Modeller og metoder til evaluering Transport af Drug Delivery Systems over cellulære Barrierer
Summary
Mange terapeutiske applikationer kræver sikker og effektiv transport af narkotika luftfartsselskaber og deres last over cellulære barrierer i kroppen. Denne artikel beskriver en tilpasning af etablerede metoder til at vurdere hastigheden og mekanismen for transport af narkotika nanocarriers (NCS) over cellulære barrierer, såsom den gastrointestinale (GI) epitel.
Abstract
Sub-mikrometer luftfartsselskaber (nanocarriers; NCS) øge effektiviteten af lægemidler ved at forbedre opløselighed, stabilitet, cirkulation tid, målretning og frigivelse. Derudover gennemkører cellulære barrierer i kroppen er afgørende for både oral levering af terapeutiske NCs i omsætning og transport fra blodet ind i væv, hvor der er behov intervention. NC transport over cellulære barrierer opnås ved: (i) den paracellulære rute via forbigående afbrydelse af vejkryds, der griber ind i hinanden tilstødende celler, eller (ii) transcellulær vej, hvor materialer internaliseres ved endocytose, transporteres på tværs af cellen kroppen og udskilles på den modsatte celleoverfladen (transyctosis). Levering over cellulære barrierer kan lettes ved at koble lægemidler eller deres luftfartsselskaber med målretning agenter, der binder specifikt til celle-overflade markører er involveret i transport. Her giver vi metoder til at måle omfanget og mekanisme NC transport på tværs af en model cellebarriere, whilm består af et monolag af gastrointestinal (GI) epitelceller dyrket på en porøs membran placeret i en transwell insert. Dannelse af en permeabilitetsbarriere bekræftes ved at måle transepithelial elektrisk modstand (TEER) transepithelial transport af et kontrolstof og immunfarvning af tight junctions. Som et eksempel er ~ 200 nm polymer NCs anvendes som bærer et terapeutisk gods og er belagt med et antistof, der er rettet mod en celleoverflade-determinanten. Antistoffet eller terapeutisk last er mærket med 125I til radioisotop sporing og mærkede NCs tilsættes til det øvre kammer over cellemonolaget i kortere perioder. NCs forbundet med cellerne og / eller transporteres til det underliggende kammer kan påvises. Måling af fri 125I tillader fratrækning af nedbrudte fraktion. Den paracellulære rute vurderes ved at bestemme potentielle ændringer forårsaget af NC transport barriereegenskaber ovenfor beskrevne parametre. Transcellulære transport is bestemmes ved at tage effekten af modulerende endocytose og transcytose veje.
Introduction
Cellular barrierer i kroppen fungerer som en gateway mellem det ydre miljø og indvendige rum. Dette er tilfældet for epitelforingen adskille eksternt eksponerede overflade af den gastrointestinale (GI)-kanalen og blodstrømmen 1-3. Cellulære barrierer også repræsenterer grænsefladen mellem blodbanen og parenkym og cellulære komponenter af væv og organer. Dette er tilfældet for den indre endotelhinden i blodkarrene, såsom blod-lunge barrieren blod-hjerne-barrieren, etc. 1. Evnen til at krydse disse cellulære barrierer i kroppen er afgørende for effektiv levering af terapeutiske og diagnostiske midler i omsætning og væv / organer, hvor der er behov for indgreb.
For at forbedre levering af terapeutiske eller diagnostiske midler, kan disse forbindelser lægges ind i sub-mikrometer nanocarriers (NCS). Disse drug delivery køretøjer kan formuleres med en rækkekemi og strukturer for at optimere lægemiddelopløselighed, beskyttelse, farmakokinetik, frigivelse, og stofskifte 4,5. NCs kan også funktionaliserede med affinitet eller targetingdele (fx antistoffer, peptider sukkerarter, aptamerer osv.) for at lette vedhæftning til områder af kroppen, hvor den terapeutiske virkning kræves 2,6. Målretning af NCs til determinanter udtrykt på overfladen af cellulære barrierer kan yderligere lette transport ind og / eller på tværs af disse foringer 2,6.
