모델 및 세포 장벽에 걸쳐 약물 전달 시스템의 전송을 평가하는 방법
Summary
많은 치료 응용 프로그램은 신체의 세포 장벽에 걸쳐 약물 사업자와 그들의화물의 안전하고 효율적인 전송을 필요로합니다. 이 문서는 위장 (GI) 상피 세포와 같은 세포 장벽에 걸쳐 약 nanocarriers (나노 결정)의 전송 속도와 메커니즘을 평가하기 위해 설립 방법의 적응을 설명합니다.
Abstract
서브 마이크로 미터 캐리어 (nanocarriers, 나노 결정은) 용해도, 안정성, 순환 시간, 타겟팅 및 방출을 개선하여 약물의 효능을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 몸에있는 세포 장벽을 통과하면 개입이 필요한 조직에 혈액 순환 및 전송에 치료 나노 결정의 모두 구두 전달을위한 중요합니다. 인접 셀, 또는 (ii) 상기 세포 횡단의 세포체를 통해 전송 자료는 엔도 시토 시스에 의해 내장되어 경로,,, 분비를 연동 접속점의 일시적인 중단을 통해, (I) 세포층 경로 : 세포 장벽에 걸쳐 NC 전송에 의해 달성된다 반대의 세포 표면 (transyctosis)에서. 세포 장벽에 걸쳐 배달 운송에 관련된 세포 표면 마커에 특이 적으로 결합 대상 에이전트와 치료 또는 사업자의 결합에 의해 촉진 될 수있다. 여기, 우리는 WHI 모델 세포 장벽에 걸쳐 범위와 NC 수송 메커니즘을 측정하는 방법을 제공합니다채널은 트랜스 웰 인서트에있는 다공성 막에 성장 위장의 단층 (GI) 상피 세포로 구성되어 있습니다. 투과성 장벽의 형성은 transepithelial 전기 저항 (티이), 제어 물질 transepithelial 수송, 타이트 접합부의 면역 염색을 측정함으로써 확인된다. 예로서, ~ 200 nm의 중합체 나노 결정은 치료화물을 운반하고 세포 표면 행렬식을 표적으로하는 항체로 코팅되어있는, 사용된다. 항체 또는 치료화물은 방사성 동위 원소 추적에 125 I로 표시되고, 표시된 나노 결정은 시간의 변화 기간 동안 세포 단일 층에 다락방에 추가됩니다. 내부 챔버로 이송 세포 및 / 또는 연결된 나노 결정은 검출 될 수있다. 무료 125 I의 측정 성능이 저하 된 분수의 뺄셈을 할 수 있습니다. 세포층 경로는 위에서 설명한 장벽 매개 변수에 NC 전송으로 인한 잠재적 인 변경을 결정함으로써 평가된다. 세포 횡단 수송 난엔도 시토 시스와 transcytosis 경로를 조절하는 효과를 주소에 의해 결정들.
Introduction
외부 환경과 내부 구획 사이의 게이트웨이 등 신체의 행위에 휴대 장벽. 이는 위장관 혈류 1-3의 외부 노출면을 분리하는 상피의 경우입니다. 세포 장벽은 혈액과 실질 및 조직과 장기의 세포 구성 요소 사이의 인터페이스를 나타낸다. 본문에 이러한 세포 장벽을 통과 할 수있는 능력이 치료 및 진단 요원의 효율적인 전달을 위해 매우 중요 하나 이는 등 혈액 폐 장벽, 혈액 – 뇌 장벽과 같은 혈관의 안쪽 내피 안감의 경우 개입이 필요한 순환 및 조직 / 기관에.
치료 또는 진단 요원의 전달을 향상시키기 위해, 이러한 화합물은 서브 마이크로 미터 nanocarriers (나노 결정)에로드 할 수 있습니다. 이러한 약물 전달 차량은 다양한 제형으로 할 수있다화학 물질 및 약물의 용해도, 보호, 약물 동력학, 릴리스 및 신진 대사 4,5을 최적화 구조. 나노 결정은 또한 치료 조치 2,6 필요한 신체의 영역에 접착을 촉진 또는 친 화성 (예, 항체 등, 펩티드 당, 앱 타머,) 잔기를 표적으로 작용 화 될 수있다. 세포 장벽의 표면에 발현 결정에 나노 결정의 대상으로하는 것은 더 2,6로 및 / 또는 이러한 라이닝에 걸쳐 전송을 용이하게 할 수있다.
