Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Summary

Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten.

Abstract

Sub-Mikrometer-Träger (Nanotransporter; NCs) verbessern die Wirksamkeit von Arzneimitteln durch Verbesserung der Löslichkeit, Stabilität, Zirkulationszeit, Targeting, und loslassen. Zusätzlich ist für sowohl die orale Verabreichung von therapeutischen NCs in den Kreislauf und den Transport von Blut in Gewebe, in denen eine Intervention erforderlich ist Laufen Zellbarrieren im Körper. NC Transport durch Zellbarrieren wird erreicht durch: (i) der parazellulären Weg, über vorübergehende Unterbrechung der Übergänge, die benachbarte Zellen oder (ii) die transzelluläre Route, wo Materialien durch Endozytose internalisiert, in dem Zellkörper transportiert und sezerniert verzahnen auf der gegenüberliegenden Zelloberfläche (transyctosis). Liefer über zelluläre Barrieren können durch Kopplung Therapeutika oder ihre Träger mit Targeting-Mittel, die spezifisch an Zelloberflächenmarker in Transport beteiligt binden erleichtert werden. Hier stellen wir Methoden, um das Ausmaß und den Mechanismus der NC-Transport über ein Modell Zellbarriere, whi messenLm besteht aus einer Monolage von gastrointestinalen (GI) Epithelzellen auf einer porösen Membran in einem Transwell-Einsatz angewachsen. Bildung einer Permeabilitätsbarriere durch Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) transepithelialen Transport einer Kontrollsubstanz und Immunfärbung von tight junctions bestätigt. Als Beispiel sind ~ 200 nm NCs Polymer verwendet, das eine therapeutische Ladung tragen und mit einem Antikörper, der ein Zelloberflächen-Determinante zielt beschichtet. Der Antikörper oder das therapeutische Ladung mit ¹²⁵ I-Radioisotop zur Verfolgung markiert und etikettiert NCs mit der oberen Kammer über die Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume zugesetzt. NCs zu den Zellen und / oder an der darunterliegenden Kammer transportiert assoziiert erkannt werden. Messung von freiem ¹²⁵ I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion. Die parazellulären Weg ist durch die potenzielle Veränderung von NC Transport zu den oben beschriebenen Sperrparameter verursacht beurteilt. Transzellulären Transport is, indem sie die Wirkung der Modulation Endozytose und Transzytose Wege bestimmt.

Introduction

Zellbarrieren im Körper als Gateway zwischen der äußeren Umgebung und Innenfächer. Dies ist der Fall für die epitheliale Auskleidung Trennen des außen freiliegenden Oberfläche des Magen-Darm-Trakt (GI) und den Blutkreislauf ^1-3. Zellbarrieren auch stellen die Schnittstelle zwischen dem Blutstrom und dem Parenchym und zellulären Komponenten von Geweben und Organen. Dies ist der Fall für die innere endotheliale Auskleidung der Blutgefäße, wie beispielsweise Blut-Lungen-Schranke, Blut-Hirn-Schranke, etc. ^1. Die Fähigkeit, diese Zellbarrieren im Körper zu durchlaufen ist entscheidend für die effiziente Abgabe von therapeutischen und diagnostischen Mitteln in den Kreislauf und Gewebe / Organen, wo Eingreifen erforderlich ist.

Die Lieferung von therapeutischen oder diagnostischen Mittel zu verbessern, können diese Verbindungen in sub-Mikrometer Nanoträger (NCS) geladen werden. Diese Arzneimittelabgabeträger kann mit einer Vielzahl von formuliert werdenChemie und Strukturen des Drogen Löslichkeit, Schutz, Pharmakokinetik, Freigabe, ^4,5 und Stoffwechsel zu optimieren. Nanokristalle können auch mit Affinität oder Targeting-Einheiten (z. B. Antikörper, Peptide, Zucker, Aptamere etc.) funktionalisiert werden, um die Haftung zu Bereichen des Körpers, wo die therapeutische Wirkung benötigt wird ^2,6 zu erleichtern. Targeting von NCs Determinanten auf der Oberfläche der Zellbarrieren ausgedrückt kann der Transport noch weiter zu erleichtern, in und / oder über diese Auskleidungen ^2,6.

Die Rolle der selektiven Transport von Stoffen zwischen zwei Umgebungen erfordert bestimmte einzigartige Eigenschaften unter Zellschichten. Eine solche Funktion ist die Zellpolarität ist, wobei die apikale Membran, die das Lumen der Hohlräume hängt von der basolateralen Membran auf das Gewebe Interstitium orientiert, in Bezug auf Membranmorphologie und Zusammensetzung von Lipiden, Transporter, Rezeptoren und ^2. Ein weiteres Merkmal beinhaltet inter junctions, die benachbarte Zellen. Regulierung der Proteine, die Tight Junctions, insbesondere junctional Adhäsionsmoleküle (Staus), Occludine und Claudinen bilden, modulieren die Barrierefunktion, um selektiv zu ermöglichen oder nicht Transport von Substanzen zwischen den Zellen, wie parazellulären Transport bekannt, die den Durchgang von Material aus dem Lumen der basolateralen Raum ^3. Bindung von vielen natürlichen und synthetischen Elementen (Leukozyten, Moleküle, Partikel, und Wirkstoffabgabesysteme), um Zellbarrieren im Körper Zellöffnung Übergang zu induzieren, die flüchtig und relativ harmlose oder mehr verlängert werden kann, und daher unsicher Zutritt unerwünschten Substanzen über die Barriere ^2,5,7-9. Folglich kann dieser Weg durch das Messen der transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) und passive parazelluläre Diffusion von Molekülen (hierin als parazelluläre Leckage) bewertet werden, wobei verringerten Widerstand auf einen elektrischen Strom oder eine erhöhte parazelluläre Leckage eines inert Verbindung in der basolateralen Raum geben Eröffnung der Zellverbindungen, bzw. ^5,10,11. Um diese Verfahren zu ergänzen, kann jeder der oben aufgeführten tight junction-Proteine ​​gefärbt werden, um ihre Integrität zu beurteilen, wo Färbung sollte an den Zell-Zell-Grenzen auf der ganzen Peripherie der Zelle konzentriert ^5,10,12 erscheinen.

Alternativ Arzneimittelabgabesystemen, die spezifische Zelloberflächen-Determinanten, wie diejenigen, die Clathrin-beschichteten Vertiefungen oder kolbenförmigen Einstülpungen Membran genannt Caveolae assoziiert Ziel kann vesikuläre Aufnahme in die Zellen durch Endozytose auszulösen, wodurch ein Weg für die Arzneimittelabgabe zu intrazellulären Kompartimenten ^{5, 13.} Darüber hinaus kann die Endozytose von Vesikeln mit dem Menschenhandel über die Zellkörper für die Freigabe an der basolateralen Seite, ein Phänomen, wie transyctosis bekannt oder transzellulären Transport ¹⁴ führen. Daher kann die Kenntnis der Kinetik und Mechanismus der Endozytose verwendet, um intrazelluläre ein auszunutzennd transArzneimittelAbgabe, die einen relativ sicheren und kontrollierten Art der Verabreichung bietet gegenüber den parazellulären Weg. Der Mechanismus der Endozytose kann mit Modulatoren der klassischen Wege (Clathrin-und Caveolin-vermittelte Endozytose und Makropinozytose) oder nicht-klassischen Wege ausgewertet werden ((CAM)-vermittelte wie bei der Zelladhäsionsmolekül Endozytose) ^5,13,15 .

