390 Ω cm × 2, Día 14), en comparación con pobres etiquetado apretado unión a baja TEER (17 Ω cm × 2, Día 5 ).
Rastreo de la marca radioactiva en los elementos NC determina la cantidad total de estos componentes (NC focalización anticuerpo o de carga) inicialmente añadido a la cámara apical, su fracción asociada a la célula, y su fracción transportado hacia el lado basolateral. Estos valores se pueden utilizar para calcular diversos parámetros que describen el transporte Carolina del Norte en unde manera más relevante, sobre todo después de la sustracción de contenido libre 125 I de cada fracción, que representa homólogos degradados. Por ejemplo, el número de moléculas de anticuerpos, moléculas de carga o en los Comités Nacionales asociadas que están transversal de la monocapa celular se puede calcular para estimar el transporte absoluta. Además, el porcentaje de dichas moléculas o CN que se transporta hacia el lado basolateral con respecto al número total de moléculas o CN asociados a la monocapa celular, estima la eficacia de dicho transporte. Finalmente, el coeficiente de permeabilidad aparente (Papp), un parámetro estándar para la velocidad de transporte, se puede estimar. Estos parámetros se calculan como sigue:
Las moléculas transportadas o los CN transportados = CPM × basolateral (Moléculas añade o NC añadido / CPM en el original)
% de moléculas o los CN transportados = 100 x [basolateral / (basolateral CPM CPM CPM +fracción de células)]
Papp (cm / s) = (CPM basolateral × vol.) / (A × t × CPM añadido)
donde CPM son el 125 I conteos por minuto añadido a la cámara alta (CPM es nuestro), la fracción de monocapa celular (fracción CPMcell), o la cámara baja (basolateral CPM) y NC añadidos o moléculas añadidas son el número de Comités Nacionales o moléculas inicialmente añadido a la cámara superior, A es el área de la superficie de la membrana filtrante (2 cm), vol. es el volumen de medio en la cámara superior (ml), y t es el tiempo de incubación (s).
En nuestro ejemplo, cuando el isótopo radioactivo se marcar el anticuerpo de direccionamiento, este análisis revela el grado y la eficiencia del transporte en términos de anticuerpos o CN transportados por célula y el porcentaje de anticuerpos o los CN que fueron transportados monocapa-asociada de células (Figura 3A y 3B ), como loll como la tasa de transporte en términos de Papp (Figura 3D). Estos parámetros, que se estima en nuestro ejemplo para 125 CN I-anti-ICAM, también se compararon con las de control de 125 I-IgG de CN para demostrar la eficiencia del transporte en relación con un homólogo no específica (Figura 3C y 3D).
Cuando el marcador radiactivo se incorpora en la carga NC, los parámetros descritos reflejan el transporte de la carga, que en nuestro ejemplo era la enzima α-Gal, que se utiliza para el tratamiento de un trastorno de almacenamiento lisosomal genético conocido como enfermedad de Fabry (Tabla 1). Además de calcular el transporte NC trazando dijo de carga, entrega transepitelial de esta enzima terapéutica se puede estimar, por ejemplo, mediante la expresión como moléculas o masa de α-Gal transportado por célula.
Por último, este método atributos de la vía de transporte a la ruta paracelular o laruta transcelular. Por ejemplo, en nuestro ejemplo, EIPA reduce el transporte de CN 125 I-anti-ICAM a través de células Caco-2 monocapas de células (Figura 4A), mientras que MDC, filipina, y wortmanina no redujeron los niveles de transporte con respecto a la condición de control (sin inhibidor ). Esto sugiere que los CN anti-ICAM utilizan endocitosis mediada por CAM para el transporte transcelular, pero no clatrina, caveolar-, o transcitosis relacionados macropinocitosis-. Por otra parte, el transporte paracelular fue descartado el uso de mediciones de TEER (Figura 4B) y un transporte pasivo de albúmina (Figura 4C), por el que una disminución en la TEER y un aumento en las fugas paracelular de albúmina en la cámara inferior durante el transporte de los CN anti-ICAM tendrían interrupción indicado de uniones intercelulares. Sin embargo, la incubación con anti-ICAM CN no alteró la TEER o 125 fugas paracelular I-albúmina durante un período de 48 horas, similar al control CN de IgG que no se transportan. Comocontrol positivo para la apertura de las uniones de las células y el transporte paracelular, H 2 O 2 disminuyó la TEER a los niveles basales y marcadamente mejorado 125 diferencial i-albúmina a la cámara basolateral.
