Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells

Published: August 1, 2013 doi: 10.3791/50662
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Immunology and Microbial Sciences, The Scripps Research Institute
* These authors contributed equally

Summary

Redning av rekombinante arenaviruses fra klonede cDNA'ene, en tilnærming kalt revers genetikk, tillater forskere å undersøke rollen til spesifikke virale genprodukter, samt bidraget av deres forskjellige spesifikke domener og reststoffer, til mange forskjellige aspekter av biologien til arenavirus . Likeledes, revers genetikk teknikker i FDA-godkjente cellelinjer (Vero) for vaksineutvikling gir nye muligheter for generering av effektive og trygge vaksiner for å bekjempe humanpatogene arenaviruses.

Abstract

Utvikling og implementering av arenavirus revers genetikk representerer et betydelig gjennombrudd i arenavirus feltet fire. Bruken av cellebaserte arenavirus minigenome systemer sammen med evnen til å generere rekombinante infeksiøse arenaviruses med forutbestemte mutasjoner i deres genomer har muliggjort undersøkelse av bidraget av virale determinantene til de ulike trinn i livssyklusen arenavirus, samt virus og vert interaksjoner og mekanismer arenavirus patogenesen 1, 3, 11. Dessuten har utviklingen av trisegmented arenaviruses mulig også å benytte den arenavirus genomet til å uttrykke flere fremmede gener av interesse, og dermed åpner muligheten for arenavirus-basert vaksine vektor applikasjoner 5. Likeledes gir utviklingen av single-syklus smittsomme arenaviruses stand til å uttrykke reporter gener en ny eksperimentell verktøy for å forbedre sikkerheten til forskning som involverer highly patogene menneskelige arenaviruses 16. Generering av rekombinant arenaviruses med plasmid-baserte revers genetikk teknikker har så langt støttet seg på bruk av gnager cellelinjer 7,19, noe som utgjør noen barrierer for utvikling av Food and Drug Administration (FDA)-lisensiert vaksine eller vaksine vektorer. For å overkomme denne hindringen, beskriver vi her effektiv produksjon av rekombinante arenaviruses i FDA-godkjente Vero celler.

Introduction

Arenaviruses er kappekledde virus med en bisegmented, negativ-stranded RNA genom tre som tilhører Arenaviridae familien. Den arenavirus genomet koder fire proteiner i en ambisense mote fra to separate viral segmenter tre. Den store (L) segmentet koder RNA-avhengig RNA polymerase (L) og den lille RING (Really Interesting New Gene) finger protein (Z) som fungerer som den viktigste drivkraften for virus spirende. Det lille (S) segment koder for det virale nukleoprotein (NP) og overflaten glykoprotein (GP) (figur 1).

Flere medlemmer av den Arenaviridae familien er ansvarlig for dødelig hemoragisk feber (HF) hos mennesker tre. Av prinsippet bekymringer er Lassa virus (LASV) og Junín virus (JUNV), som er kjent for å forårsake høy dødelighet hos innlagte pasienter 8, 9. Selv om disse virusene er endemisk til Vest-Afrika og landlige Argentina, henholdsvisdet er økende bekymring for import av LASV og JUNV til ikke-endemiske områder på grunn av økt reiseaktivitet 10. I tillegg, selv normalt ikke forbundet med alvorlig sykdom hos mennesker, er prototypic arenavirus lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) regnes som en forsømt patogen som det har vært tilfeller av dødelige infeksjon hos immunsupprimerte pasienter 6, 15 og er ansvarlig for medfødte misdannelser og spontan aborter hos gravide kvinner 2, 13. Foreløpig er det ingen amerikanske FDA-godkjente vaksiner mot arenaviruses og behandling er begrenset til nukleosid analog ribavirin, som er bare delvis effektiv og ofte forbundet med betydelige bivirkninger.