Während intrazellulären Transport ist oft in Standard Brunnen oder Deck studiert, das Fehlen einer basolateralen Fach schließt Zellpolarisation und die Fähigkeit, den Transport durch Zellschichten zu untersuchen. Um dieses Hindernis zu überwinden, hat den Transport über lange Zellmonoschichten untersucht mit Transwell-Einsätze ^10,11,16,17, die aus einem oberen (apikal) Kammer, einem porösen durchlässige Membran, wo Zellen befestigen und bilden eine dichte Monoschicht bestehen, und eine untere worden (basolateralen) Kammer (Abbildung 1). In dieser Konfiguration kann der Transport in die gemessen werdenapikal-zu-basolateral-Richtung durch die Verabreichung einer Behandlung in der oberen Kammer, nach dem Transport durch die Zellmonoschicht und der darunterliegenden porösen Membran, und schließlich das Sammeln des Mediums in der unteren Kammer für die Quantifizierung des transportierten Materials. Transport in der basolateralen-to-apikal kann auch durch anfängliche Verabreichung in die untere Kammer und die anschließende Sammlung aus der oberen Kammer ^5,10,12,16 gemessen werden. Es gibt verschiedene Techniken, um die Bildung der Permeabilitätsbarriere auf Transwells, einschließlich TEER und parazellulären Transport-Assays zu überprüfen, wie oben beschrieben. Darüber hinaus kann das permeable Filter auf denen Zellen kultiviert werden zur Bildanalyse (z. B. durch Fluoreszenz, konfokale, Elektronenmikroskopie) entfernt werden, wie weitere Validierung der Zellmonolayer-Modell sowie dem Transportmechanismus. Auswahl des Membrantyps, die in unterschiedlichen Porengrößen, Materialien und Oberflächen verfügbar ist, hängt von verschiedenen factors wie die Größe von Stoffen oder Gegenständen, die transportiert werden, Zelltyp und Bildgebungsverfahren ^16,18-20. Transwell-Einsätze im Vergleich zu komplexen Säugersystemen als Volumina der Kammern und der Zelloberfläche sind bekannte Konstanten gesteuerte und genaue Quantifizierung der Transport erleichtert auch. Während viele Faktoren bei der in-vivo-Lieferung beteiligt sind beseitigt, einschließlich der Anwesenheit von Darmschleim-, Scher-Stress, Verdauungsenzyme, Immunzellen etc., bietet dieses kleinen Maßstab in vitro-Modell nützlich vorläufige Informationen über Transport.

Als ein Beispiel, um die Anpassung dieser Verfahren an NC Transport durch Zellbarrieren ^10,11,16,17 studieren zu verdeutlichen, beschreiben wir hier einen Fall, wo das Potenzial für die NC-Transport über die GI Epithel wurde durch die Beurteilung Gang eines Drug-Delivery-Modell modelliert System durch eine Monoschicht von menschlichen epithelialen kolorektalem Adenokarzinom (Caco-2-Zellen). Hierzu cEllen wurden in Transwell-Einsätze, auf einem 0,8 &mgr; m Poren Polyethylenterephthalat (PET)-Filter (6,4 mm Durchmesser), die transparent ist und kann zur Mikroskopie verwendet werden. Der Status der Permeabilitätsbarriere durch Messen TEER, apikale zu basolateralen Transport einer Kontrollsubstanz, Albumin und Fluoreszenzmikroskopie Visualisierung eines Elements der tight junctions, Occludinproteins validiert. Ein Modell des Ziel NC Polymer verwendet wird, die aus 100 nm, Polystyrol nicht biologisch abbaubaren Nanopartikel. NCs durch Oberflächenadsorption mit einem Targeting-Antikörper allein oder einer Kombination aus einer Targeting-Antikörper und einem therapeutischen Ladung, wobei jede Komponente mit ¹²⁵ I-Radioisotop zur Verfolgung markiert werden beschichtet. Im gewählten Beispiel erkennt interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) der Antikörper, exprimiert ein Protein auf der Oberfläche von Epithelzellen GI (und anderer Zellen), von dem gezeigt wurde, um die intrazelluläre und transzellulären Transport o erleichtern f Wirkstoffträger und ihre Ladungen ^21. Die Ladung ist alpha-Galactosidase (α-Gal), ein therapeutisches Enzym zur Behandlung der Fabry-Krankheit, einer genetischen lysosomalen Speicherkrankheit ²² verwendet.

Die beschichteten Nanokristallen, von etwa 200 nm groß sind, um die apikale Kammer über der Zellschicht für unterschiedliche Zeiträume, gegeben und bei 37 ° C inkubiert, wonach ¹²⁵ mit der Zell-Monoschicht und / oder die zugehörige kann ich auf NCs erkannt werden auf die basolaterale Kammer unter den Zellen transportiert. Zusätzliche Bestimmung von freiem ¹²⁵ I ermöglicht Subtraktion des abgebauten Fraktion und Schätzung von beschichteten NC Transport. Der Transportmechanismus wird durch die Veränderungen der Durchlässigkeit der Barriere in Bezug auf den parazellulären Weg, durch den oben beschriebenen Parametern, während transzellulären Transport wird durch die Veränderungen der Transportwege bei der Modulation der Endozytose und Transzytose bestimmt beurteilt.

NHALT "> Diese Methoden liefern wertvolle Informationen über die Zellbarriere Modelle, das Ausmaß und die Geschwindigkeit des Transports von Drug-Delivery-System, und den Mechanismus solcher Transport, insgesamt die Auswertung des Potentials für die Arzneimittelabgabe über zelluläre Barrieren.

Protocol

1. Kultivieren einer Zellmonolayer in Transwell-Einsätze

1. In einem sterilen, Sicherheitsstufe 2 Zellkultur Kapuze, legen 0,8 mm Poren PET Transwell-Einsätze in eine 24-Well-Platte (4 Wells pro Bedingung für statistische Signifikanz) mit einer Pinzette. Alle Materialien in die Abzugshaube mit Ethanol sterilisiert werden.

Hinweis: Die Porengröße der Filter muss in Übereinstimmung zu der mittleren Größe der verwendeten NC ausgewählt werden, um den Transport durch die Membran zu ermöglichen. Auch für statistisch signifikante Ergebnisse zu jeder experimentellen Bedingung erfordert ein Minimum von vier Wiederholungen (Vertiefungen) in dem gleichen Experiment, und mindestens 3 unabhängigen Experimenten.

2. Vorbereitung Zellkulturmedium, das DMEM-Medium mit 4,5 g / l Glucose, 15% fötalem Rinderserum und 1% Pen-Strep ergänzt und Hitze auf 37 ° C in einem Wasserbad.
3. Verdünnen humanen epithelialen kolorektalen Adenokarzinom (Caco-2-Zellen) in Zellmedium und Ort200-400 ul der Zell-Lösung in die obere (apikale) Kammer des Transwell-Einsatzes, bei einer Dichte von 1,5 x 10 ⁵ Zellen / cm ^2. Füllen Sie den unteren (basolateralen) Kammer mit 700 bis 900 ul Zellmedium.
4. Kulturzellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ und 95% Feuchtigkeit für 16-21 Tage, Ersetzen des Mediums in der oberen und unteren Kammer alle 3-4 Tage unter Verwendung der in Schritt 1.3 angegebenen Mengen. Medium ersetzen in der folgenden Reihenfolge, um den Druck oben (statt unten) die Zellmonolayer zu erhalten: saugen das Medium aus der unteren Kammer, saugen das Medium aus der oberen Kammer, die obere Kammer mit frischem Medium zu füllen, und die untere Kammer mit füllen frisches Medium.

