在FDA批准的Vero细胞疫苗开发产生重组沙粒

Summary

救援重组砂粒病毒克隆的cDNA，称为反向遗传学的方法，使研究人员能够调查特定的病毒基因产物的作用，以及其不同的具体领域和残留物的贡献，砂粒病毒的生物学的许多不同方面。同样，反向遗传学技术在FDA批准的细胞系（Vero）疫苗研制的新一代安全有效的疫苗，打击人类致病的砂粒病毒提供了新的可能性。

Abstract

沙粒病毒反向遗传学的发展和实施代表的一个重大突破在沙粒领域^4。沙粒病毒的生命周期的不同步骤的调查病毒的决定因素的贡献，以及病毒 - 宿主细胞为基础的沙粒一起能够产生预定在他们的基因组突变重组传染性砂粒病毒微型基因组系统的使用提供了便利相互作用和机制沙粒病毒发病机制^{1，3，11。}此外，已经允许发展trisegmented砂粒病毒沙粒病毒基因组的表达还额外的外源基因的使用，从而打开的可能性的沙粒病毒为基础的疫苗载体的应用^5。同样，单周期能够表达报告基因的传染性砂粒病毒的发展提供了一种新的实验工具，提高了安全性的研究，涉及极力Ÿ人类致病的砂粒病毒^16。代重组砂粒病毒质粒为基础的反向遗传学技术至今依赖于啮齿动物细胞线使用^7,19，这带来了一些障碍，发展食品和药物管理局（FDA）许可的疫苗或疫苗载体。为了克服这个障碍，我们在这里描述的高效生成重组砂粒病毒在FDA批准的Vero细胞。

Introduction

与一个bisegmented，负链RNA基因组的³属于沙粒病毒科的的砂粒病毒是有包膜的病毒。沙粒病毒基因组编码的蛋白质在一个的时尚ambisense从两个不同的病毒分部^3。大（L）段编码RNA依赖的RNA聚合酶（L）和小环（非常有趣的新基因）指蛋白（Z）作为病毒出芽的主要推动力。小段（S）编码病毒的核蛋白（NP）的表面糖蛋白（GP）（ 图1）。

沙粒病毒科的几位成员负责致命的出血热（HF）在人类^3。原则问题是拉沙病毒（LASV）和胡宁病毒（JUNV），这是众所周知的导致高死亡率住院患者^8，9。尽管这些病毒的西非和阿根廷农村地区，分别是地方性的，有越来越多的关注进口LASV JUNV的非流行地区由于旅游增加^10。此外，尽管通常不伴有严重的人类疾病，被认为是原型沙粒淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）一个被忽视的病原体已经有致死性感染的情况下，在免疫功能低下的患者^6，15，先天性出生缺陷和自然流产负责孕妇中^，13。目前，还没有美国FDA批准的疫苗的砂粒病毒和治疗是有限的，以三氮唑核苷核苷类似物，这是只是部分有效，并经常伴有显着的副作用。

基于质粒重组砂粒病毒^7,19反向遗传学

Protocol

1。沙粒病毒救援转

我们的救援体系的基础上使用两个聚合酶II蛋白表达质粒编码的核蛋白（NP）和RNA依赖的RNA聚合酶（L），病毒所需的沙粒病毒基因组RNA的复制和基因表达的反式作用因子^7，19，和能够直接细胞内合成，通过细胞的RNA聚合酶I（聚合酶-I）中，将S和L反基因组RNA的物种^7的质粒。在我们的研究中，我们使用pCAGGS中的蛋白表达载体，使用的鸡β-肌动蛋白启动子和polyadenylanation（PA）的信号序列，和人的聚合酶我的质粒，使用人的聚合酶I启动子和小鼠的终止子序列（ 图2） 。的S和L RNA片段被克隆到HPOL-I方向反基因的质粒HPOL-I的转录产生基因组RNA片段时允许。为抢救野生-TYPE重组LCMV（rLCMV）和坦诚的＃1（rCandid＃1）将pCAGGS NP和L每个病毒共转染连同各自的人力POL-I S和L RNA片段（ 图3）。重组trisegmented LCMV（r3LCMV）的和坦诚的＃1（r3Candid＃1）的产生遵循了类似的协议，但在S段被分成两个不同的POL-I S质粒，每个编码鲜明的报告基因于一体，NP开放阅读框（ORF）的绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因（HPOL-I S GFP / GP）和病毒糖蛋白前体（GPC），在另一方面，Gaussia荧光素酶（GLUC）报告基因的ORF被替换为....