Figura 1. Esquema del transporte transepitelial de nanovehículos dirigidos a través de un modelo de epitelio gastrointestinal. (A) Como una plataforma para estudiar el transporte transepitelial, Caco-2 monocapas de células se cultivan en insertos Transwell hasta que se forma una monocapa apretado (16-21 días después de la siembra, TEER ≥ 350 Ω × 2 cm sobre el fondo). Un ejemplo de un vehículo de administración de fármacos, tales como los CN 125 I-anti-ICAM, se añade a la (apical) cámara superior por encima de la monocapa de células para estudiar transporte a través de las células y a través de la membrana porosa subyacente.Se recoge el medio en el (basolateral) cámara inferior para la cuantificación de material transportado. (B) El transporte a través de la monocapa celular se produce a través de ya sea un paracelular o transcelular ruta / transcitosis. Reproducido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Haga clic aquí para ver más grande la figura
Figura 2. Caco-2 monocapas como un modelo para el transporte transepitelial. Caco-2 células fueron cultivadas en insertos Transwell de 1,5 × 10 5 células / cm 2. (A) la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) fue medida para evaluar la integridad de la monocapa. Los datos se muestran como medias ± SEM, n = 3. (B) La microscopía de fluorescencia de las uniones estrechas immunolabeled con anti-ocludina y anticuerpo secundario marcado con Rojo Texas, en los días 5 o 14 (bajos frente a los valores altos de TEER, respectivamente). Reproducido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Haga clic aquí para ver más grande la figura
Figura 3. Transporte de nanovehículos anti-ICAM a través de Caco-2 monocapas de células. Confluentes Caco-2 monocapas cultivadas en transwell inserciones se incubaron con 125 Comités Nacionales I-anti-ICAM o 125I-IgG NCs añade a la cámara apical. Se midió (AC) 125 contenidos que en la cámara basolateral en los puntos de tiempo indicados, para calcular la cantidad de los CN transported por célula (ver resultados representativos). (B) Porcentaje de los CN transportados se calculó como la relación de los portadores que se encuentran en la fracción basolateral a que en las fracciones basolateral y de células combinadas. Se calcularon (D) los coeficientes de permeabilidad aparente (P app) como se describe en resultados representativos, lo que refleja las tasas de transporte de 125 Comités Nacionales I-anti-ICAM o 125I-IgG CN. Los datos se muestran como medias ± SEM, n = 4. Reproducido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Haga clic aquí para ver más grande la figura
Figura 4. Mecanismo de transporte de unnanovehículos nti-ICAM a través de Caco-2 monocapas. (A) el transporte transcelular de 125 Comités Nacionales I-anti-ICAM a través confluentes Caco-2 monocapas se evaluó a las 24 horas en ausencia o en presencia de 20 mM EIPA, 1 mg / ml filipin, 50 M MDC, o 0,5 M wortmannina. (B) TEER se midió durante el transporte de los 125 Comités Nacionales I-anti-ICAM a través de Caco-2 monocapas, para evaluar el transporte paracelular. Los valores de TEER en la ausencia de CN se muestran como controles (el intervalo de trazos marca SEM del valor medio). La incubación con 5 mM de H 2 O 2 es un control positivo para la apertura de las uniones intercelulares. (C) paracelular pérdida de proteínas, medida como el coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) de 125I-albúmina de cruzar la monocapa de células en ausencia o en presencia de 5 mM de H 2 O 2, IgG CN, o anti-ICAM CN, se midió y se calculado como en la figura 3. Los datos se muestrann como medias ± SEM, n ≥ 4. Reproducido de Ghaffarian et al., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Haga clic aquí para ver más grande la figura
| NCs totales asociados / célula | Intracelular CN / celular | Transportado CN / celular | % Transportado | Moléculas de α-Gal transportados / células × 10 5 | pg transportado / celular × 10 -3 | Papp (× 10 -8 cm / seg) | |
| 3 hr | 663,4 ± 116,0 | 434,0 ± 76,8 | 243.6 ± 15,4 | 44.4 ± 6.7 | 1,8 ± 0,2 | 9,7 ± 1,2 | 8,1 ± 1,1 |
| 24 hr | 2024.8 ± 409.3 | 1218.9 ± 255.6 | 806,9 ± 164,1 | 40,6 ± 2,0 | 3,9 ± 0,5 | 21.3 ± 2.5 | 1,9 ± 0,4 |
| NCs = nanovehículos; α-Gal = α-galactosidasa; total NCs asociado / cell = intracelular CN / celulares + NCs transportados / celular;% Transportado = (CN transportado / Total NCs asociada) × 100, p app = coeficiente de permeabilidad aparente (cm / s). Véanse los métodos para una descripción más detallada de estos parámetros. Los datos se muestran como medias ± SEM (n = 8 pozos); (-TNF-α células Caco-2). | |||||||
Tabla 1. Transporte transepitelial de α-Gal por nanovehículos anti-ICAM. Transporte transcelular de anti-ICAM / 125 I-α-Gal NCs través estafafluidas Caco-2 monocapas se evaluó en 3 horas y 24 horas. Contenido de radioisótopo de fracciones apicales, basolateral, y de la célula se convierte en diversos valores pertinentes para el transporte, como se describe en resultados representativos. Reproducido de Ghaffarian et al., J. Controlled. Rel. 163 (1), 25-33 (2012).