2. Validierung des GI Epithelial Durchlässigkeit Barrier Mit transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER) und Immunfärbung von Tight Junctions

1. Für Kurzzeitspeicher (weniger als 2 Wochen), tauchen STX100 Elektroden in einem Elektrolyt Lösungennung (0,1-0,15 M KCl oder NaCl). Verbinden des Elektrodenkabels an den Anschluss auf der Elektrode EVOM Volt-Ohm-Meter, so dass das System intern kurzgeschlossen wird und die Elektrode Symmetrie beibehalten wird. Für langfristige Lagerung, spülen Sie mit dH ₂ O und an einem trockenen, dunklen Zustand.
2. Um die Elektroden zu sterilisieren, tauchen in Ethanol für 15 min und an der Luft trocknen für 15 Sekunden. Alternativ können die Elektroden in einem UV-Haube gelagert werden. Spülen Sie die Elektroden in eine sterile Elektrolytlösung (Phosphatpuffer Kochsalzlösung, PBS) oder 0,1-0,15 M KCl oder NaCl-Lösung, vor jeder Widerstandsmessung.
3. Mit dem Volt-Ohm-Meter an den Widerstandseinstellung gesetzt, vertikal platzieren Elektroden in eine gut mit der Transwell-Einsatz, mit der kurzen Elektrode in der oberen Kammer und der langen Elektrode in der unteren Kammer zu berühren den Boden des Brunnens. Sobald die EVOM Wert fest den Widerstandswert (in Ohm angegeben; Ω) für jeden gut.
4. Berechnen Widerstand (resistanCE Bereich normalisiert; Ω × cm ²⁾ der Proben durch Subtrahieren Hintergrund Widerstand (TEER von Transwell-Einsätze ohne Zellen) und Multiplizieren mit der Membranoberfläche. Widerstandswerte werden am häufigsten in der Literatur berichtet. (Siehe Diskussion)
5. Wiederholungsmessungen alle 1-2 Tage bis TEER-Werte zu einem Maximum und Plateau, was die Bildung der Permeabilitätsbarriere, was typischerweise 2-3 Wochen ab dem Zeitpunkt der Zell Flechten. Plateau TEER-Werte und Zeit notwendig, um die Integrität der Barriere erreichen können je nach Zellpassage Zahl variieren.
6. Um die Gegenwart von Tight Junctions in der Zellmonoschichten mit hoher TEER (gleich oder höher als der Schwellenwert für die Barrierebildung) Verifizierung fixieren Zellen durch Inkubation mit kaltem 2% igem Paraformaldehyd für 15 min. Dann waschen Zellen mit PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur mit 1 &mgr; g / ml Anti-Occludin. Waschen der Zellen einmal mit PBS und Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur mit 7,5 ug / ml fluorescently-markierten Sekundärantikörper. Verwenden Brunnen mit niedrigen TEER als negative Kontrolle für barriere Bildung.

Anmerkung: Als Ersatz für Anti-Occludin-Antikörper können alternativ zu tight junction-Proteine ​​verwendet werden.

7. Vorsichtig herausschneiden der Filtermembran, auf dem die Festmonoschicht angebracht ist, und montieren Sie auf Objektträger für die Bildgebung mit Epi-Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie.

3. Auswertung transepitheliale Transport Gezielte Carriers

1. Beschriftung der Targeting-Antikörper (Maus-monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1, anti-ICAM, in diesem Beispiel) mit ¹²⁵ I, wie zuvor beschrieben ^7. Bradford-Test verwenden, um die Proteinkonzentration und eines Gammazählers, um zu ermitteln ¹²⁵ I Inhalt des Antikörpers zu bestimmen, dann die Berechnung der spezifischen Aktivität in Zählungen pro Minute (CPM) / mg eines markierten Antikörpers.

Hinweis: Um die Spezifität zu kontrollieren, wiederTorf, das Verfahren durch Kennzeichnung Maus-IgG, die verwendet werden, um nicht gezielte beschichteten NCs bereiten wird. Um den Transport eines therapeutischen Fracht zu untersuchen, in diesem Beispiel das Verfahren wiederholen Beschriftung der Ladung, zB alpha-Galactosidase (α-Gal). Alternativen können für das Targeting-Mittel, nicht-spezifische Kontrolle oder therapeutische Ladung verwendet werden. Alternative Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um Verbindungen zu kennzeichnen und die Schätzung der Konzentration des markierten Gegenstücken sein.

2. Paare der markierte Targeting-Antikörper (anti-ICAM in unserem Beispiel) auf die Oberfläche der Nanokristalle. In diesem Beispiel inkubieren Polystyrol Nanokügelchen (100 nm Durchmesser) 1 h bei Raumtemperatur mit ¹²⁵ I-Anti-ICAM zu Oberfläche Adsorption zu ermöglichen, wie beschrieben ^7.

Hinweis: Für die nicht-spezifische Steuerung verwenden ¹²⁵ I-IgG. Um den Transport einer Ladung verfolgen, verwenden eine Kombination von Targeting-Antikörper und ¹²⁵ I-markiertem Ladung (α-Gal in unserem Beispiel).

3. Zentrifugieren bei 13.000 g für 3 min und entfernen Sie die nicht-beschichteten Pendants in den Überstand durch Aspiration. Das Pellet enthält, beschichteten NCs mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS durch Pipettieren und beschallen bei geringer Leistung, um mögliche Partikel-Aggregate (20-30 kurze Impulse) zu stören.
4. Für NC-Charakterisierung, messen Größe, Polydispersität und ζ-Potential der beschichteten Partikel mittels dynamischer Lichtstreuung (nach Anbieter Anweisungen) und quantifizieren die Anzahl der ¹²⁵ I-markierten Targeting-Antikörper-Moleküle (zB Anti-ICAM) auf der Partikeloberfläche mit einer Gamma-Zähler.

Anmerkung: Diese Methoden können für die unspezifische und therapeutischen Gegen wiederholt werden. Die Größe der beschichteten Teilchen im Bereich um 200 nm auf.

5. Add ¹²⁵ I-Antikörper NCs (zB ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs, 56 nCi / ml) in die obere Kammer oberhalb konfluenten Caco-2-Monoschichten mit TEER &# 8805; 350 Ω x cm ² (siehe Diskussion) über Hintergrund (16-21 Tage nach der Aussaat). Inkubieren bei 37 ° C für eine oder mehrere gewünschte Zeitintervalle. Messen TEER (Abschnitt 2.3) vor und nach Inkubation, um die Auswirkungen von Nanokristallen auf der Permeabilitätsbarriere beurteilen.

Hinweis: Dieses Verfahren kann für die unspezifische und therapeutischen Gegen wiederholt werden.