Innføring av plasmid-baserte revers genetikk 4 og generering av rekombinante arenaviruses 7, 19 har sterkt avanserte innen arenavirus forskning. Foreløpig er gnager-celler (slik som BHK-21) benyttet til geneasjon av rekombinante arenaviruses grunn av artsspesifikk murint RNA polymerase I (pol-I) promotor dirigere den innledende transkripsjon av S-og L-segmentene. Men virus redning i BHK-21 cellene ikke er en godkjent metode for generering av rekombinant arenaviruses som potensielle vaksine frø kandidater. Her kan vi dokumentere bruk av den menneskelige pol-I promoter for effektiv redning av prototypic Old World (OW) LCMV og New World (NW) JUNV Candid # 1 belastning i Vero-celler. Ved hjelp av en tilsvarende metodikk, genererte vi rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) og Candid # 1 (r3Candid nr. 1) arenaviruses som inneholder ytterligere to fremmede gener kodet i to forskjellige S RNA segmenter fem. Dette nye systemet ikke bare følger en svært reproduserbare og enkel protokoll, men kan umiddelbart implementeres i produksjon av rekombinante arenaviruses som potensiell vaksine eller vaksine vektor frø.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Arenavirus Rescue Transfection

Vår redningssystem var basert på bruk av både polymerase II-proteinet, ekspresjonsplasmider som koder for nukleoprotein (NP) og RNA-avhengig-RNA-polymerase (L), de virale trans-virkende faktorer som kreves for RNA-replikasjon og gen-ekspresjon av det arenavirus genomet 7, 19, og plasmider som er i stand til å dirigere intracellulær syntese, via den cellulære RNA-polymerase I (pol-I), av S-og L-antigenome RNA-arter 7.. I våre studier benytter vi pCAGGs protein ekspresjonsplasmid, som bruker kylling β-aktin-promotoren og polyadenylanation (Pa) signalsekvenser, og det menneskelige pol-I-plasmidet, som bruker den menneskelige polymerase I promotor-og terminatorsekvenser murine sekvenser (Figur 2) . S-og L RNA segmentene er klonet inn i HPOL-I-plasmidet i en antigenomic orientering for å muliggjøre generering av genomisk RNA segmentene ved transkripsjon ved HPOL-I. For redning av vill-type rekombinant LCMV (rLCMV) og Candid # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP og L fra hver viruset ble samtidig tilført sammen med deres respektive menneskelige pol-I S og L RNA segmenter (figur 3). Generasjon av rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) og Candid # 1 (r3Candid nr. 1) fulgt en lignende protokoll, men S-segmentet ble delt inn i to forskjellige pol-I S plasmider, hver koding en særegen reporter genet: i ett, NP åpne lesing ramme (ORF) ble erstattet med grønt fluorescerende protein (GFP) reporter genet (HPOL-I S GFP / GP), og i den andre, viral glykoprotein forløper (GPC) ORF blir erstattet med Gaussia luciferase (Gluc) reporter genet (HPOL-I S NP / Gluc). En skjematisk representasjon av protokollen er illustrert i figur 4.. Følgende transfeksjon og infeksjon protokollen er etablert for seks-vel-plater.