Results

抢救成功重组野生型沙粒将被确认使用IFA（ 图5）病毒抗原的存在。成功的病毒拯救的重组trisegmented病毒的情况下，可以评估通过观察GFP的表达，通过荧光显微镜观察（ 图6A）。抢救成功，将进一步证实通过评估GLUC的表达（ 图6B）。代表性的成果，说明抢救成功野生型和trisegmented的沙粒使用上述表示的协议。

图1。沙粒病毒基因组结构和病毒粒子的结构。的砂粒病毒是包膜的负链RNA病毒与的bisegmented基因组^3。每个段使用一个ambisense编码策.......

Discussion

代重组砂粒病毒使用基于质粒反向遗传学技术已经成为一种广泛使用的方法调查砂粒病毒生物学的许多不同的方面。在这里，我们记录到当前系统中的一个关键的改进，通过执行沙粒救援在Vero细胞中，允许对砂粒病毒和疫苗载体对其他传染病的潜在代FDA批准的候选疫苗。

实验过程涉及的一般完善，应该不会构成重大障碍。然而，有几个因素，应仔细监测，以确保一致的成功。 Vero细胞的正确维护是一个成功的病毒救援的关键。此外，它是必须有良好的载体制剂，产生重组的沙粒（见适当的细胞维护和质粒制备的协议 ）。对于救援的rLCMV rCandi的- ＃1野生型或trisegmented的版本建议三个独立的各重组病毒转染增加抢救成功的可能性，因为Vero细胞不容易转染^14。如果有一个以上的重组病毒拯救尝试，相应地缩放以下步骤获救病毒的数量。作为阴性对照，我们包括在没有将pCAGGS（NP-pCAGGS中NP）转染。

由于LCMV和坦诚的＃1感染的细胞不显示典型的细胞病变效应（CPE），成功的病毒救援野生型rLCMV的和rC.......

Materials

List of materials used in this article

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材料和方法
细胞系 Vero E6（非洲绿猴肾上皮细胞）维持在 37 ° 中;C培养箱，含5 % CO2溶于DMEM 10 % FBS 1 % PS中。细胞可从美国典型培养物保藏中心（ATCC，目录号CRL-1586）获得。 质粒 除hpol-I L外，所有质粒均可在37°C下生长;C，放置 16-18 小时。我们建议 hpol-I L 的培养物在 30 °C 24 小时。按照制造商的建议使用质粒 maxi 试剂盒（EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit，Omega Bio-tek）制备质粒，并储存在 -20 &°C。通过分光光度法在 260 nm 处测定纯化的 DNA 质粒的浓度，并使用 260：280 nm 比率估计纯度。具有 1.8-2.0 260：280 nm 比率的制剂被认为适用于病毒拯救目的。此外，质粒浓度和纯度应通过琼脂糖凝胶电泳确认。 Viruses 所述的拯救 rLCMV （Armstrong 53b） 和 rCandid#1 的方案可以在生物安全等级 （BSL） 2 条件下执行。受污染的材料，包括 TCS 和细胞，应在处置前进行消毒。拯救其他沙粒病毒可能需要更高的 BSL 设施，因此必须遵循适当的安全/安保措施。 组织培养基和溶液 >< DMEM 10 %FBS 1 %PS： 445 ml Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）， 50 ml 胎牛血清 （FBS） 和 5 ml 100X 青霉素/链霉素 （PS）。储存在 4 °C 下。该培养基将用于维持 Vero 细胞。 传染性培养基：OptiMEM 和 DMEM 10 %FBS 1 %PS 的 2 比 1 混合物。储存在 4 °C。该培养基将在病毒感染期间使用。 10X 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）： 80 克 NaCl、2 克 KCl、11.5 克 Na2HPO4.7H2O， 2 克 KH2PO4。添加 ddH2O 至 1 升。将 pH 调节至 7.3。通过高压灭菌器灭菌。 1X PBS： 用 ddH2O 以 1：10 的比例稀释 10X PBS。通过高压灭菌器灭菌并在室温下储存。 2.5% BSA：2.5 g BSA 溶于 97.5 ml 1X PBS 中。储存在 4 °C 下。这用作 IFA 的阻塞解决方案。