Модели и методы для оценки Перевозка системам по наркотикам Доставка по клеточные барьеры
Summary
Многие терапевтические приложения требуют безопасной и эффективной транспортировки носителей лекарственных средств и их грузов по клеточные барьеры в организме. В этой статье описывается адаптацию установленных методов оценить скорость и механизм транспортировки наноносителей наркотиков (NCS) через клеточные барьеры, такие как желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) эпителия.
Abstract
Суб-микрометр носители (наноносителей; НК) повышения эффективности лекарств путем улучшения растворимости, стабильности, время циркуляции, адресности, и отпустите. Кроме того, пересекая клеточные барьеры в организме имеет решающее значение как для перорального применения терапевтических НК в обращении и транспорта из крови в ткани, где вмешательство не требуется. NC транспорт через клеточные барьеры достигается: (I) парацеллюлярная маршруту, через переходного нарушения стыках, которые сцепляются соседние ячейки, или (II) трансцеллюлярного маршрут, где материалы усвоены эндоцитоза, перемещаемых через тела клетки и секретируется на противоположной поверхности клеток (transyctosis). Доставка по клеточные барьеры можно облегчить путем сочетания терапии или их носителей с таргетинга агентов, которые специфически связываются с клеточной поверхности маркеров, участвующих в транспорте. Здесь мы предоставляем методы для определения степени и механизм НК транспорта через модель клеточный барьер, бееCH состоит из монослоя желудочно-кишечного тракта (GI) эпителиальные клетки, выращенные на пористой мембраной, расположенной в Transwell вставки. Формирование барьера проницаемости подтверждается измерения трансэпителиальный электрическое сопротивление (Тир), трансэпителиальный транспорт контрольного вещества и Иммуноокрашивание плотных контактов. Например, ~ 200 нм полимерные НК используются, которые несут терапевтический груз и покрыты антителом, предназначенного для элемента клеточной поверхности определитель. Антитела или терапевтического грузов помечен 125 I для радиоизотопной трассировки и меченые НК добавляются в верхнюю палату по клеточный монослой в течение различных периодов времени. НК, связанные с клетками и / или транспортируемых к основной камере может быть обнаружена. Измерение свободного 125 I позволяет вычитание деградированных фракции. Маршрут парацеллюлярная оценивается путем определения потенциальных изменений, вызванных НК транспорта барьерных параметров, описанных выше. Трансцеллюлярного транспорта яы определяется решении эффект модуляции эндоцитоза и трансцитоз пути.
Introduction
Сотовые барьеры в акте тела в качестве шлюза между внешней средой и внутренними отсеками. Это тот случай, для эпителиальной выстилки, отделяющей извне открытую поверхность желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и кровоток 1-3. Сотовые барьеры также представляет собой интерфейс между кровоток и паренхимы и клеточных компонентов тканей и органов. Это тот случай, для внутренней эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов, такие как гематоэнцефалический барьер легких, в гематоэнцефалический барьер и т.д. 1 способность пересекать эти клеточные барьеры в организме имеет решающее значение для эффективной доставки терапевтических и диагностических средств в обращение и тканей / органов, где вмешательство необходимо.
Чтобы улучшить доставку терапевтических или диагностических агентов, эти соединения могут быть загружены в суб-микронных наноносителей (NCS). Эти транспортные средства доставки лекарственных средств могут быть приготовлены с различнымихимические и структуры для оптимизации растворимость наркотиков, защиту, фармакокинетики, выпуск и обмен веществ 4,5. НК также можно функционализирован близости или целевые фрагменты (например, антитела, пептиды сахара, аптамеры и т.д.) для облегчения адгезии к областях тела, где терапевтическое действие требуется 2,6. Ориентация из НК, чтобы детерминант, выраженных на поверхности клеточных барьеров может еще больше облегчить транспорт в и / или через эти накладок 2,6.