  1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) blanding: Forbered 250 mL av OptiMEM media og, avhengigpå virus redning, 10-12 ug av LPF2000 (1 ug / mL) pr transfeksjon (tabell 1). Et forhold på 2,5 mikrogram pr LPF2000 ug av DNA er anbefalt. Inkuber i 5 - 10 min ved RT. I mellomtiden forbereder plasmidet transfeksjon blanding i en separat mikrosentrifugerør (trinn 1.2).
  2. Plasmid DNA transfeksjon blanding: Forbered plasmid transfeksjon cocktail i en mikrosentrifuge tube å bruke de anbefalte beløp for hvert virus redning (se tabell 1). Ta med det endelige volumet til 50 mL med OptiMEM.
  3. OptiMEM-LPF2000-DNA plasmid blanding: Tilsett 250 mL av OptiMEM-LPF2000 blanding (trinn 1.1) inn i plasmid DNA transfeksjon blanding (trinn 1.2). Inkuber denne blandingen i 20 - 30 min ved RT. I mellomtiden forbereder og telle 1 x 10 6 Vero celler per transfeksjon reaksjon. Vero celler vil bli tilført i suspensjon.
  4. Utarbeidelse av Vero celler: Vero cells dyrkes i 100 mm retter. Før du starter, bringe 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS media, og trypsin-EDTA blandingen til 37 ° C.
    1. Vask cellene to ganger med 5 ml av 1 x PBS.
    2. Trypsinize celler med 1 ml av trypsin-EDTA og vente til cellene frakoblet (ca. 5 min). Lett tapping kanskje nødvendig å fullt løsne cellene fra rettene.
    3. Nøye, resuspender cellene i 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS i et 15 ml sentrifugerør.
    4. Sentrifuger cellene i 5 min ved 1000 opm i en sentrifuge.
    5. Resuspender cellene i 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og justere konsentrasjonen til 1 x 10 6 celler / ml. Det ble observert at 0,5 - 1 x 10 6 Vero celler pr transfeksjon ga det beste resultatet.
  5. Bland LPF2000/DNA og celler: Etter 20-30 min romtemperatur inkubasjon (trinn 1.3), tilsett 1 ml av Vero-celler (1 x 10 6) (trinn 1.4) tilden OptiMEM-LPF2000-DNA-plasmid blandingen og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
  6. Seed LPF2000/DNA-cell bland inn 6-brønn-plater: Legg DNA-LPF2000-Vero blanding (trinn 1.5) inn i brønnene i 6-brønn plate. Rist 6-brønns-plate og la den transfeksjon inkuberes over natten i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
  7. Endre transfeksjon medium: Ca 16-24 timers post-transfeksjon, fjerne transfeksjon media, tilsett 2 ml av infeksjon media og ruge transfekterte celler i ytterligere 48 timer.
  8. Cell passasje: Etter 48 timer med inkubasjon i smitteforsøk media, fjerne vev kultur supernatanten (TCS) og bestå transfekterte celler i en 100 mm fatet. TCS inneholder sjelden smittsomme virus fordi de transfekterte cellene trenger mer inkubasjon å generere viruspartikler. For cellen passasje:
    1. Vask cellene to ganger med 2 ml av 1 x PBS.
    2. Trypsinize celler w ed 0,5 ml trypsin-EDTA og vente til cellene løsner.
    3. Resuspender cellene i 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
    4. Sentrifuger cellene i 5 min ved 5000 rpm, 4 ° C i en mikrosentrifuge.
    5. Nøye resuspender cellene i 1 ml infeksjon media og overføre cellene til en 100 mm tallerken. Ta opp det totale volumet i platen, med smittsomme media, til 8 ml, et tilstrekkelig volum for å hindre uttørking av cellene så vel som for å konsentrere viruset.
  9. Rist forsiktig på 100 mm fatet og fortsette inkubering av Vero-celler i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2 i 72 timer.
  10. Innsamling av TCS: Etter 72 timers inkubasjon, samle TCS i en 15 ml sentrifugerør. Fjerne celleavfall ved sentrifugering i 5 min ved 2500 opm i en sentrifuge. Infeksiøs arenavirus er funnet i TCS, så fjerne fra celle rusk pellet og lagre TCS ved -80 ° C.
le "> to. Bekreftelse av rekombinant arenavirus Rescue

Påvisning av en vellykket redningsoperasjon av rLCMV og rCandid nr. 1 er oppnådd via et fokus forming unit (FFU) immunfluorescens analysen (IFA). For villtypevirus redning bruker vi antistoffer spesifikke for den virale NP. Den r3LCMV og r3Candid nr. 1 kode to reporter gener (GFP og Gluc), og dermed gir viral deteksjon og titrering uten behov for antistoffer ved fluorescens mikroskopi (GFP) og / eller luminescens (Gluc).

