מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד
Summary
יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.
Abstract
ספקי משנה מיקרומטר (nanocarriers; NCS) לשפר את היעילות של תרופות על ידי שיפור מסיסות, יציבות, זמן מחזור, מיקוד, ושחרורו. בנוסף, חוצים מחסומים סלולריים בגוף הוא קריטי עבור שני המשלוח האוראלי של NCS הטיפולי למחזור הדם והתחבורה מהדם לרקמות, שבו יש צורך בהתערבות. תחבורת NC פני מחסומים סלולריים מושגת על ידי: מסלול paracellular (i), באמצעות שיבוש זמני של צמתים שמשתלבים תאים סמוכים, או (ii) את מסלול transcellular, שבו חומרים הם הפנימו על ידי אנדוציטוזה, מועבר על פני גוף התא, ומופרש על פני התא ההפוך (transyctosis). משלוח פני מחסומים סלולריים ניתן להקל על ידי צימוד הרפוי או הספקים שלהם עם סוכני מיקוד שלהיקשר באופן ספציפי לסמנים על פני קרום תא המעורב בהובלה. כאן, אנו מספקים שיטות למדידת WHI המידה ומנגנון של תחבורת NC על פני מחסום תא מודל,פרק מורכב מmonolayer של תאי האפיתל במערכת העיכול (GI) גדל על קרום נקבובי נמצא בכנס transwell. כינונה של מחסום חדירות אושר על ידי מדידת התנגדות חשמלית transepithelial (Teer), תחבורת transepithelial של חומר שליטה, וimmunostaining של צמתים הדוקים. כדוגמא, ~ 200 NCS פולימר ננומטר משמשים, אשר נושא מטען טיפולי והם מצופים בנוגדן שמכוון הקובע על פני קרום תא. הנוגדנים או המטען טיפולי מתויג עם 125 למעקב radioisotope וNCS שכותרתו מתווספים לחדר העליון מעל monolayer התא לתקופות שונות של זמן. NCS הקשורים לתאים ו / או מועברים לתא הבסיסי ניתן לאתרם. מדידה של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר המושפל. מסלול paracellular נבחנים על ידי קביעת שינויים אפשריים הנגרמים על ידי תחבורת NC לפרמטרי המחסום שתוארו לעיל. i תחבורת Transcellulars נקבע על ידי עסק בהשפעה של ויסות מסלולי אנדוציטוזה וtranscytosis.
Introduction
מחסומים נייד במעשה גוף כשער בין הסביבה החיצונית והתאים פנימיים. זהו המקרה לרירית אפיתל להפריד את פני השטח החיצוני החשופים של מערכת העיכול (GI) בדרכי ו1-3 זרם הדם. מחסומים נייד גם לייצג את הממשק שבין זרם הדם וparenchyma ומרכיבים תאיים של רקמות ואיברים. זהו המקרה לרירית האנדותל הפנימית בכלי דם, כגון מחסום דם הריאה, מחסום דם המוח, וכו '1 היכולת לחצות מחסומים סלולריים אלה בגוף היא חיונית לאספקה יעילה של סוכנים טיפוליים ואבחון למחזור הדם ורקמות / איברים שבו יש צורך בהתערבות.
כדי לשפר את המסירה של סוכנים טיפוליים או אבחון, ניתן לטעון תרכובות אלה לnanocarriers תת מיקרומטר (NCS). אפשר לנסח רכב משלוח סמים אלו עם מגוון רחב שלchemistries ומבנים כדי לייעל את מסיסות תרופה, הגנה, הפרמקוקינטיקה, שחרור, וחילוף חומרים של 4,5. NCS יכול להיות גם פונקציונליות עם זיקה או מיקוד moieties (למשל נוגדנים, סוכרים פפטידים, aptamers, וכו ') כדי להקל על הדבקה לאזורים בגוף שבו נדרש הפעולה הטיפולית 2,6. מיקוד של NCS לגורמים הביעו על פני השטח של מחסומים סלולריים יכול עוד יותר להקל על תחבורה אל ו / או על פני רפידות אלה 2,6.