Роль выборочно транспортировки веществ между двумя средами требует определенных уникальных особенностей среди слоев клеток. Одна из таких особенностей является клеточной полярности, причем апикальной мембраны, обращенной в просвет полости варьируется от базолатеральной мембране, ориентированного на ткани интерстиции, по отношению к мембранной морфологии и состава липидов, транспортеры, и рецепторов 2. Еще одна особенность предполагает межклеточное junctioнс, соединяющие соседние клетки. Регулирование белков, которые формируют плотные соединения, в частности Junctional молекул адгезии (джемы), occludins и клаудины, модулировать барьерную функцию, чтобы выборочно разрешить или не транспорт веществ между клетками, известными как парацеллюлярной транспорта, обеспечивая прохождение материалов из просвета в базолатеральный пространство 3. Связывание многих природных и синтетических элементов (лейкоцитов, молекул, частиц и систем доставки лекарств) до клеточные барьеры в организме может вызвать открытие клеточного перехода, который может быть временной и относительно безвредны или более продолжительным, а следовательно, небезопасным с доступом нежелательных веществ через барьер 2,5,7-9. Следовательно, этот путь может быть оценена посредством измерения электрического сопротивления трансэпителиальный (Тир) и пассивный парацеллюлярного диффузию молекул (называемого здесь утечки парацеллюлярная), в результате чего уменьшилось сопротивление электрического тока утечки или повышенного парацеллюлярной из INERT соединение в базолатеральную пространства указывают открытие соединений элементов, соответственно 5,10,11. В дополнение к этим методам, любой из узких соединительных белков, перечисленных выше, могут быть окрашены, чтобы оценить их целостность, где окрашивание должны отображаться сосредоточена в межклеточных границ все вокруг периферии клетки 5,10,12.
Кроме того, системы доставки лекарств, которые нацелены на конкретные клеточной поверхности детерминанты, такие как те, что связаны с клатриновых ямы или колбовидные мембранных инвагинаций называемых кавеолы, может вызвать везикулярного поступлению в клетки путем эндоцитоза, обеспечивая путь для доставки лекарств к внутриклеточным 5, 13. Кроме того, эндоцитоз может привести к торговле людьми пузырьков по всему телу клетки для выпуска на базолатеральной стороны, явление, известное как transyctosis или трансцеллюлярного транспорта 14. Поэтому знание кинетики и механизма эндоцитоза может использоваться, чтобы эксплуатировать внутриклеточный Aй трансцеллюлярного доставки лекарств, которые предлагает относительно безопасный и контролируемый способ доставки по сравнению с парацеллюлярной маршрута. Механизм эндоцитоза может быть оценена с модуляторами классических путей (клатрин и кавеолин-опосредованного эндоцитоза и макропиноцитозом) или неклассических маршрутов (например, в случае молекулы клеточной адгезии (CAM)-опосредованного эндоцитоза) 5,13,15 .
В то время как внутриклеточный торговля часто учился в стандартных скважин или покровные, отсутствие базолатеральную отсека исключает клеток поляризацию и способность к обучению транспорт через клеточные слои. Чтобы преодолеть это препятствие, транспорт через клеточные монослоев уже давно изучены с помощью Transwell вставляет 10,11,16,17, которые состоят из верхней (апикальной) камеры, пористой мембраны, где клетки придают и образуют плотный монослой, и ниже (базолатеральная) камера (рис. 1). В этой конфигурации транспортного могут быть измерены вапикальный к базолатеральной направлении путем введения лечение в верхнюю камеру, после транспорта через клеточный монослой и основной пористой мембраны, и, наконец сбора среды в нижней камере для количественного определения транспортируемого материала. Транспорт в базолатеральной к апикальной-направлении также может быть измерена путем первоначального введения в нижнюю камеру и последующего сбора из верхней камеры 5,10,12,16. Существуют различные способы, чтобы проверить формирование проницаемости барьера на transwells, в том числе и TEER парацеллюлярного транспорта анализов, как описано выше. Кроме того, проницаемый фильтр, на котором клетки культивируют могут быть удалены для анализа изображений (например, путем флуоресценции, конфокальной, электронной микроскопии), а дальнейшей проверки модели монослой клеток, а также механизма транспортировки. Выбор типа мембраны, которая доступна в различных размерах пор, материалов и поверхностных областях, зависит от различных фактоRS, такие как размер веществ или предметов, перевозимых, типа клеток, и метода визуализации 16,18-20. Transwell вставки также способствовать контролируемое и точный количественный анализ транспорта по сравнению с сложных систем млекопитающих, а объемы камер и площади поверхности клетки, как известно константы. Хотя многие факторы, влияющие на в естественных условиях поставки будут устранены, в том числе наличие кишечной слизи, напряжение сдвига, пищеварительных ферментов, иммунных клеток и т.д. Этот небольшой масштаб в пробирке модель обеспечивает полезную предварительную информацию о транспорте.
В качестве примера, иллюстрирующего адаптации этих методов для изучения NC транспорт через клеточные барьеры 10,11,16,17, мы описываем здесь случай, когда был смоделирован потенциал для НК транспорта через желудочно эпителия путем оценки прохождение модели доставки лекарств Система через монослой человеческих эпителиальных колоректальной аденокарциномы (Сасо-2) клеток. Для этого, слоктей культивировали в Transwell вставками, на мкм пор полиэтилентерефталата 0,8 (ПЭТ) фильтра (диаметр 6,4 мм), который является прозрачным и может быть использован для визуализации микроскопии. Статус барьер проницаемости проверяется путем измерения TEER, верхушечный к базолатеральная транспорт контрольного вещества, альбумина, и флуоресцентной микроскопии визуализации элемента плотных контактов, occludin белка. Модель целевой полимерной NC используется, состоящий из 100 нм, небиодеградируемых наночастиц полистирола. НК покрыты путем поверхностной адсорбции с использованием только адресным антитела или комбинации антител и ориентации терапевтического грузов, где либо компонент может быть, меченного 125 I для радиоизотопного трассировки. В выбранном Например, антитело распознает молекула межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), белок экспрессируется на поверхности из желудочно-кишечного эпителия (и другие) клетки, которые, как было показано способствовать внутриклеточным и трансцеллюлярного транспортного O е носители лекарственных средств и их грузов 21. Груз альфа-галактозидазы (α-Gal), терапевтический фермент, используемый для лечения болезни Фабри, расстройства 22 генетический хранения лизосомальных.
Покрытые НК, около 200 нм в размере, добавляются в апикальную камеру через клеточный монослой и инкубировали при 37 ° С в течение различных периодов времени, после чего 125 I на НК могут быть обнаружены, ассоциированный с монослое клеток и / или транспортируется к базолатеральной камере ниже клеток. Дополнительная определение свободного 125 I позволяет вычитание деградированных фракции и оценки покрытием НК транспорта. Механизм транспорта дополнительно оценивали путем анализа изменений в проницаемости барьера, относящейся к парацеллюлярной маршрута, через параметрами, описанными выше, а трансцеллюлярного транспорт определяется путем анализа изменений на транспорте при модуляции путей эндоцитоза и трансцитоза.
ontent "> Эти методы обеспечивают ценную информацию относительно моделей сотовых барьерных, степень и скорость перевозки системы доставки лекарственного, и механизм такого транспорта, в целом позволяет оценить потенциал для доставки лекарств через клеточные барьеры.Protocol
Representative Results
Discussion
Используя методы, описанные выше, модель сотового для изучения транспорт целевых НК всей клеточные барьеры могут быть установлены, например, примера, приведенного в Caco-2 эпителиальных клеток, которая имеет отношение к оценке транспорт из GI просвета в кровь в случае оральных систем дост…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана стипендией от Медицинского института Говарда Хьюза и Национального научного фонда в RG, и средств, присужденных SM Национальными Институтами Здоровья (Грант R01-HL98416) и Американской ассоциации сердца (грант 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: “Pathogen-Mimetic” systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