  1. Bekrefte villtype rekombinant arenavirus redning: Dagen før titrering, vaskes to ganger Vero celler med PBS, trypsinize og forberede 96-brønners plater for å nå 80 - 90% konfluens neste dag (4 x 10 4 celler / brønn). Rist platene for hånd for å få en uniformert fordeling av cellene. Kultur cellene, overnatting, i 37 ° C inkubator med 5% CO 2. Sjekk cellene under mikroskop for å bekrefte et enkeltlag, før du fortsetter med infeksjon:
    1. Serielt fortynne (10 fold fortynninger) viruset som inneholder TCS utvinnes fra transfekterte celler i 100 mm fatet (trinn 1.10) i OptiMEM.
    2. Ta ut mediet fra de seedede Vero celler, vask to ganger med 50 mL 1x PBS, og infisere celler med 50 pl av seriefortynnet virus (trinn 2.1). Infisere celler i 1,5 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
    3. Etter infeksjon, fjerne viruset inoculum, tilsett 100 mL av infeksjon media / brønn og inkuberes cellene for 16 - 18 timer. Viral re-infeksjon kan forekomme etter 18 timers inkubasjon, noe som kan resultere i over-estimering av de virale titre.
    4. Med 16 - 18 timer etter infeksjon, fjerner TCS fra hver brønn og fikser cellene med 4% formaldehyd fortynnet i 1X PBS, i 15 min ved RT.
    5. Deretter fjerner fikseringsløsning og permeabilize cellene med 0,1% Triton X-100 fortynnet i 1X PBS, i 10 min ved romtemperatur.
    6. Suge permeabilization løsning, deretter vaske cellene tre ganger with 1x PBS.
    7. Blokker av cellene med 2,5% bovint serum albumin (BSA) i 1 x PBS (blokkering løsning) i 1 t ved RT. Alternativt kan cellene bli blokkert over natten ved 4 ° C og fortsatte med antistoff inkubasjon følgende dag.
    8. I mellomtiden forbereder den primære antistoff. Fortynne LCMV-og Candid # 1-spesifikke primære antistoffer i blokkering løsning, og deretter sentrifuger antistoff / blokkering løsning for 15 min ved 3500 rpm. Det monoklonale anti-LCMV NP antistoff klone 1.1.3 (1:30 fortynning) 16 og det monoklonale anti-JUNV NP antistoff Sa02-BG12 fra BEI Resources (1:500 fortynning) kan brukes for påvisning av rLCMV og rCandid # 1 , respektivt.
    9. Etter 1 time inkubering aspireres blokkering løsningen og tilsett 50 pl av det primære antistoff til cellene og inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
    10. På denne tiden, fortynne det sekundære antistoffet blokkerer i løsning, og deretter sentrifuger antistoff / blokkering løsning i 15 min ved 3500 rpm. Polyklonale kanin-anti-mus-IgG-FITC sekundært antistoff for påvisning av primære monoklonale antistoffer ble brukt til å oppnå bilder som observert i figur 5..
    11. Etter 1 time inkubering aspireres det primære antistoff, vask 3 ganger med 1 x PBS, og legge det sekundære antistoff i 30 min ved 37 ° C.
    12. Etter 30 min inkubering aspireres det sekundære antistoff og vask 3 ganger med 1 x PBS. Cellene er nå klar til å bli observert med fluorescens mikroskopi å både finne ut hvor vellykket viral redning og titrering ved å telle fokus forming enheter per ml (FFU / ml).
  2. r3LCMV og r3Candid nr. 1 viral redning: Siden disse virusene uttrykke to reporter gener, redder deres kan overvåkes av fluorescens mikroskop for å oppdage GFP uttrykk eller Gluc uttrykk i TCS. Rescue kan også bekreftes av uttrykk for Gluc i TCS. Å titrere de trisegmented virus, følger vi trinn 2.1 til 2.1.4, men cellene ikke trenger å be løst å bestemme en vellykket viral redning på grunn av GFP uttrykk. Titreringen av viruset bestemmes ved å telle FFU / ml. Å bestemme vellykket viral unnsetning ved Gluc uttrykk, Gluc uttrykk fra TCS kan måles ved hjelp av en Gluc analysen kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay kit, New England Biolabs). For å nå dette målet:
    1. Pipetter 100 mL av TCS i en 96-brønns hvit plate (flat bunn mikrotiterplater, Fisher Scientific).
    2. Sett opp luminometer (LumiCount, Packard biovitenskap).
    3. Legg 50-100 pl analyseoppløsning Gluc (som anbefalt av produsenten) til hver prøve og måle Gluc reportergen uttrykket med luminometer. Som en negativ kontroll, ble Gluc uttrykk for TCS fra vill-type virus infiserte celler målt.