6. Sammeln Sie das Medium aus den oberen und unteren Kammern und einmal waschen Sie sie mit 0,5 ml DMEM bei 37 ° C (obere Kammer) oder 1 ml dH ₂ O (untere Kammer). Sammeln Sie die Waschanlagen für die Messung der Gesamtradioisotop Inhalt mit einem Gamma-Zähler.
7. Zur Messung der Zellfraktion, die auszuschneiden lässigen Filter, z. B. mit einer Rasierklinge um die Kanten geschnitten, und Inkubieren in einem Gamma-Zählrohr mit 1% Triton X-100 für 10 min (um die Zellinhalte freizusetzen), bevor Messzelle -assoziierten Gesamtradioaktivität.
8. Zur Messung ¹²⁵ I wiederNCS beim Transport oder aufgrund möglicher Abbau ersten Mischung 300 ul Probe (von der oberen, unteren oder Zellfraktionen) mit 700 ul 3% BSA in PBS und 200 ul Trichloressigsäure (TCA) vermietet. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min. Inzwischen ist diese Zeit, messen Sie die Radioaktivität dieser Probe in einem Gamma-Zähler.
9. Zentrifuge TCA Proben bei 3000 g für 5 min auf intakte Protein (Pellets) aus dem abgebauten Proteins oder ¹²⁵ I-Fraktion (Überstand) zu trennen. Quantifizierung der Radioaktivität des freien ¹²⁵ I-Fraktion und subtrahieren Sie diesen Wert von der Gesamtradioaktivität gemessen vor der Zentrifugation. Dies wird die Menge an markiertem Protein, das nicht abgebaut wird.

4. Mechanismus der transepitheliale Transport Gezielte Nanotransporter

1. Label-Albumin mit ¹²⁵ I, wie in Abschnitt 3.1 beschrieben und zuvor berichtet ^sieben.

Anmerkung: Albumin ist ein 66,5kDa-Protein, und daher eine relativ große Substanz. Obwohl ein gültiges Steuer für passive Transport größerer Gegenstände (welche hier z. B. 200 nm NCs), sollte mit kleineren inerten Tracer-Moleküle, wenn das Studium Transport von kleineren Wirkstoffträger ersetzt werden (siehe Diskussion).

2. Zu beurteilen, parazellulären Transport mit Albumin para Leckage Kultur Caco-2-Monoschichten auf Transwell-Einsätze, wie oben beschrieben.
3. Um die obere Kammer Medium über der Zellschicht, fügen Sie entweder allein ¹²⁵ I-Albumin (Negativkontrolle, die die Basisniveau von Leckagen) oder ¹²⁵ I-Albumin und nicht-radioaktiv markierten Antikörper-bezogene NCs (wie in Abschnitt 3.5 beschrieben). Bei 37 ° C für den gewählten Zeitintervall (s), die die untersuchten bei der Prüfung von NC Transport entsprechen sollte. Messen Sie TEER (Abschnitt 2.3) vor, während und nach der Inkubation, dann sammeln Sie alle Fraktionen für insgesamt ¹²⁵ I und ¹²⁵ I frei Messungen wie angegeben. Abschnitt 3 Hinweis: Die gleichzeitige Zugabe von ¹²⁵ I-Albumin und nicht-radioaktiv markierten Kontroll-IgG NCs kann als Kontrolle verwendet werden.
4. Als positive Kontrolle für die Öffnung der interzellulären Kontaktstellen, fügen Zellmedien, enthaltend 5 mM H ₂ O ₂ zu der oberen und unteren Kammern des Transwell-Einsatzes, und bei 37 ° C für 30 min. Dann messen TEER (Abschnitt 2.3), und fügen Sie ¹²⁵ I-Albumin in die obere Kammer für die ausgewählten Zeitintervallen. Messen Sie TEER zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubationszeit zu TEER Wertverfall von H ₂ O _2-induzierte Öffnung der Zellverbindungen verursacht zu identifizieren.
5. In parallelen Experimenten, bewerten transzellulären Transport, auch Transzytose, der ¹²⁵ I-bezogene NCs durch Inkubation konfluenten Caco-2-Monoschichten mit entweder 50 &mgr; M monodansylcadaverine (MDC; Inhibitor der Clathrin-vermittelte Endozytose), 1 ug / ml filipin (Inhibitor caveolare vermittelte Endozytose), 0,5 &mgr; M Wortmannin (Inhibitor der Phosphatidylinosit-3-Kinase [PI3K], in Makropinozytose beteiligt sind) oder 20 &mgr; M [5 - (N-Ethyl-N-isopropyl) Amilorid] (EIPA, Inhibitor Makropinozytose und CAM-vermittelte Endozytose ^15).

Hinweis: ¹²⁵ I-IgG NCs und ¹²⁵ I-Albumin als negative Kontrollen für die Wirkung dieser Inhibitoren verwendet werden, und andere Verfahren (z. B. siRNA-Techniken) können weitere selektive Hemmung bereitzustellen.

6. Messen TEER (Abschnitt 2.3) vor, während und nach der Inkubation der Zellen mit Inhibitoren und radioaktiv markierten Materialien, als zusätzliche Kontrolle für die Wirkung der Inhibitoren auf die Monoschicht Durchlässigkeit.

Representative Results

Validierung der Zellmodell zu transepithelialen Transport von gezielten NCs studieren, Fig. 2 zeigt, dass die Caco-2-Zellmonolayer plattiert bei einer Dichte von 1,5 × 10 ⁵ Zellen / cm ² Konfluenz erreichten ~ 12. Tag gehalten und Mono Integrität bis zu Tag 18, von TEER (2A) angegeben. Dies wurde durch die Anwesenheit von Occludin-positiven Tight Junctions (2B) in Monoschichten mit hohen TEER (390 Ω × cm ^2, Tag 14) bestätigt, im Vergleich zu schlechten tight junction Kennzeichnung bei niedrigen TEER (17 Ω x cm ^2, Tag 5 ).

Verfolgung der radioaktiven Markierung auf NC Elemente bestimmt die Gesamtmenge dieser Komponenten (NC Targeting-Antikörper oder Fracht) zunächst auf der apikalen Kammer gegeben, die Zelle zugeordnet Fraktion und ihr Anteil an der basolateralen Seite transportiert. Diese Werte können verwendet werden, um verschiedene Parameter, die NC Transport beschreiben in eine berechnenrelevanter Weise, insbesondere nach Abzug der freien ¹²⁵ I Inhalt jeder Fraktion, die degradierten Kollegen darstellt. Zum Beispiel die Anzahl der Antikörper-Moleküle, Fracht-Moleküle oder assoziierten NCs, die sich quer zur Zellschicht berechnet, um absolute Transport schätzen. Auch der Anteil der Moleküle oder NCs, die zur basolateralen Seite mit Bezug auf die Gesamtzahl von Molekülen oder Nanokristallen auf die Zell-Monoschicht assoziiert transportiert wird, schätzt die Effizienz des Transport. Schließlich wird der scheinbare Permeabilitätskoeffizient (P _app), ein Standard-Parameter für die Transportgeschwindigkeit, abgeschätzt werden. Diese Parameter werden wie folgt berechnet:

Moleküle befördert oder transportiert NCs = CPM _{basolateralen} × (M _hinzugefügt oder NC _aufgenommen / CPM _{hinzugefügt)}
% Moleküle oder transportiert NCs = 100 x [CPM _{basolateralen} / (CPM _{basolateralen} + CPMZellfraktion)]
P _app (cm / s) = (CPM _{basolateralen} × Vol.) / (A × t × CPM _{hinzugefügt)}

CPM, wo sind die ¹²⁵ I zählt pro Minute in die obere Kammer aufgenommen (CPM _{aufgenommen), fügte} der Zellmonolayer-Fraktion (CPMcell Fraktion) oder die untere Kammer (CPM _{basolateralen)} und NC oder Moleküle _aufgenommen sind die Anzahl der NCs oder Moleküle zunächst in die obere Kammer gegeben ist, A die Fläche der Filtermembran (cm ^2), vol. das Volumen des Mediums in der oberen Kammer (ml), und t die Zeit der Inkubation (en).