선택적으로 두 환경 사이의 물질 수송의 역할은 세포의 층 사이에서 특정 고유의 기능을 필요로합니다. 충치의 루멘에 직면 정점 막 막 형태와 지질, 운송 및 수용체 2의 구성과 관련하여, 조직의 간질을 지향 기저 막에서 변화함으로써 하나의 기능은 세포의 극성입니다. 또 다른 특징은 세포 간 junctio을 포함인접한 셀을 연결 NS. 꽉 접합, 특히 접합부 접착 분자 (용지), occludins 및 claudins을 형성하는 단백질의 규제에 루멘에서 물질의 통과를 허용, 선택적 세포층의 전송로 알려진 세포 사이의 물질의 수송을 허용하거나하지 않도록 장벽 기능을 조절 기저 공간 3. 몸에있는 세포 장벽에 많은 천연 및 합성 요소 (백혈구, 분자, 입자 및 약물 전달 시스템)의 결합은, 그러므로,의 액세스와 안전하지 않은 과도 비교적 무해한 이상 연장하고 수있는, 세포 접합 개방을 유도 할 수있다 장벽 2,5,7-9에서 바람직하지 않은 물질. 결과적으로,이 통로가 transepithelial 전기 저항 (티이) 및 분자의 수동적 세포층 확산 (본원 불리는 세포층 누설)을 측정함으로써 평가 될 수있다 전류 또는 아민의 증가 세포층 누설 저항을 감소기저 공간으로 RT 화합물은 세포 접합의 개방을 나타내는 각각 5,10,11. 염색은 모든 세포 주변 5,10,12 주위 세포 셀 테두리에 집중 나타나는 위치를 이러한 방법을 보완하기 위해, 위에 나열된 꽉 접합 단백질의는 자신의 무결성을 평가하기 위해 염색 할 수 있습니다.
또한, 같은 방 clathrin 코팅 구덩이 또는 caveolae라고 플라스크 모양의 막 함입에 관련된 것과 같은 특정 세포 표면의 결정을 대상으로 약물 전달 시스템, 세포 내 구획 5에 약물 전달을위한 수단을 제공, 엔도 시토 시스에 의해 세포에 기공을 갖는 흡수를 게재 할 수 13. 또한, 엔도 시토 시스는 기저 측 릴리스 transyctosis로 알려진 현상, 또는 세포 횡단 수송 14 세포체에서 소포의 인신 매매로 이어질 수 있습니다. 따라서, 엔도 시토 시스의 반응 속도와 메커니즘의 지식은 세포 내를 악용 할 수있다차 세포층의 노선에 비해 배달 상대적으로 안전하고 제어 모드를 제공 세포 횡단 약물 전달. 엔도 시토 시스의 메커니즘 고전 경로 (방 clathrin 및 카베 올린 매개 엔도 시토 시스, 그리고 macropinocytosis) 또는 비 고전 노선의 변조기로 평가 될 수있다 (예 : 세포 접착 분자의 경우와 (CAM) – 매개 엔도 시토 시스) 5,13,15 .
세포 내 인신 매매는 종종 표준 우물 커버 슬립으로 연구되는 반면, 기저 구획의 부재는 세포 편광 셀 계층에서 전송을 연구 할 수있는 능력을 배제한다. 이 장애물을 극복하기 위해, 세포 단일 층에 걸쳐 전송 긴 트랜스 웰은 상부 (정점) 실, 세포 부착과 꽉 단일 층을 형성 다공질 투과 막으로 구성되는, 10,11,16,17를 삽입하고, 낮은 사용하여 연구되고있다 (기저) 챔버 (그림 1). 이 구성에서는, 전송은 측정 할 수있다정점 간 측저, 상부 챔버로 치료 투여 세포 단층 및 내부 다공성 막을 통해 전송을 다음, 마지막 반송물의 정량화를위한 하부 챔버에 매체를 수집하여 방향. 측저에서 첨단으로의 전송 방향은 상부 챔버 5,10,12,16로부터 하부 챔버 및 후속 컬렉션에 초기 투여에 의해 측정 될 수있다. 다양한 기술이 전술 한 바와 같이, 티이 및 세포층의 전송 분석법 등 트랜스 웰에 투과성 장벽의 형성을 확인하기 위하여 존재한다. 또, 세포가 배양되는 투과 필터 (형광 공 촛점, 전자 현미경에 의해 예) 영상 분석을 위해 제거 될 수 있고, 또한 세포 단층 모델의 검증뿐만 아니라 전송의 메커니즘. 다른 기공 크기, 재질 및 표면 영역에서 사용할 멤브레인 타입의 선택은, 다양한 사실상에 달려이러한 물질의 크기 또는 전송되는 개체, 세포 유형, 및 이미징 방법 16,18-20으로 RS. 트랜스 웰 인서트는 또한 챔버 및 세포 표면 영역의 양이 상수를 공지 된 바와 복잡한 포유류 시스템에 비해 전송 제어하고 정확한 정량을 용이하게한다. 생체 내 전달에 관련된 여러 가지 요소가 등 장 점액의 존재, 전단 응력, 소화 효소, 면역 세포를 포함하여, 제거하는 동안, 체외 모델이 작은 규모의 운송에 관한 유용한 사전 정보를 제공합니다.
휴대 장벽 10,11,16,17 통해 NC 전송을 공부하는이 방법의 적응을 설명하기 위해 예를 들어, 우리는 여기에 GI 상피에서 NC 전송의 가능성을 모델 약물 전달의 통로를 평가에 의해 모델링 된 경우를 설명 인간 상피 대장 선암 (된 Caco-2) 세포의 단일 층을 통해 시스템. 이러한 목적으로, C 들면ELL을 투명하고 현미경 이미징에 사용될 수있는 0.8 μm의 세공 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET) 필터 (6.4 mm 직경)에서, 트랜스 웰 인서트에서 배양 하였다. 투과성 장벽의 상태는 티이, 제어 물질, 알부민 및 단단한 접합부, occludin 단백질의 요소의 형광 현미경 시각화의 정점 간 측저 전송 측정에 의해 확인된다. 대상 폴리머 NC의 모델은 100 nm의, 생분해 폴리스티렌 나노 입자로 구성된 사용됩니다. 나노 결정은 표면 만 대상으로 항체 흡착 또는 표적 항체의 조합과 구성 요소 중 하나는 방사성 동위 원소 추적 125 I로 표시 할 수있는 치료화물에 의해 코팅된다. 선택된 예에서, 항체는 세포 간 부착을 분자 -1 (ICAM-1)을 인식하고, 단백질은 GI 상피의 표면에 발현 (및 기타), 세포 내 및 세포 횡단 수송 O를 용이하게하기 위해 도시 된 세포 F 약물 사업자와 그들의화물 21. 화물은 α-갈 락토시다 제 (α-GAL), 파브리 질환, 유전 리소좀 저장 장애 (22)의 치료에 사용되는 치료 효소이다.
크기가 약 200nm의 코팅 된 나노 결정은, 시간의 변화 기간의 세포 단일 층에 혀끝의 챔버에 첨가하고 37 ° C에서 배양 된 후 125 나노 결정에 나는 세포 단일 층 및 / 또는 관련된 검출 할 수있다 세포 아래의 기저 챔버로 이송. 무료 125 I의 추가 결정이 코팅 된 NC 전송의 성능이 저하 된 부분 및 추정의 뺄셈을 할 수 있습니다. 운송기구는 상기 세포 횡단 수송이 엔도 시토 시스와 transcytosis의 경로를 변조 할 때 전송의 변화를 검토하여 결정되는 동안, 상기 파라미터를 통해 세포층 경로에 속하는 투과성 장벽의 변화를 조사하여 평가한다.
"ontent> 이들 방법은 모두 세포 장벽을 가로 질러 약물 전달에 대한 가능성을 평가할 수 있도록, 귀중한 셀룰러 배리어 모델에 대한 정보, 약물 전달 시스템의 전송 범위 및 속도와 같은 전송 메커니즘을 제공한다.Protocol
Representative Results
Discussion
상기 논의 된 방법을 사용하여 세포 장벽에 걸쳐 표적 나토 수송을 연구 셀 모델은 이러한 경우의 혈액으로 GI 루멘으로부터 수송을 평가 관련된 된 Caco-2 상피 세포, 제공된 예로서 확립 될 수있다 경구 용 약물 전달 시스템의. 트랜스 웰 인서트의 GI 상피 세포 단일 층의 배양은 세포 투과성 장벽의 형성을 확인하는 봉사자의 측정 꽉 접합의 형광 면역 염색을 가능하게했다. 그 후, 125로 타?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) RG, 그리고 건강 (그랜트 R01 – HL98416)의 국립 연구소와 미국 심장 협회 (American Heart Association, 그랜트 09BGIA2450014)가 SM에게 수여 자금의 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
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