3. Passering av vevskulturstudier Supernatanter

Viral redning avhenger transfeksjon effektivitet. Vero-celler er blitt vistå ha lavere transfeksjon effektivitet enn andre cellelinjer 14. Hvis virus-titere i TCS er lave, infisere frisk Vero-celler ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 0,01 (LCMV) eller 0,1 (Skjult # 1) i 72 timer for å forsterke viruset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket redning av en rekombinant villtype arenavirus vil bli bekreftet ved nærværet av virale antigener ved hjelp av IFA (figur 5). I tilfelle av rekombinante trisegmented virus, kan vellykket viral redning skal vurderes ved å observere GFP uttrykk ved fluorescens mikroskopi (figur 6A). Vellykket redning vil bli ytterligere bekreftet ved å vurdere ekspresjon Gluc (figur 6B). Representative resultatene illustrerer den vellykkede redningen av vill-type og trisegmented arenavirus ble innhentet ved hjelp av ovennevnte indikert protokollen.

Figur 1
Figur 1. Arenavirus genom organisering og virion struktur. Arenaviruses er kappekledde, negative-sense RNA virus med bisegmented genomer tre. Hvert segment benytter en ambisense koding strategi for å lede syntesen av virale to proteins i motsatt retning tre. De store (L)-segmentet (7,2 kb) koder for RNA-avhengig-RNA-polymerase (L) og den lille ring finger protein (Z) som har matriks-lignende funksjoner, herunder dirigere den spirende prosess 3.. The Small (S)-segmentet (3,5 kb) koder glykoprotein forløper (GPC) og nucleoprotein (NP). GPC er post-translasjonelt prosessert for å produsere GP-1 og GP-2, som assosierer for å danne glykoproteinkompleks (GP) som danner piggene på overflaten av virionet struktur er ansvarlig for gjenkjennelses-og celleinnskrift 17, 18. NP encapsidates viral RNA (vRNA) genom og sammen med L protein skjema viral ribonucleoproteins (vRNPs) som er de minimale komponenter for viral replikasjon og transkripsjon 12.. IGR: intergenic regionen.

Figur 2
Figur 2. Arenavirus rescue plasmider. diagram av plasmidene som brukes for generering av rekombinant arenavirus i Vero-celler. Proteinekspresjon pCAGGs plasmid bruker kylling β-aktin-promotoren og kaninen β-globin polyadenylering (Pa) signalsekvenser for å lede syntesen av virale L og 4. NP, 7.. CMV-IE Enhancer: cytomegalovirus umiddelbar tidlig enhancer. Intron: kylling β-actin intron sekvens. Den HPOL-I plasmidene anvendes det humane polymerase I promotor-og terminatorsekvenser murine polymerase for å lede syntesen av virale RNA-segmenter. Begge pCAGGs og HPOL-I plasmider er ampicillinresistente (Ampr).

Figur 3
Figur 3. . Villtype og trisegmented arenavirus redning I det sorte oval er plasmidene som kreves for generering av rekombinant vill-type arenavirus: pCAGGs NP, og L, og HPOL-I S og L. NP og L er kreved å initiere viral transkripsjon og replikering. Den HPOL-I S og L direkte intracellulær syntese, via pol-I, av S og L antigenomic RNA arter. I den røde oval er plasmidene som kreves for generering av trisegmented arenaviruses: pCAGGs NP og L, så vel som den HPOL-I L-plasmidet, som er de samme som de som er beskrevet for villtype arenavirus redning. Den HPOL-I S er delt i to plasmider: i ett plasmid, er NP erstattet med GFP (HPOL-I S GFP / GP) og i den andre plasmid, blir GP erstattet av Gluc-genet (HPOL-I S NP / Gluc ).