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Discussion
Usando los métodos discutidos más arriba, un modelo celular para el estudio de transporte de los CN dirigidos a través de barreras celulares se puede establecer, por ejemplo, el ejemplo proporcionado para Caco-2 células epiteliales, lo cual es relevante para la evaluación de transporte desde el lumen GI a la sangre en el caso de los sistemas de administración de fármacos orales. El cultivo de las monocapas de células epiteliales GI en insertos Transwell activar la medición de la TEER y fluorescencia inmunotinción de uniones estrechas para confirmar la formación de una barrera de permeabilidad de la célula. Posteriormente, el radiomarcado de focalización y agentes terapéuticos con 125 I, siempre y cuantificación rápida y sensible de los CN dirigidos en ya través de GI monocapas celulares. Finalmente, se aplicaron estudios mecánicos utilizando inhibidores de endocitosis, TEER, y un ensayo de fugas paracelular albúmina para evaluar si el transporte se produce a través de una ruta vesicular frente a una ruta paracelular.
Un parámetro importante en el establecimiento de modelos similares is la selección de un tipo de célula, el cual debe reflejar la naturaleza fisiológica de la barrera celular en estudio. Varias células epiteliales y endoteliales de origen humano o animal están disponibles comercialmente 16,18-20. Estos pueden ser cultivadas solo como cultivos individuales como se describe aquí, o como co-cultivos de estas células con otros tipos de células 16,18-20 (por ejemplo, células, células inmunes, pericitos, etc secretora de mucosa). En dicha forma de co-cultivo, transwell condiciones de inserción pueden ser moduladas para ajustar las tasas de crecimiento respectivas y los requisitos para los factores de diferenciación en los medios celulares 16,18-20. Por ejemplo, un modelo de barrera hematoencefálica puede implicar co-cultivo de las células y los astrocitos o pericitos endoteliales microvasculares del cerebro en la superficie opuesta del filtro poroso, y los respectivos medios de comunicación para cada tipo de célula debe ser colocado en cada cámara 19. Además, dependiendo de la línea celular, componentes de la matriz extracelular pueden ser reqpedirá otra para la fijación celular efectiva a la membrana porosa 18-20. Es importante tener en cuenta que cada modelo en particular se representará diferentes niveles basales con respecto a los parámetros de barrera de la permeabilidad y las velocidades de transporte y mecanismo, por lo tanto, los valores de control necesitan ser obtenido y estos métodos optimizado para cada situación.