In unserem Beispiel, wenn das radioaktive Isotop wird die Beschriftung der Zielantikörper zeigt diese Analyse das Ausmaß und die Effizienz des Verkehrs in Bezug auf Antikörper oder NCs transportiert pro Zelle und den Prozentsatz der Zellmonolayer-assoziierten Antikörpern oder NCs, die transportiert wurden (Abbildung 3A und 3B ), wie wirll als die Transportrate in Bezug auf die _P-App (3D). Diese Parameter, in unserem Beispiel für die ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs geschätzt wurden mit denen von Kontroll ¹²⁵ I-IgG-Nanokristallen, die Transporteffizienz relativ zu einem Nicht-Zielgegen (3C und 3D) zeigen, verglichen.

Wenn die radioaktive Markierung auf der NC Ladung aufgenommen, die beschriebenen Parameter beziehen sich auf den Transport der Ladung, die in unserem Beispiel ist α-Gal-Enzyms zur Behandlung einer genetischen lysosomalen Speicherkrankheit als Fabry-Krankheit (Tabelle 1) bekannt ist. Zusätzlich zur Berechnung NC Transport durch Verfolgung der Ladung, transepithelialen Lieferung dieses therapeutischen Enzyms kann abgeschätzt werden, z. B. indem er als Moleküle oder Masse von α-Gal pro Zelle transportiert.

Schließlich schreibt diese Methode die Transportweges auf den parazellulären Weg oder dietranszelluläre Route. Zum Beispiel in unserem Beispiel reduziert EIPA Transport von ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs über Caco-2-Zellmonoschichten (4A), während MDC, Filipin und Wortmannin nicht Transportebenen verringern bezüglich der Steuerzustand (kein Inhibitor ). Dies deutet darauf hin, dass die Anti-ICAM NCs nutzen CAM-vermittelte Endozytose für transzellulären Transport, aber nicht Clathrin-, caveolare-oder Makropinozytose bezogenen Transzytose. Außerdem wurde unter Verwendung von parazellulären Transport von TEER-Messungen (4B) und eine Albumin passiven Transport (4C) ausgeschlossen, wodurch eine Abnahme der TEER und eine Erhöhung der parazellulären Albumin Leckage in die untere Kammer während des Transports von Anti-ICAM NCs müssten angegeben Störung der interzellulären Verbindungen. Jedoch Inkubation mit Anti-ICAM NCs nicht verändern TEER oder ¹²⁵ I-Albumin para Leckage über einen Zeitraum von 48 Stunden, ähnlich wie IgG NCs, die nicht befördert werden, zu steuern. Wieeine positive Kontrolle für die Öffnung der Zellkontakte und parazellulären Transport, H ₂ O ₂ verringert TEER zu dem Grundniveau und deutlich verbessert ¹²⁵ I-Albuminverlusts zur basolateralen Kammer.

Fig. 1 ist. Schematische Darstellung des transepithelialen Transport von gezielten Nano über eine Magen-Darm-Epithel-Modells. (A) als Plattform, um transepithelialen Transport studieren, sind Caco-2-Zellmonoschichten auf Transwell-Einsätzen kultiviert, bis eine dichte Monoschicht gebildet wird (16-21 Tage nach der Aussaat, TEER ≥ 350 Ω × cm ² über Hintergrund). Ein Beispiel für eine Arzneimittelabgabeträger, wie beispielsweise ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs, ist mit dem oberen (apical) Kammer über der Zellschicht zugegeben, um den Transport durch Zellen und durch die darunterliegende poröse Membran zu untersuchen.Das Medium, in der unteren (basolateralen) Kammer wird dann für die Quantifizierung der transportierten Material gesammelt. (B) Der Transport durch die Zellschicht erfolgt entweder über eine parazellulären oder trans / transcytosis Route. Von Ghaffarian et al wiedergegeben., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen

2. Caco-2-Monoschichten als Modell für transepithelialen Transport. Caco-2-Zellen wurden auf Transwell-Einsätze mit 1,5 × 10 ⁵ Zellen / cm ² gezüchtet. (A) transepitheliale elektrischen Widerstand (TEER) wurde gemessen, um Mono Integrität zu beurteilen. N = 3; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. (B) Fluoreszenzmikroskopie von tight junctions immun mit Anti-Occludin und Texas Red-markierten Sekundärantikörper, an den Tagen 5 oder 14 (Tief gegenüber hohen TEER-Werte, beziehungsweise). Von Ghaffarian et al wiedergegeben., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen

3. Transport von Anti-ICAM Nanoträgern in Caco-2-Zellmonoschichten. Konfluente Caco-2-Monoschichten auf Transwell-Einsätze gezüchtet wurden mit ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCS oder ¹²⁵ I-IgG NCs zur apikalen Kammer gegeben, inkubiert. (AC) ¹²⁵ I-Gehalt in der basolateralen Kammer wurde zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen, um die Menge der NCs transp berechnenorted pro Zelle (siehe Repräsentative Ergebnisse). (B) Prozentsatz transportiert NCs wurde als das Verhältnis von Trägern in der basolateralen Fraktion gefunden, daß in den kombinierten basolateralen und Zellfraktionen berechnet. (D) Scheindurchlässigkeitskoeffizienten (P _app) wurden berechnet, wie in Repräsentative Ergebnisse beschrieben, was Transportgeschwindigkeiten von ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs oder ¹²⁵ I-IgG NCs. N = 4; Daten dargestellt als Mittelwerte ± SEM. Von Ghaffarian et al wiedergegeben., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen

4. Transportmechanismus für einenti-ICAM Nanoträgern in Caco-2-Monoschichten. (A) transzellulären Transport von ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs über konfluenten Caco-2-Monoschichten wurden bei 24 Stunden in Abwesenheit oder Gegenwart von 20 &mgr; M EIPA beurteilt, 1 ug / ml filipin, MDC 50 uM oder 0,5 uM Wortmannin. (B) TEER wurde während des Transports von ¹²⁵ I-Anti-ICAM NCs über Caco-2-Monoschichten gemessen, um den parazellulären Transport zu beurteilen. TEER-Werte in Abwesenheit von NCS als Kontrolle (gestrichelte Intervall markiert SEM des Mittelwertes) dargestellt. Inkubation mit 5 mM H ₂ O ₂ ist eine positive Kontrolle für die Öffnung der interzellulären Kontaktstellen. (C) Protein parazelluläre Leckage, gemessen als die scheinbare Permeabilitätskoeffizient (Papp) von ¹²⁵ I-Albumin Überqueren der Zellmonoschicht in Abwesenheit oder Gegenwart von 5 mM H ₂ O _2, IgG NCs oder Anti-ICAM NCs, wurde gemessen und berechnet, wie in Abbildung 3. Daten sind Shown als Mittelwerte ± SEM, n ≥ 4 ist. Von Ghaffarian et al wiedergegeben., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen

	Insgesamt NCs verbunden / Zelle	Intrazelluläre NCs / Zelle	Transportiert NCs / Zelle	Transportiert%	Transportiert α-Gal Moleküle / Zelle × 10 5	pg transportiert / Zelle × 10 -3	Papp (× 10 -8 cm / sec)
3 Stunden	663,4 ± 116,0	434,0 ± 76,8	243.6 ± 15,4	44,4 ± 6,7	1,8 ± 0,2	9,7 ± 1,2	8,1 ± 1,1
24-Stunden-	2024,8 ± 409,3	1218,9 ± 255,6	806,9 ± 164,1	40,6 ± 2,0	3,9 ± 0,5	21,3 ± 2,5	1,9 ± 0,4
NCs = Nano, α-Gal = α-Galactosidase; Gesamt NCs verbunden / Zelle = Intrazelluläre NCs / Zelle transportiert NCs + / Zelle;% Transportiert = (NCs transportiert / Gesamt NCs verbundenen) x 100, P app = scheinbare Durchlässigkeitskoeffizient (cm / s). Siehe Methode für die weitere Beschreibung dieser Parameter. Die Daten sind dargestellt als Mittelwert ± SEM (n = 8 Vertiefungen), (TNF-α-Caco-2-Zellen).

Tabelle 1. Transepithelialen Transport von α-Gal von Anti-ICAM Nano. Transzelluläre Transport von Anti-ICAM / ¹²⁵ I-α-Gal NCs über confließend Caco-2-Monoschichten wurde bei 3 Stunden und 24 Stunden beurteilt. Radioisotopen-Gehalts apikal, basolateralen und Zellfraktionen wurden in verschiedenen relevanten Verkehrswerte umgewandelt, wie in Repräsentative Ergebnisse beschrieben. Von Ghaffarian et al wiedergegeben., J. Controlled Rel.. 163 (1), 25-33 (2012).

Discussion

Unter Verwendung der oben diskutierten Verfahren kann ein Zellmodell für die Untersuchung der Zieltransport NCs über zelluläre Barrieren geschaffen werden, wie das für Caco-2-Epithelzellen, die relevant für die Bewertung der Verkehrs GI Lumen in dem Blut in dem Fall vorgesehen ist beispiels der oralen Medikamentenabgabesysteme. Kultivierung von GI epithelialen Zell-Monoschichten in Transwell-Einsätzen aktiviert Messung TEER und Fluoreszenz-Immunfärbung von tight junctions, um die Bildung einer Zelle Permeabilitätsbarriere bestätigen. Anschließend Markierung von Targeting und therapeutische Mittel mit ¹²⁵ I vorgesehen schnelle und empfindliche Quantifizierung der Ziel NCs in und über GI-Zellmonoschichten. Schließlich wurden mechanistische Studien mit endozytischen Inhibitoren, TEER und ein Albumin parazellulären Leckage-Test zu beurteilen, ob Transport durch eine Bläschen Route gegenüber einem parazellulären Weg tritt aufgebracht.

Ein wichtiger Parameter bei der Festlegung ähnliche Modelle is die Auswahl eines Zelltyps, der die physiologische Natur der untersuchten Zellbarriere reflektieren sollte. Verschiedenen Epithel-und Endothelzellen aus menschlichen oder tierischen Ursprungs sind im Handel erhältlich ^16,18-20. Diese können allein als einzelne Kulturen gezüchtet werden, wie hier beschrieben, oder als Co-Kulturen dieser Zellen mit anderen Zelltypen (z. B. Schleim sezernierenden Zellen, Immunzellen, Perizyten, etc.) ^16,18-20. In solchen Co-Kultur-Form kann Transwell-Einsatz Bedingungen moduliert werden, um die jeweiligen Wachstumsraten und Anforderungen für Differenzierungsfaktoren in den Zell Medien ^16,18-20 einzustellen. Zum Beispiel kann eine Blut-Hirn-Schranke Modell beinhalten Co-Kultivierung von Gehirnmikrovaskulären Endothelzellen und Astrozyten oder Perizyten auf der gegenüberliegenden Oberfläche des porösen Filters, und die jeweiligen Medien für jeden Zelltyp ist in jeder Kammer ¹⁹ angeordnet werden. Zusätzlich, abhängig von der Zelllinie kann extrazelluläre Matrixkomponenten werden reqfür eine wirksame Zellhaftung an der porösen Membran ^18-20 uired. Es ist wichtig zu bedenken, dass jedes einzelne Modell werden verschiedene Grundniveaus in Bezug auf Durchlässigkeit Barriere-Parameter und die Preise und Beförderungsmechanismus zu machen, damit die Kontrollwerte zu erhalten und diese Methoden für jede Situation optimiert müssen.

Transwell-Einsätze wie den hier beschriebenen, sind weit verbreitet, um den Transport von Materialien über Zellmonoschichten von der apikalen in eine basolaterale Fach oder umgekehrt ^{5,10-12,16,17} studieren. Dies kann nicht durch die Kultivierung von Zellen auf der klassischen Brunnen oder Deckgläsern erreicht werden, da solche Systeme nicht entgegen, diese Form der Transport, da sie nicht bieten zwei unabhängige Fächer und kann somit eine realistische Sicht der Zellsortierung nicht geben. Zum Beispiel können Materialien natürlich nach Entlassung aus der basolateralen Membran bestimmt, andere Zell Fächer in einem Deckglas Modell überbrückt werden, so dass es schwierig ist, resolve den Mechanismus der transzellulären Transport. Darüber hinaus, im Gegensatz zu Deckgläser, die Transwell-Konfiguration führt zu physiologisch relevante Merkmale mit der Zelldifferenzierung und der Membran Polarität ^10,11,16-19 verbunden. Zum Beispiel, Caco-2-Zellen auf Transwells gewachsen zeigen die Eigenschaften von reifen Enterozyten, einschließlich der Anwesenheit von Mikrovilli und tight junctions, Kuppelbildung und die Produktion von Enzymen Bürstensaummembran ^10,11,17. Andere Parameter können einen physiologisch relevanten Phänotyp, wie Scherbeanspruchung bei der GI-Epithelzellen (z. B. Schleimstrom und Kontraktionsbewegungen) und vaskulären endothelialen Zellen (z. B. Blutfluss), die mit Rühren in Transwell angewendet werden kann oder Pumpen ¹⁰ veran ^{, 16,} und Co-Kulturen, die erforderlichen Wachstums-und Differenzierungsfaktoren für bestimmte Zelltypen ^16,18-20 erzeugen. Dennoch muss man bedenken, dass Zelllinien unterscheiden sich oft von Zellen im Körpergewebe, E. G. Sie können bestimmte Faktoren auf verschiedenen Ebenen zum Ausdruck bringen und damit präsentieren vielfältige Funktionen und Vorschriften. Zum Beispiel, Caco-2-Zellen enthalten, werden nicht alle Transportproteine ​​und Enzyme für die Aktivierung und den Transport von oralen Therapie in vivo, wie CYP3A4, einem Arzneimittel-metabolisierenden Enzyms ^10,17,23 erforderlich. In diesen Fällen kann die Zelllinie Subklone, Transfektion oder Zugabe von Transkriptionsmittel verwendet modulieren die Zelllinie sein, um physiologische Bedingungen ^17,23,24 besser widerspiegeln.