Den rolle, som selektivt at transportere stoffer mellem to miljøer kræver, at visse unikke funktioner blandt cellelag. En sådan funktion er cellepolaritet hvorved den apikale membran vender mod lumen af hulrum varierer fra den basolaterale membran orienteret mod vævet interstitium med hensyn til membran morfologi og sammensætning af lipider, transportører, og receptorer 2. En anden funktion indebærer intercellulære Junctions forbinder tilstødende celler. Regulering af de proteiner, der danner stramme vejkryds, især Junctional adhæsionsmolekyler (marmelade), occludins og claudins, modulere barriere funktion til selektivt at tillade eller ikke transport af stoffer mellem celler, kendt som paracellulær transport, tillader passage af materialer fra lumen til den basolaterale rum 3. Binding af mange naturlige og syntetiske elementer (leukocytter, molekyler, partikler og drug delivery systemer) til cellulære barrierer i kroppen kan fremkalde celle-kryds åbning, som kan være forbigående og relativt uskadelige eller mere langvarig, og derfor usikre med adgang uønskede stoffer på tværs af barrieren 2,5,7-9. Følgelig kan denne vej bedømmes ved måling af transepithelial elektrisk modstand (TEER) og passiv paracellulær diffusion af molekyler (heri kaldet paracellulær lækage), nedsat, hvorved modstandsdygtighed over for en elektrisk strøm eller forøget paracellulær lækage af en inert forbindelse i basolaterale rum indikerer åbning af celle vejkryds henholdsvis 5,10,11. For at supplere disse metoder, kan enhver af de stramme krydset proteiner nævnt ovenfor farves for at vurdere deres integritet, hvor farvningen skal vises koncentreret ved celle-celle grænser hele cellen periferien 5,10,12.
Alternativt kan drug delivery systemer, der er rettet mod specifikke celleoverflade-determinanter, såsom dem forbundet med clathrin-overtrukne gruber eller kolbe-formet membran invaginationer kaldet caveolae, udløse vesikulær optagelse i celler ved endocytose, som giver en mulighed for drug delivery til intracellulære rum 5, 13.. Desuden kan endocytose føre til menneskehandel af vesikler i hele cellen kroppen til overgang på den basolaterale side, et fænomen kendt som transyctosis eller transcellulær transport 14. Derfor kan viden om kinetik og mekanisme af endocytose skal bruges til at udnytte intracellulære etnd transcellulær drug delivery, hvilket giver en relativ sikker og kontrolleret leveringsmåde forhold til den paracellulære rute. Mekanismen endocytose kan evalueres med modulatorer af klassiske veje (clathrin-og caveolin endocytose og macropinocytosis) eller ikke-klassiske ruter (såsom tilfælde af celleadhæsionsmolekyle (CAM) endocytose) 5,13,15 .
Der henviser til intracellulær transport ofte undersøgt i standard brønde eller dækglas, fraværet af en basolaterale rum hinder cellepolarisering og evnen til at studere transport tværs cellelag. For at overvinde denne hindring, har transport på tværs cellemonolagene været længe undersøgt ved hjælp transwell indsætter 10,11,16,17, som består af en øvre (apikale) kammer, en porøs membran, hvor cellerne vedhæfte og danne en tæt monolag, og en lavere (basolaterale) kammer (figur 1). I denne konfiguration kan måles transport iapikale-til-basolateral retning ved indgivelse af en behandling i det øvre kammer efter transporten gennem cellemonolaget, og den underliggende porøse membran, og endelig opkrævning af mediet i det nedre kammer til kvantificering af transporteret materiale. Transport i den basolaterale-til-apikal retning kan også måles ved første indgivelse til det nederste kammer og efterfølgende indsamling fra det øvre kammer 5,10,12,16. Forskellige teknikker findes for at kontrollere dannelsen af permeabilitetsbarriere på Transwells, herunder TEER og paracellulære transport assays, som beskrevet ovenfor. Desuden kan det permeable filter på hvilke celler dyrkes fjernes til billeddannelse analyse (fx ved fluorescens, konfokal, elektronmikroskopi) som yderligere validering af cellemonolaget model samt mekanismen for transport. Udvælgelse af membran-type, som er tilgængelig i forskellige porestørrelser, materialer og overfladearealer afhænger af forskellige factors såsom størrelsen af stoffer eller genstande, der skal transporteres, celletype, og billedbehandling metode 16,18-20. Transwell skær også lette kontrolleret og præcis kvantificering af transport i forhold til komplekse pattedyr systemer, som mængderne af kamre og celle areal er kendte konstanter. Mens mange faktorer involveret i in vivo levering elimineres, herunder forekomst af tarm slim, shear stress, fordøjelsesenzymer, immunceller, etc., denne lille skala in vitro-model giver nyttige foreløbige oplysninger vedrørende transport.
Som et eksempel for at illustrere tilpasning af disse metoder til at studere NC transport over cellulære barrierer 10,11,16,17, vi beskriver her en sag, hvor potentialet for NC-transport på tværs af GI epitel blev modelleret ved at vurdere passage af en model drug delivery systemet gennem et monolag af humane epitelial kolorektal adenocarcinom (Caco-2-celler). Til dette formål calen blev dyrket i Transwell skær, på en 0,8 um porestørrelse polyethylenterephthalat (PET) filter (6,4 mm i diameter), der er transparent og kan anvendes til mikroskopi billeddannelse. Status for permeabilitetsbarrieren valideres ved måling TEER, apikal-til-basolaterale transport af et kontrolstof, albumin og fluorescens mikroskopi visualisering af et element af den stramme vejkryds, occludin protein. En model af målrettet polymer NC er brugt, der består af 100 nm, ikke-bionedbrydelige polystyren nanopartikler. NCs coates ved overfladeadsorption med en målsøgende antistof alene eller en kombination af en målsøgende antistof og en terapeutisk last, hvor hver komponent kan være mærket med 125I til radioisotop sporing. I det valgte eksempel antistoffet genkender intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1), et protein, der udtrykkes på overfladen af GI epitel (og andre celler), som har vist sig at lette intracellulær og transcellulær transport o f narkotika luftfartsselskaber og deres last 21. Lasten er alfa-galactosidase (α-Gal), et terapeutisk enzym, der anvendes til behandling af Fabrys sygdom, en genetisk lysosomal aflejringssygdom 22.
De coatede NCS omkring 200 nm i størrelse, tilsættes til det apikale kammer over cellemonolaget og inkuberet ved 37 ° C i varierende tidsrum, hvorefter 125 I på NCs kan detekteres associeret cellemonolaget, og / eller transporteres til den basolaterale kammeret under cellerne. Yderligere bestemmelse af frit 125I tillader subtraktion af den forringede fraktion og estimering af belagt NC transport. Mekanismen for transport vurderes endvidere ved at undersøge ændringer i permeabilitetsbarrieren vedrørende den paracellulære rute gennem de ovenfor beskrevne parametre, mens transcellulær transport bestemmes ved at undersøge ændringer i transport, når modulerende veje endocytose og transcytose.
NDHOLDET "> Disse metoder giver værdifulde oplysninger om cellulær barriere modeller, omfanget og hastigheden af transport af et drug delivery system, og mekanismen for en sådan transport, helt muliggør vurdering af potentialet for drug delivery over cellulære barrierer.Protocol
Representative Results
Discussion
Ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet ovenfor, kan der etableres en celle model til at studere transport af målrettede NCs tværs cellulære barrierer, såsom eksemplet til Caco-2-epitelceller, som er relevante for at vurdere transporten fra GI lumen ind i blodet i tilfælde af oral drug delivery-systemer. Dyrkning af GI epitelial cellemonolag i Transwell indsatse aktiveret måling af TEER og fluorescens immunfarvning af stramme vejkryds for at bekræfte dannelsen af en celle permeabilitetsbarriere. Efter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et fællesskab af Howard Hughes Medical Institute og National Science Foundation til RG, og midlerne tildeles SM af National Institutes of Health (Grant R01-HL98416) og American Heart Association (Grant 09BGIA2450014).
Materials
| Transwell inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1x | Cellgro | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Cellgro | 35-015-CV | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells | ATCC | HTB-37TM | |
| 125Iodine | Perkin Elmer | NEZ033H002MC | Radioactive hazard |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190-235 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Equitech Bio | BAH-66 | |
| Paraformaldehyde (16%) | Fisher Scientific | 15710 | |
| Mouse Immunoglobulin G (IgG) | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM) | Marlin 1987 | ||
| α-Galactosidase, from green coffee beans | Sigma | G8507-25UN | |
| FITC latex beads, 100 nm | Polysciences, Inc. | 17150 | |
| Triton X-100 | Sigma | 234729-500ML | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | SA433-500 | |
| Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human | Santa Cruz Biotechnology | Sc-27151 | |
| Monodansylcadaverine (MDC) | Sigma | D4008 | |
| Filipin | Sigma | F9765 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA) | Sigma | A3085 | |
| Wortmannin | Sigma | W1628 | |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Wizard2 | |
| Volt-ohm meter | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| TEER electrodes | World Precision Instruments | STX100 | Electrodes available for different well-plates |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Malvern | Nano-ZS90 |
References
- Deli, M. A. Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).
- Mrsny, R. J. Lessons from nature: “Pathogen-Mimetic” systems for mucosal nano-medicines. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Torchilin, V. Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).
- Sadekar, S., Ghandehari, H. Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).
- Muro, S. Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems. J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).
- Volkheimer, G. Persorption of particles: physiology and pharmacology. Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).
- Dejana, E. Endothelial cell-cell junctions: happy together. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).
- Jung, T., et al. Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake. Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport. Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).
- Bareford, L. M., Swaan, P. W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).
- Tuma, P. L., Hubbard, A. L. Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).
- Muro, S., et al. A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1. J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).
- Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).
- Delie, F., Rubas, W. A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).
- Kuhnline Sloan, C. D., et al. Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier. Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).
- Kasper, J., et al. Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).
- Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1. J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).
- Hsu, J., et al. Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease. J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).
- Schmiedlin-Ren, P., et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).
- Hughes, J., Crowe, A. Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics. J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).
- Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport. J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).
- Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).
- Kapus, A., Szaszi, K. Coupling between apical and paracellular transport processes. Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).
- Hood, E. D., et al. Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo. J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).
- Simone, E., et al. Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124. Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).
- Vercauteren, D., et al. The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls. Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).