התפקיד של סלקטיבי שינוע חומרים בין שתי סביבות דורש תכונות ייחודיות מסוימות בקרב שכבות תאים. מאפיין אחד כזה הוא קוטביות בתא, שבו קרום הפסגה מול לומן של חללים משתנה מקרום basolateral המכוון כלפי interstitium הרקמות, ביחס למורפולוגיה קרום ורכב שומנים, מובילים, וקולטני 2. תכונה נוספת כרוכה junctio אינטרNS חיבור תאים סמוכים. רגולציה של החלבונים היוצרים צמתים הדוקים, מולקולות במיוחד junctional הידבקות (קונפיטורות), occludins, וclaudins, לווסת את תפקוד המחסום כדי לאפשר באופן סלקטיבי או לא הובלת חומרים בין תאים, המכונים תחבורת paracellular, המאפשר מעבר של חומרים מהלום ל שטח basolateral 3. עקידת אלמנטים רבים טבעיים וסינטטיים (לויקוציטים, מולקולות, חלקיקים, ומערכות אספקת סמים) לחסמים סלולריים בגוף יכולה לגרום לפתיחת תא לצומת, אשר עשוי להיות ארעי ויחסית לא מזיק או ממושך יותר, ולכן, לא בטוח עם גישה של חומרים בלתי רצויים על פני המחסום 2,5,7-9. כתוצאה מכך, מסלול זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית transepithelial (Teer) ודיפוזיה פסיבית paracellular של מולקולות (זליגת paracellular במסמך זה נקרא), לפיה ירידה בהתנגדות לזרם חשמלי או דליפת paracellular המוגברת של ineמתחם rt לחלל basolateral מצביע על פתיחת צמתים תא, בהתאמה 5,10,11. כדי להשלים את השיטות הללו, כל אחד מחלבוני הצומת ההדוקים המפורטים לעיל יכול להיות מוכתם על מנת להעריך את היושרה שלהם, שבו צריכים להופיע כתמים מרוכזים בגבולות תאי תאים בכל רחבי הפריפריה התא 5,10,12.
לחלופין, מערכות אספקת סמים, כי יעד גורמי תא שטח מסוימים, כגון אלה הקשורים לבורות מצופים clathrin או invaginations קרום בצורת בקבוק שנקרא caveolae, עלולות לעורר ספיגת ועי לתוך תאים על ידי אנדוציטוזה, מתן שדרת עבור משלוח סמים לתאים תאיים 5, 13. בנוסף, אנדוציטוזה עלולה להוביל לסחר בשלפוחית על פני גוף התא לשחרור בצד basolateral, תופעה הידועה בtransyctosis, או תחבורת transcellular 14. לכן, ידע של קינטיקה והמנגנון של אנדוציטוזה ניתן להשתמש כדי לנצל תאייםnd משלוח הסמים transcellular, שמציע מצב בטוח יחסית ושליטה מלאה של משלוח בהשוואה לתוואי paracellular. (אנדוציטוזה כמו במקרה של מולקולת הידבקות תא (רמ"א בתיווך)) המנגנון של אנדוציטוזה ניתן להעריך עם מאפננים של מסלולים קלאסיים (clathrin ואנדוציטוזה בתיווך caveolin, וmacropinocytosis) או מסלולים שאינם קלאסיים 5,13,15 .
בעוד סחר תאיים לעתים קרובות למד בבארות או coverslips סטנדרטיים, היעדר תא basolateral מונע קיטוב תא ואת היכולת ללמוד תחבורה פני שכבות תאים. כדי להתגבר על מכשול זה, תחבורה ברחבי monolayers התא נחקרה ארוכה באמצעות transwell מוסיף 10,11,16,17, שמורכב מחדר עליון (פסגת), קרום חדיר נקבובי שבו תאים לצרף ולהקים monolayer הדוק, ונמוך יותר קאמרי (basolateral) (איור 1). בתצורה זו, תחבורה ניתן למדוד בקודקוד לכיוון basolateral על ידי מתן טיפול לחדר העליון, בעקבות ההובלה דרך monolayer התא והקרום הנקבובי הבסיסי, ולבסוף איסוף הבינוני בתא התחתון לכימות של חומר מועבר. תחבורה בכיוון basolateral לפסגה גם ניתן למדוד על ידי ממשל ראשוני לתא התחתון והאוסף הבא מהעליון קאמרי 5,10,12,16. טכניקות שונות קיימות כדי לאמת את היווצרות מחסום חדירות על transwells, כולל Teer ומבחני תחבורת paracellular, כפי שתוארו לעיל. בנוסף, המסנן החדיר שבו תאים בתרבית ניתן להסיר בניתוח הדמיה (למשל על ידי הקרינה, confocal, מיקרוסקופית אלקטרונים), כהוכחה נוספת של מודל monolayer תא, כמו גם את המנגנון של תחבורה. בחירה של סוג הקרום, שהוא זמין בגדלים שונים נקבוביות, חומרים ופני שטחים, תלויה בפקטו השוניםrs כגון גודל של חומרים או חפצים כדי להיות מועברים, סוג התא, ואת שיטת הדמיה 16,18-20. Transwell מוסיף גם להקל כימות מבוקר ומדויק של תחבורה בהשוואה למערכות של יונקים מורכבים, כאמצעי אחסון של התאים ועל פני השטח של תאים ידועים קבועים. בעוד גורמים רבים המעורבים בin vivo משלוח בוטלו, לרבות הנוכחות של ריר מעיים, מאמץ גזירה, אנזימי עיכול, תאי מערכת החיסון, וכו ', בקנה מידה הקטן הזה במודל מבחנה מספקת מידע ראשוני שימושי לגבי תחבורה.