Bei der Auswahl eines optimalen Transwell Modell müssen die verschiedenen Merkmale der durchlässige Filter berücksichtigt werden. Durchlässige Filter sind in verschiedenen Porengrößen reichen von 0,4 bis 8 um, und darf die Größe der transportierten Fracht aufzunehmen. Beispielsweise werden kleinere Porengrößen (0,4-3 &mgr; m) typischerweise für die Untersuchung der Transport von kleinen chemischen Verbindungen verwendet, während Poren 3 um oder mehr werden für die Zellinvasion, che verwendetmotaxis und Motilität Studien, in denen Mikroben-, Immun-, und wandernden Zellen transportiert werden. Porengröße und Dichte wirkt sich auch auf die Zelldichte und die Differenzierung, da einige Zellen können durch die Poren nach Aussaat zu migrieren, Monolayerbildung ausschließt. Zusätzlich ist das Material der durchlässigen Träger Einflüsse Abbildungsklarheit für die Bewertung der Lebensfähigkeit der Zellen und Bildung einer Monoschicht, und die Zellhaftung. Polyethylenterephthalat (PET)-Filter sind transparent, so dass die Sichtbarkeit unter einem Phasenkontrastmikroskop, im Gegensatz zu Polycarbonatfilter scheinend. Für erhöhte Zellhaftung, durchlässig sind Träger mit Kollagen oder Fibronectin vorbeschichtet Handel erhältlich. Darüber hinaus kann der Durchmesser des Filters, die für verschiedene Lochplatten eingestellt wird, die Durchlässigkeit zu beeinflussen, bei größeren Durchmessern (z. B. in 6-Well-Platten) dazu neigen, die parazelluläre Undichtigkeit der Zellenmonoschicht zu erhöhen.

Sobald ein Transwell-Modell aufgebaut ist, einschließlich der Ermächtigungente Auswahl von Zelltyp, Medienzusammensetzung und durchlässigen Filter kann der Status der Zellmonoschicht während der Kultivierung und Versuchsstufen mit TEER beurteilt werden. Jedoch variieren TEER-Werte bei 1) angeborenen biologischen Faktoren mit Zelltyp, Quelle und Passage-Nummer zugeordnet ist, 2) Kulturbedingungen, wie zB die oben erwähnten Transwell Eigenschaften Aussaatdichte, Tagen in Kultur, Medienzusammensetzung und pH-Wert, 3) physikalische Faktoren wie Temperatur, Medienvolumen, Probenplan und den Grad des Rührens / Waschen und 4) pathologischer und / oder chemische Faktoren, die Zellintegrität Übergang (z. B. Cytokine, Immunzellen, oxidativer Stress, pharmakologische Additive usw.) ¹⁰ zu ^{modulieren, 16,17.} Aufgrund der verschiedenen biologischen und ökologischen Faktoren, die TEER, als Mindeststandards Wert, der angibt Barriere Bildung muss für jedes System durch regelmäßige Überwachung TEER während der Kulturperiode und nach experimentelle Manipulationen festgestellt werden. VaLues, die als geeignet für barriere Bildung sind, die zwischen 150-1,600 Ω x cm ^{2 16} reichen kann, auch von der Größe des zu befördernden Stoffes abhängig, so dass passive parazelluläre Diffusion der Substanz eingeschränkt wird, während TEER ≥ 350 Ω × cm ² scheint die passive Diffusion von relativ großen NCs wie hier (200 nm) gezeigt, diejenigen auszuschließen, kann dies nicht der Fall für kleinere Wirkstoffabgabesysteme, in denen engere Monoschichten (zB ≥ 700 Ω × cm ²⁾ erforderlich sind. Dieser Ausgangswert kann auch unter Verwendung von Kontrollen zu beurteilen für die Störung der Permeabilitätsbarriere, einschließlich H ₂ O ₂ durchdringenden Peptiden, Calciumchelatoren (z. B. EDTA), Proteinkinasen und Phosphatasen und verschiedene andere regulatorische Moleküle ^25-27.

Ergänzend zu TEER gibt es viele Durchlässigkeit Assays zur Mono Integrität zu überprüfen und zu bewerten parazellulären Transport. Wie Albumin, anderen Membran-undurchlässig Tracermoleküle in verschiedenen Größen, wie Mannit, Lucifer Yellow, Inulin und Dextran, die mit einem UV-, Fluoreszenz-oder radioaktive Markierung zu messen und zu vergleichen Lässigkeit Raten (P _app) zu bekannten gekoppelt werden kann, Werte für diese gelösten Stoffe. Bei der Auswertung der parazellulären Transport, ist es wichtig, ein Tracer-Molekül, das kleiner als das transportierte untersuchende Verbindung zu verwenden ist. Zum Beispiel würde der parazellulären Transport von 200 nm Teilchen interzellulären Verbindungen ausreichend, die parazelluläre Leckage von kleineren, aber immer noch relativ große Moleküle, wie Albumin in unserem Beispiel verursachen öffnen. Im Gegensatz dazu sollte die parazelluläre Transport von kleineren Arzneimittelabgabeträger wie Dendrimere (~ 5 nm) unter Verwendung von Molekülen <5 nm, wie Mannit ausgewertet werden. Parazelluläre Leckage Studien zeigen, daher die Größe der Zelle Kreuzung Eröffnung, noch durch lange Inkubationszeiten sie transiente Störungen der Zell junc nicht identifizieren könnentionen.

Eine andere Art der Auswertung ist es, die Integrität der Barriere Bild die Tight Junctions, die benachbarte Zellen verbinden. In dieser Studie haben wir immun Occludin für die Fluoreszenzmikroskopie, noch verschiedene andere in der tight junction vorhandenen Proteine ​​können für diese Analyse verwendet werden, einschließlich Transmembranproteine ​​der Kreuzung adhesion molecule (JAM), Claudin und Occludin Familien. Hier, gebeizt wir die extrazelluläre Domäne, eine Permeabilisierung Schritt zu umgehen, noch intrazellulären Domänen kann auch gefärbt werden. Ergänzend dazu ist die Verwendung von Kontrollen für nicht-spezifische Färbung unter Verwendung von fluoreszierenden Sekundärantikörper nur Abwesenheit von festen Verbindungen (hier mit einer Monoschicht, die niedrig TEER verwendeten wir Zellen) oder Unterbrechung von Tight Junctions unter Verwendung der genannten Verbindungsstelle Modulationsmittel oben.

In unserem Beispiel verwenden wir transepithelialen Transport ICAM-1-Ziel NCs, aber die Transwell-System auch Platz für den Transport von anderen Arzneimittel Fahrzeug Formulierungs, therapeutische und diagnostische Verbindungen, angeborene Verbindungen im Körper oder einer Kombination der oben genannten, mit wertvollen Implikationen für klinische Studien und Verständnis grundlegender Wege gefunden. Die Methoden, die wir zum Transport durch Zell-Monoschichten zu quantifizieren beschreiben beinhalten Radioisotop Kennzeichnung des Targeting-Mittel oder therapeutische Ladung in der NC-Mantel, doch ist diese Strategie kann auch verwendet werden, um Nanokristalle mit unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen und Strukturen, einschließlich lineare oder verzweigte Polymere, Dendrimere, Teilchen zu verfolgen , Mizellen, Liposomen usw. ^4,5,28,29. Verschiedene Isotope (z. B. ¹²⁵ I, ³ H, ³² P, etc.) zur Verfügung stehen, um den Transport einer Vielzahl von großen und kleinen Molekülen zu quantifizieren: nicht nur die Arzneimittelträger, aber auch chemische und biologische Therapeutika, ohne die funktionelle oder strukturelle Integrität die Verbindung, im Gegensatz zu sperrigen Fluoreszenzmarkierungen. Radiomarkierung sorgt für mehr quantitative Empfindlichkeit und Geschwindigkeit im Vergleichzu anderen Strategien, die den Transport zu messen, wie Gelelektrophorese, PCR, Massenspektrometrie, HPLC und Fluoreszenzspektroskopie. Diese Markierung kann auch verwendet werden, um den Grad der Verschlechterung (z. B. Protein-Zielmittel und Ladungs ​​in unserem Beispiel) durch die Beurteilung freie Iodgehalt, der schnell und genau ist im Vergleich zu alternativen Proteinaktivitätsassays, einschließlich UV-Spektrophotometrie und Western Blot bestimmt werden. Da freies Jod nicht vollständig Veränderungen in der Protein Konformation oder Aktivität, die in Abwesenheit der Abbau eintreten können, können die oben genannten alternativen Verfahren verwendet werden, um die Integrität der transportierten Materialien weiter auszuwerten. Auch bei der Verabreichung von Verbindungen mit freien Radioisotope in die apikale Kammer, ist es unklar, ob das Etikett in der Zellschicht transportiert und Fraktionen gefunden resultieren aus realen Proteinabbau oder Diffusion von freiem Jod von der apikalen Raum. Um diese Einschränkung zu umgehen, kann die apikal NC-Konzentrationfür eine kurze Zeitspanne angelegt werden, um Assoziation zu der Zellmonoschicht, gefolgt von der Entfernung des apikalen Mediums im Austausch gegen frisches Medium, und ein Verfolgungsperiode zum Auswerten Transport zu ermöglichen. Obwohl eine Menge an freien Radioisotope von der Original-Pool kann zunächst in die anderen Fraktionen auslaufen, kann dieser Wert von Proben ohne Verfolgungsperiode bestimmt und von Bedingungen, die eine Verfolgungsperiode abgezogen werden.

In Bezug auf die Beurteilung der Transportmechanismus beschrieben die gleichen Methoden zur Validierung Mono Integrität (TEER Lecktests und Tight junction-Färbung) kann verwendet werden, um den parazellulären Weg auszuwerten. Für transzellulären Transport, pharmakologische Inhibitoren der Determinanten in den intrazellulären Transport beteiligt sind (z. B. Transferrin an Clathrin Wege zugeordnet ist, Choleratoxin B caveolare Wege usw. verbunden sind) können verwendet werden, wobei wirksame Konzentrationen jene Determinanten spezifisch hemmen brauchen to für jedes System aufgeklärt werden. Alternativen zu den in unserer Studie verwendeten Inhibitoren umfassen Chlorpromazin und Kaliummangel, spezifisch für Clathrin-abhängige Endozytose und Genistein und Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD), spezifisch für Caveolae-vermittelten Aufnahme ^30. Andere Strategien, die mögliche unspezifische Effekte von pharmakologischen Inhibitoren vermeiden, kann es sich um Co-Lokalisation der transportierten Fracht mit diesen Determinanten mit Fluoreszenz-oder Radioisotopen-Kennzeichnung, Verwendung von spezifischen Liganden als Kontrollen (zB Transferrin oder Cholera-Toxin B, wie oben angegeben) und siRNA die Expression von regulatorischen Elementen dieser Wege Knockdown.

In dieser Studie zeigen wir, Gleichungen für die Umwandlung von Radioaktivität Daten, um verschiedene Parameter, die wichtige Informationen über die vorläufigen transepithelialen Transport. Zum Beispiel wird der Grad der transepithelialen Transport von NCS oder Moleküle pro Zelle transportiert dargestellt, die Effizienz der Transport von Inhalten, die bindet oder gibt Zellen wird durch Prozentsatz der Zell-assoziierten NCs oder Moleküle transportiert dargestellt, und die Transportgeschwindigkeit, die für den Vergleich der Durchlässigkeit zwischen verschiedenen gelösten Stoffen ermöglicht, durch P _App bedeutete. Um das Potential der Ziel NCs für große Lieferung von Therapeutika (z. B. die Dosis für die Verabreichung in vivo erforderlich) zu verstehen, können diese Gleichungen modifiziert werden, um Verkehrswerte auf einer makroskopischen Skala abzuschätzen. Zum Beispiel kann die Menge eines therapeutischen beförderten Ladung pro Flächeneinheit von Darmgewebe (mg / cm ²⁾ sowie das Potential Lieferung über den GI-Trakt eines Patienten aus den folgenden Gleichungen bestimmt werden,
Massen Fracht transportiert / cm ² = Gewebe (CPM _{basolateralen} / Spezifische Aktivität) / A
Massenfracht über Dünndarm = [(CPM _{basolateralen} / Spezifische Aktivität) × TA] / A transportiert

ve_content "> wobei die spezifische Aktivität stellt die gemessenen CPM / Masseneinheit der Ladung (siehe Protokoll Schritt 3.1) und TA stellt die Gesamt absorbierenden Oberfläche des Dünndarms (2.000.000 cm ^2). Daher werden die Daten von unseren Methoden resultierenden gibt steigen, um eine breite Palette von möglichen quantitativen Analysen, die den Transport in den relevanten Begriffen zu beschreiben.

Advancing von Transwell-Einsätze, Modelle, die besser auf die physiologischen Komplexität der Transport gehören "Ussing" Kammern und mikrofluidischen Systemen, die dynamische Flüssigkeitsströmung und eine Kammer, die enthaltenen Kontakt mit Luft minimiert, wie in Blutgefäßen ist. Diese Modelle erlauben auch Gewebeexplantaten für Ex-vivo-Studien, vor der Überprüfung in vivo ^17,18 kultiviert werden.

Zusammenfassend haben die in dieser Studie verwendeten Methoden wertvolle vorläufige Informationen über den Transport von einem Modell Drug-Delivery-System vorgesehen, in Bezug auf efficiency, über Zell-Monoschichten. Mit Hilfe dieser Zellkultur-Modell haben wir gezeigt, das Potenzial der ICAM-1-gezielte Nanocarrier-Plattform im Rahmen der oralen Medikamentenverabreichung, die den Weg für die spätere in vivo-Studien, aber auch für andere Systeme erfordern Transport über zelluläre Barrieren in die gefunden werden, modifiziert werden Körper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transwell inserts	BD Falcon	353095
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x	Cellgro	10-013-CM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-015-CV
Pen Strep	Gibco	15140
Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells	ATCC	HTB-37TM
125Iodine	Perkin Elmer	NEZ033H002MC	Radioactive hazard
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Gibco	14190-235
Bovine Serum Albumin (BSA)	Equitech Bio	BAH-66
Paraformaldehyde (16%)	Fisher Scientific	15710
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)	Marlin 1987
α-Galactosidase, from green coffee beans	Sigma	G8507-25UN
FITC latex beads, 100 nm	Polysciences, Inc.	17150
Triton X-100	Sigma	234729-500ML
Trichloroacetic acid (TCA)	Fisher Scientific	SA433-500
Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human	Santa Cruz Biotechnology	Sc-27151
Monodansylcadaverine (MDC)	Sigma	D4008
Filipin	Sigma	F9765
5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)	Sigma	A3085
Wortmannin	Sigma	W1628
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard2
Volt-ohm meter	World Precision Instruments	EVOM2
TEER electrodes	World Precision Instruments	STX100	Electrodes available for different well-plates
Dynamic Light Scattering (DLS)	Malvern	Nano-ZS90