Figur 4
Figur 4. Arenavirus redning protokollen. Arenavirus redning er gjort i Vero-celler ved hjelp av en 6-brønn plate format. Kort fortalt er Vero celler transfekte i suspensjon på dag 1 med Lipofectamine 2000. På 24-timers post-transfeksjon, er media erstattet med friske smittsomme media. Transfekterte celler blir inkubert ytterligere 48 timer og deretter skalert opp i en 100 mm skåler (dag 4). Vero-celler i 100 mm skåler ble inkubert i ytterligere 72 timer. På dag 7 post-transfeksjon TCS samles for viral påvisning av enten IFA (rLCMV og rCandid nr. 1) eller fluorescens mikroskopi (r3LCMV og r3Candid nr. 1) etter smitte i friske Vero celler. Hvis de virale titere er lavere enn forventet, kan TCS brukes til å infisere frisk Vero-celler for å forsterke viruset.

Figur 5
Figur 5. Bekreftelse på en vellykket vill-type viral redning. TCS fra celle passasje (100 mm skåler) brukes til å infisere frisk Vero-celler i 96-brønners plater. På 24-timers post-infeksjon, er celler fast, permeabilized, og blokkeres før farging med LCMV-eller Candid # 1-spesifikke antistoffer. Tilstedeværelse av virale antigener er observert med fluorescens mikroskopi. Scale barer, 100 mikrometer.

telt "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 6
Figur 6. Vellykket redning av trisegmented virus. Rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) og Candid # 1 (r3Candid nr. 1) kode både GFP og Gluc. Vellykket viral redning kan hurtig bestemmes ved fluorescens mikroskopi (A). Gluc reporter gen ekspresjon kan brukes som en sekundær bekreftelse av viral redning. Fold induksjon ble bestemt ved normalisering av Gluc luminescens verdier til villtypevirus infeksjoner (B). Scale barer, 100 mikrometer.

Tabell 1
Tabell 1. Lipofectamine / plasmid DNA konsentrasjon for arenavirus redning. Anbefalt DNA og LPF2000 konsentrasjoner for generering av rekombinant wild-type og trisegmented arenaviruses i Vero-celler er indikert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Generasjon av rekombinant arenaviruses med plasmid-baserte revers genetikk teknikker har blitt en mye brukt metode for undersøkelse av mange forskjellige fasetter av arenavirus biologi. Her kan vi dokumentere en avgjørende forbedring av dagens system ved å utføre arenavirus redder i Vero-celler, noe som åpner for potensielle generasjon av FDA-godkjente vaksine kandidater mot arenaviruses og vaksine vektorer mot andre smittsomme sykdommer.

De eksperimentelle prosedyrer involvert er generelt godt etablert og bør ikke utgjøre betydelige hindringer. Det er imidlertid flere faktorer som bør overvåkes nøye for å sikre en konsekvent suksess. Riktig vedlikehold av Vero celler er avgjørende for en vellykket viral redning. I tillegg er det viktig å ha gode plasmid forberedelser for å generere rekombinant arenavirus (se protokoll for riktig celle vedlikehold og plasmid forberedelse). For redningen av rLCMV og rCandid # 1 vill-type eller deres trisegmented versjoner anbefales det tre uavhengige transfections for hver rekombinant virus for å øke sannsynligheten for en vellykket redningsoperasjon, som Vero-celler er ikke lett tilført 14. Hvis mer enn én rekombinant virus redning er forsøkt, skalere følgende trinn i henhold til antall virus for å bli reddet. Som en negativ kontroll, inkluderer vi en transfeksjon i fravær av pCAGGs NP (-pCAGGs NP).

Siden LCMV-og Candid # 1-infiserte celler ikke vise klassiske cytopatisk effekt (CPE), vellykket viral redning av vill-type rLCMV og rCandid # 1 virus må vurderes gjennom påvisning av infeksiøs avkom, som kan gjøres ved hjelp av en klassiker plakk analysen eller via IFA. Vi anbefaler bruk av IFA over klassiske plakk analysen fordi det tidligere kan være fullført innen 24 timer i stedet for 5 - 6 dager som kreves for utvikling av plakk. Den r3LCMV eller r3Candid nr. 1 ble reddet kode to reporter gener (GFP og Gluc), og dermed gir viral deteksjon og titrering uten behov for antistoffer ved fluorescens mikroskopi (GFP) og / eller luminescens (Gluc). Som i redningen av rekombinant LCMV og Candid # 1 vill-type redning, vil et mislykket trisegmented virus redning resultere i mangel av fluorescerende Vero celler ved vaksinasjon med TCS fra transfekterte celler.