כדוגמא כדי להמחיש את ההתאמה של שיטות אלה ללמוד תחבורת NC פני מחסומים סלולריים 10,11,16,17, אנו מתארים כאן מקרה שבו הפוטנציאל להובלת NC פני האפיתל במערכת העיכול היה במתכונת על ידי בחינת מעבר משלוח סמים מודל של מערכת באמצעות monolayer של אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל האנושי (קאקו-2) תאים. לצורך, ג זואמות היו בתרבית במוסיפה transwell, על terephthalate 0.8 מיקרומטר הנקבובית פוליאתילן מסנן (PET) (קוטר 6.4 מ"מ), שהוא שקוף וניתן להשתמש בם להדמיה מיקרוסקופית. מעמדו של מחסום החדירות אומת על ידי מדידת Teer, תחבורת הפסגה לbasolateral של חומר שליטה, אלבומין, והדמית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלמנט של צמתים ההדוקים, חלבון occludin. מודל של פולימר הממוקד NC משמש, בהיקף של 100 ננומטר, חלקיקי פוליסטירן, לא מתכלים. NCS הם מצופים על ידי ספיחת משטח עם נוגדן מיקוד לבד או שילוב של נוגדני מיקוד ומטענים טיפוליים, שבו גם מרכיב יכול להיות מתויג עם 125 למעקב radioisotope. בדוגמא שנבחרה, הנוגדנים מזהה הידבקות אינטר מולקולה 1 (ICAM-1), חלבון לידי ביטוי על פני השטח של אפיתל במערכת העיכול (וגם אחרים) תאים, אשר הוכח כדי להקל תאיים וo תחבורת transcellular ספקים ו סמים ומטעניהם 21. המטען הוא אלפא Galactosidase (α-Gal), אנזים טיפולי המשמש לטיפול במחלת פברי, הפרעת אחסון lysosomal גנטי 22.
NCS המצופה, של כ -200 ננומטר בגודלם, מתווספים לתא apical מעל monolayer התא וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופות משתנות של זמן, שלאחריו 125 אני בNCS ניתן לאתרם קשור לmonolayer ו / או התא מועבר לתא basolateral מתחת לתאים. קביעה נוספות של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר והערכה המושפל תחבורת NC המצופה. המנגנון של תחבורה מוערך יותר על ידי בחינת שינויים במחסום החדירות הנוגעים לתוואי paracellular, באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל, תוך הובלת transcellular נקבעת על ידי בחינת שינויים בתחבורה כאשר ויסות מסלולים של אנדוציטוזה וtranscytosis.
ontent "> שיטות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי דגמי מחסום סלולארי, במידה ושיעור ההובלה של מערכת אספקת סמים, ואת המנגנון של תחבורה כזה, לחלוטין ומאפשר הערכה של הפוטנציאל עבור משלוח סמים על פני מחסומים סלולריים.Protocol
Representative Results
Discussion
שימוש בשיטות שנדונו לעיל, ניתן לקבוע מודל תא לחקר תחבורה של NCS הממוקד על פני מחסומים סלולריים, כמו בדוגמא הניתנת לקאקו-2 תאי אפיתל, שהוא רלוונטי להערכת תחבורה מלומן במערכת העיכול אל הדם במקרה של מערכות להולכת תרופות דרך הפה. Culturing של monolayers תאי אפיתל במערכת העיכול במוסי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הרפואי הווארד יוז והקרן הלאומי למדע לRG, וקרנות הוענקו לSM על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (גרנט R01-HL98416) ואיגוד הלב האמריקאי (גרנט 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: “Pathogen-Mimetic” systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