Transwell inserciones, tales como los descritos aquí, se han utilizado ampliamente para estudiar el transporte de materiales a través de monocapas de células, desde el apical en un compartimento basolateral o viceversa 5,10-12,16,17. Esto no se puede lograr mediante el cultivo de células en los pozos o cubreobjetos clásicos debido a que tales sistemas se oponen a este tipo de transporte, ya que no ofrecen dos compartimentos independientes y por lo tanto no pueden dar una visión realista de la clasificación de células. Por ejemplo, los materiales destinados, naturalmente, para la liberación de la membrana basolateral pueden ser desviados a otros compartimentos celulares en un modelo de cubreobjetos, por lo que es difícil de resolve el mecanismo de transporte transcelular. Por otra parte, en contraste con cubreobjetos, la configuración Transwell da lugar a características fisiológicamente relevantes asociados con la diferenciación celular y la polaridad de la membrana 10,11,16-19. Por ejemplo, las células Caco-2 células cultivadas en cultivos polarizados presentan las características de los enterocitos maduros, incluyendo la presencia de microvellosidades y uniones estrechas, la formación de cúpula, y la producción de enzimas del borde en cepillo 10,11,17. Otros parámetros pueden inducir un fenotipo más fisiológicamente relevantes, tales como la tensión de cizallamiento en el caso de células epiteliales GI (por ejemplo, flujo de moco y movimientos contráctiles) y células endoteliales vasculares (por ejemplo, el flujo de sangre), que puede ser aplicada en los cultivos polarizados usando agitación o bombas 10 , 16, y co-cultivos para producir el necesario crecimiento y factores de diferenciación de ciertos tipos de células 16,18-20. Sin embargo, hay que considerar que las líneas celulares a menudo difieren de las células en los tejidos corporales, e. G. Pueden expresar ciertos determinantes a diferentes niveles y, por lo tanto, presentan variadas funciones y reglamentos. Por ejemplo, células Caco-2 no contienen todas las proteínas de transporte y enzimas requeridas para la activación y el transporte de agentes terapéuticos orales in vivo, tales como CYP3A4, una enzima de metabolización de fármaco 10,17,23. En estos casos, sub-clones de la línea celular, transfección, o la adición de agentes de la transcripción se pueden utilizar modular la línea celular como para reflejar mejor las condiciones fisiológicas 17,23,24.
En la selección de un modelo de Transwell óptima, las diversas características del filtro permeable deben tenerse en cuenta. Filtros permeables están disponibles en diferentes tamaños de poro, que van desde 0,4 hasta 8 m, y deben acomodar el tamaño de la carga transportada. Por ejemplo, tamaños de poro más pequeños (0,4-3 M) se utilizan normalmente para los estudios de transporte de compuestos químicos pequeños, mientras que los poros 3 micras o más grandes se utilizan para la invasión de células, Cheen el que microbiana, las células inmunes, y que migran se transportan motaxis, y estudios de motilidad. Tamaño de los poros y la densidad también afecta a la densidad celular y la diferenciación, ya que algunas células pueden migrar a través de los poros en la siembra, lo que impide la formación de monocapa. Además, el material de la claridad permeable a influencias de apoyo de formación de imágenes, para la evaluación de la viabilidad celular y la formación de monocapa, y la unión celular. Tereftalato de polietileno (PET) filtros son transparentes, permitiendo la visibilidad bajo microscopía de contraste de fase, en contraste con los filtros de policarbonato translúcido. Para mejorar la fijación de las células, los soportes permeables pre-recubiertas con colágeno o fibronectina están disponibles comercialmente. Por otra parte, el diámetro de filtro, que se ajusta para diferentes placas de pocillos, puede influir en la permeabilidad, por lo que los diámetros más grandes (por ejemplo, en placas de 6 pocillos) tienden a aumentar la permeabilidad paracelular de la monocapa de células.
Una vez que se estableció un modelo de Transwell, incluyendo los créditosTE selección del tipo de célula, la composición del medio, y el filtro permeable, el estado de la monocapa celular se puede evaluar durante el cultivo y etapas experimentales usando la TEER. Sin embargo, los valores de TEER varían con 1) los factores innatos biológicos asociados con el tipo de células, la fuente y el número de pases, 2) las condiciones de cultivo, tales como las características antes mencionadas transwell, densidad de siembra, días en la cultura, la composición del medio y el pH; 3) Factores físicos , tales como la temperatura, el volumen de los medios de comunicación, programa de muestreo, y el grado de agitación / lavado, y 4) factores patológicos y / o químicos que modulan la integridad celular de unión (por ejemplo, citoquinas, las células inmunes, estrés oxidativo, aditivos farmacológicos, etc) 10, 16,17. Debido a los diversos factores biológicos y ambientales que afectan TEER, un valor mínimo de referencia que indica la formación de barrera debe ser establecida para cada sistema de la supervisión periódica de TEER durante el periodo de cultivo y después de las manipulaciones experimentales. VirginiaLúes que se consideran adecuadas para la formación de la barrera, que pueden variar entre 150-1,600 Ω × 2 cm 16, también dependen del tamaño de la sustancia a ser transportado de tal manera que paracelular pasiva de difusión de dicha sustancia está restringido, mientras que la TEER ≥ 350 Ω × cm 2 parece excluir la difusión pasiva de los CN relativamente grandes, tales como los que se muestran aquí (200 nm), esto puede no ser el caso para los sistemas de administración de fármacos más pequeñas, en las que se requieren monocapas más estrictos (por ejemplo ≥ 700 Ω cm × 2). Este valor de referencia también se puede evaluar usando los controles para la interrupción de la permeabilidad de la barrera, incluyendo H 2 O 2, penetrando péptidos, quelantes de calcio (por ejemplo, EDTA), proteínas quinasas y fosfatasas, y otras diversas moléculas reguladoras 25-27.
Complementario a TEER, existen muchos ensayos de permeabilidad para verificar integridad de la monocapa y evaluar transpo paracelularRT. Al igual que la albúmina, otras moléculas trazadoras-membrana impermeable de diversos tamaños, tales como manitol, lucifer amarillo, inulina y dextranos, que se puede acoplar con un UV, fluorescente o radioactivo para medir y comparar las tasas de permeabilidad (P app) de conocida valores de estos solutos. Al evaluar el transporte paracelular, es importante la utilización de una molécula de trazador que es más pequeño que el compuesto transportado en estudio. Por ejemplo, el transporte paracelular de 200 nm partículas abriría uniones intercelulares suficientes para causar fugas de paracelular, y aún así relativamente grandes moléculas más pequeñas, tales como albúmina usado en nuestro ejemplo. En contraste, el transporte paracelular de los vehículos de suministro de fármacos más pequeñas tales como dendrímeros (~ 5 nm) debe ser evaluada utilizando moléculas de <5 nm, tales como manitol. Por lo tanto, los estudios de fuga paracelular indican el tamaño de la abertura de unión de células, sin embargo, debido a largos tiempos de incubación no pueden identificar perturbaciones transitorias de Junc celularciones.
Otro modo de evaluar la integridad de barrera es a imagen de las uniones estrechas que conectan las células adyacentes. En este estudio, se immunostained occludin para microscopía de fluorescencia, pero varias otras proteínas presentes en la unión estrecha se puede utilizar para este análisis, incluyendo las proteínas transmembrana de la molécula de adhesión de conexiones (JAM), claudina, y las familias ocludina. En este sentido, manchado el dominio extracelular de pasar por alto un paso de permeabilización, pero dominios intracelulares también se puede teñir. Complementario a esto es el uso de los controles para la tinción no específica, utilizando anticuerpos secundarios fluorescentes solamente, la ausencia de uniones estrechas (en este caso, se utilizaron células con una monocapa mostrando bajo TEER), o la interrupción de uniones estrechas con los agentes de unión que modulan enumeradas anteriormente.
En nuestro ejemplo del transporte transepitelial usamos NCs ICAM-1-dirigido, pero el sistema transwell también acomoda el transporte de otra formulación vehículo de la drogas, compuestos terapéuticos y de diagnóstico, compuestos innatas que se encuentran en el cuerpo, o una combinación de los anteriores, con las implicaciones valiosas para estudios o comprensión de las vías fundamentales clínicos. Los métodos que describimos para cuantificar el transporte a través de monocapas de células implican etiquetado radioisótopo del agente de dirección o de carga terapéutica en la capa de Carolina del Norte, sin embargo, esta estrategia también se pueden utilizar para realizar un seguimiento de los CN con diversas composiciones químicas y estructuras, incluidos los polímeros lineales o ramificados, dendrímeros, partículas , micelas, liposomas, etc 4,5,28,29. Los diferentes isótopos (por ejemplo, 125 I, 3 H, 32 P, etc) están disponibles para cuantificar el transporte de una amplia gama de pequeñas y grandes moléculas: no sólo portadores de fármacos, sino también terapéuticos químicos y biológicos, sin afectar a la integridad funcional o estructural de el compuesto, a diferencia de las etiquetas fluorescentes voluminosos. El radiomarcado proporciona una mayor sensibilidad en comparación cuantitativa y la velocidada otras estrategias que miden el transporte, tales como electroforesis en gel, PCR, espectrometría de masas, HPLC, y espectrometría de fluorescencia. Esta etiqueta también se puede utilizar para determinar el grado de degradación (por ejemplo, proteína de agente de dirección y la carga en nuestro ejemplo) mediante la evaluación de contenido de yodo libre, que es rápido y preciso en comparación con los ensayos de actividad de la proteína alternativos, incluyendo espectrofotometría UV y Western blot. Sin embargo, ya que el yodo libre no refleja totalmente las alteraciones en la conformación o actividad que puede ocurrir en ausencia de degradación de las proteínas, los métodos alternativos anteriores se pueden usar para evaluar aún más la integridad de los materiales transportados. Además, cuando la administración de compuestos con radioisótopos libres en la cámara apical, no está claro si la etiqueta se encuentra en la monocapa de células y fracciones transportados resultan de la degradación de proteínas real o difusión de yodo libre desde el espacio apical. Para evitar esta limitación, la concentración NC apical puedese aplicarán durante un intervalo de tiempo breve para permitir la asociación a la monocapa de células, seguido de la eliminación del medio apical a cambio de medio fresco, y un período de caza para evaluar el transporte. Aunque una cantidad de radioisótopos libres de la piscina original puede filtrarse inicialmente en las otras fracciones, este valor se puede determinar a partir de muestras sin período de caza y se resta de las condiciones que implican un período de caza.
En términos de evaluación del dispositivo de transporte, los mismos métodos descritos para la validación de integridad de la monocapa (TEER, ensayos de fuga, y la tinción de la unión estrecha) se pueden utilizar para evaluar la ruta paracelular. Para el transporte transcelular, inhibidores farmacológicos de los determinantes implicados en el tráfico intracelular (por ejemplo, transferrina asociadas a las vías de clatrina, la toxina del cólera B asociada a las vías caveolar, etc) se puede utilizar, por lo que las concentraciones eficaces para inhibir específicamente esos determinantes necesidad de to no se han dilucidado para cada sistema. Alternativas a los inhibidores utilizados en nuestro estudio incluyen la clorpromazina y el agotamiento de potasio, específica para la endocitosis dependiente de clatrina, y la genisteína y la metil-β-ciclodextrina (MβCD), específico para caveolae mediada por la captación de 30. Otras estrategias que pueden evitar posibles efectos no específicos de inhibidores farmacológicos se dirigen hacia la co-localización de la carga transportada con estos determinantes utilizando fluorescencia o etiquetado de radioisótopos, la utilización de ligandos específicos como controles (por ejemplo, transferrina o la toxina B del cólera, como se indica más arriba), y siRNA para derribar la expresión de elementos reguladores de estas vías.
En este estudio, hemos demostrado ecuaciones para convertir los datos de radiactividad a varios parámetros que proporcionan información preliminar clave sobre el transporte transepitelial. Por ejemplo, el grado de transporte transepitelial se representa por CN o moléculas transportadas por célula, la eficacia de transporte de contenido que se une o entra en las células se representa por el porcentaje de los CN o moléculas asociadas a células transportados, y la tasa de transporte, que permite la comparación de la permeabilidad entre los diferentes solutos, está representado por P aplicación. Con el fin de entender el potencial de los CN específicas para la entrega a gran escala de agentes terapéuticos (por ejemplo, la dosis necesaria para la administración in vivo), estas ecuaciones pueden ser modificados para estimar los valores de transporte en una escala macroscópica. Por ejemplo, la cantidad de una carga terapéutico transportado por unidad de superficie de tejido intestinal (mg / cm 2), así como la entrega de potencial a través del tracto GI de un paciente puede estimarse a partir de las siguientes ecuaciones,
Carga transportada Misa / cm 2 de tejido = (basolateral CPM / Actividad Específica) / A
De carga transportada a través de la Misa del intestino delgado = [(basolateral CPM / Actividad Específica) × TA] / A
Avanzando a partir de insertos Transwell, modelos que reflejan mejor la complejidad fisiológica de transporte incluyen cámaras de Ussing "" y los dispositivos de microfluidos, que proporcionan el flujo de fluido dinámico y una cámara contenida que minimiza el contacto con el aire, como en los vasos sanguíneos. Estos modelos también permiten que los explantes de tejido a cultivar para estudios in vivo ex, antes de la validación in vivo 17,18.
En conclusión, los métodos utilizados en este estudio han aportado valiosa información preliminar con respecto al transporte de un sistema de suministro de fármaco modelo, en términos de efficieNCY, a través de monocapas de células. El uso de este modelo de cultivo celular se demostró el potencial de la plataforma nanotransportador ICAM-1-dirigida en el contexto de la administración de fármacos por vía oral, allanando el camino para posteriores estudios in vivo, sin embargo, puede ser modificado por otros sistemas que requieren transporte a través de las barreras celulares que se encuentran en la cuerpo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación del Instituto Médico Howard Hughes y de la Fundación Nacional de Ciencias para RG, y los fondos otorgados a SM por los Institutos Nacionales de Salud (Grant R01-HL98416) y la Asociación Americana del Corazón (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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