Gitt at S-og L-segmentene blir drevet av det menneskelige polyermase I promoter, kan denne redningssystem anvendes i andre humane celler. Faktisk har vi også lykkes generert både rekombinant vill-type og trisegmented rLCMV og rCandid # 1 virus i 293T humane embryonale nyre celler med høy effektivitet. I tillegg, transfeksjon i cellemonolagene resulterte også i virus redning, om enn ikke så effektivt som ved transfeksjon av Vero-og 293T-celler i suspensjon. I forhold til påvisning av villtype LCMV og Skjult # 1 viral redning, kan primære antistoffer mot andre virale proteiner kan også brukes. IVed R3 virus, kan vi oppdage Gluc ved luminescens stedet for GFP uttrykk. Alternativt kan andre reporter genene bli brukt i stedet for Gluc og GFP 5..

Vår virus redning systemet har vist seg å være svært effektiv i våre hender, og her gir vi de beste transfeksjon forhold. Det er sterkt anbefalt å bruke de angitte mengder plasmider. Dersom viruset redning utføres i andre humane cellelinjer, mengden av cellene, DNA, og / eller LPF2000 skal testes.

Generering av vill type og trisegmented arenavirus med plasmid-baserte revers genetikk i Vero-celler vil gi rom for å studere flere aspekter av biologi arenavirus så vel som for den fremtidige utviklingen av FDA-godkjente vaksiner og vaksine vektorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker tidligere og nåværende medlemmer i JCT og LM-S laboratorier for utvikling og forbedring av arenavirus revers genetikk teknikker og plasmider. Vi takker også Snezhana Dimitrova for teknisk støtte. Den monoklonalt antistoff rettet mot JUNV NP (Sa02-BG12) ble innhentet fra BEI Resources (NIAID Biodefense og Emerging Infeksjoner Forskning Resources Repository). BYHC ble støttet av Grant Number GM068411 fra Institutional Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R er et Fullbright-Conicyt (BIO 2008) og en Rochester Vaccine Fellowship (2012) mottaker. EO-R nåværende støtte er gitt av en postdoktorstilling for Mangfold og Academic Excellence fra Office for Fakultet Development & Diversity ved University of Rochester. Forskning i LM-S Laboratoriet er finansiert av NIH tilskudd RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence for Influensa Forskning og overvåkning (HHSN266200700008C), ogThe University of Rochester Center for Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).

Forskning ved JCT laboratoriet ble støttet med tilskudd RO1 AI047140, AI077719, RO1 og RO1 AI079665 fra NIH.

Materials

Material and methods
Cell lines
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 °C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586).

Plasmids
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 °C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 °C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 °C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis.

Viruses
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed.

Tissue culture media and solutions
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 °C. This media will be used for maintenance of Vero cells.

Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 °C. This media will be used during viral infections.

10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature.
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature.
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 °C. This is used as a blocking solution for IFA.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
  2. Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).
  3. Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827 (2007).
  4. Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
  5. Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
  6. Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
  7. Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
  8. Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
  9. Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
  10. Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
  11. Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
  12. Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
  13. Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
  14. Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
  15. Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
  16. Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
  17. Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
  18. Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
  19. Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).

Tags

Virologi Infeksjon Infectious Diseases molekylærbiologi cellebiologi medisin Biomedical Engineering virus arenaviruses plasmid transfeksjon rekombinant virus revers genetikk teknikker vaksine / vaksine vektor seed utvikling kliniske applikasjoner
Generasjon av rekombinant arenavirus for Vaccine Development i FDA-godkjente Vero Cells
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño,… More

Cheng, B. Y. H., Ortiz-Riaño, E., de la Torre, J. C., Martínez-Sobrido, L. Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells. J. Vis. Exp. (78), e50662, doi:10.3791/50662 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter