Summary
"동결 균열"선충 C.의 내부 조직을 노출시키는 방법 단백질의 지역화를위한 항체의 elegans는 보여줍니다.
Abstract
C. 얼룩하려면 항체 엘레은 상대적으로 스며 들지 표피는 화학 물질 또는 기계적인 방법으로 우회해야합니다. "동결 균열은"물리적으로 두 개의 부착 슬라이드 사이에 선충을 압축을 동결하고, 떨어져 슬라이드를 당겨 선충에서 표피를 당겨하는 데 사용하는 한 가지 방법입니다. 동결 크래킹 화학적 처리없이 조직에 접근 할 수있는 간단하고 신속한 방법을 제공하고, 고정 제의 종류와 사용될 수있다. 그러나, 시편의 많은 손실로 연결하고 필요한 압축 기계적 샘플을 왜곡. 연습은 좋은 형태로 샘플의 회복을 극대화하기 위해 필요합니다. 동결 균열은 특정 고정 조건, 샘플의 복구, 또는 낮은 비특이적 염색에 최적화 된,하지만 모든 매개 변수에 대해 한 번에 할 수있다. 열심히 고정 조건을 필요로하고 화학적으로 표피를 투과하는 데 필요한 화학적 처리, treatmen를 허용 항체솔루션에 그대로 선충의 t는 바람직 할 수있다. 항체는 점화기 수정을 필요로하거나 최적 정착 조건이 알려지지 않은 경우에, 동결 크래킹 급속 항체을 검정하고 그 항원에 대한 특정 세포 내 및 세포 지역화 정보를 얻을 수있는 매우 유용한 방법을 제공하는 경우.
Introduction
단백질의 세포 및 세포 내 현지화를 결정하기 위해, 과학자들은 전통적으로 구체적으로 특정 단백질 1을 인식하는 선택 항체와 조직을 표시했다. C와 같은 일부 모델 생물에서 엘레, 항체 염색은 종종 더 빠르게 결과를 얻을 분자 유전 학적 기술에 의해 대체되었습니다. 이들은 발기인 및 관심과 녹색 형광 단백질의 유전자의 코딩 영역 사이의 유전자의 융합으로 이루어진 구조로 변형 생물체 (가) 있습니다. 그러나, 분자 기술은 진정한 프로와 높은 사본 번호 (C. elegans의에서 통상의 기술) 2,3에서 구조의 발현의 변화를 알 수있는 문제를 포함하여 유물의 숫자로 될 수 있습니다. 따라서 항체 염색은 생체 내에서 단백질 기능을 연구 많은 과학자의 골이 남아있다.
항체와 조직을 염색하는 것은 어려울 수 있기 때문에tibodies는 특정 형태 1에서 자신의 항원을 인식 할 수 있습니다. 예를 들어, 항체는 특정 방식으로 고정 만 변성 또는 손상 항원을 인식 할 수 있으며, 현장에서 항원을 인식하지 못할 수 있습니다. 선충의 항체 염색의 문제는 선충의 표피 조직에 대한 항체의 액세스를 차단, 상대적으로 불 침투성 장벽을 형성한다는 사실에 의해 악화된다.
C. 항체 염색에 사용되는 여러 가지 방법이 있습니다 엘레 (우리의 이전 작업에서 검토 4). 그대로 얼룩이 '웜'방법은 동결 상대적으로 하드 정착 (포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드)에 해동하기 위해 개발되었습니다, 동결 해동 사이클은 정착 5의 빠른 침투를 허용하는 표피를 해독하는 데 도움이됩니다. 방법은 제, 콜라게나 제, 또는 둘 모두를 감소 5-7 치료를 포함; 고정 후, 표피는 항체의 침투를 허용하기 permeabilized 하였다. 이 treatments는 형태를 유지하지만, 종종 항체 인식을 감소 시키거나 파괴. 다른 방법은 항체의 침투를 허용하는 해부 8 있습니다.
"동결 균열은"항체가 9-10 염색 할 수 있도록 반 그대로 웜의 내부에 액세스 할 수있는 한 가지 방법입니다. 콜라게나 제 및 환원 처리를 회피하면서 동결 크래킹 정착 다양한 조건으로 행할 수있다. 선충은 두 접착제 슬라이드 사이에 냉동 한 다음 슬라이드가 분리되어, 하단 슬라이드에 선충의 대부분 상단 슬라이드에 표피의 대부분을 떠나고있다. 바닥 슬라이드 정착액에 배치 될 수 있고 부착 선충과 전체 슬라이드는 항체 염색 절차를 통해 전송된다. 이 방법은 현재 두 가지 어려움을한다. 첫째, 그들을 심각하게 변형없이 선충을 분리하는 데 필요한 압력의 정확한 금액을 적용하기가 어렵습니다. 둘째, 웜의 많은의하지 않습니다하나의 슬라이드에 진드기 및 정착 또는 헹굼에 손실됩니다. 그러나, 적절한 슬라이드 및 연습, 방법은 급속 고정 제와 항체의 다양한 함께 사용할 수있는 적당한 형태로 선충을 수득한다.
방법은 실험의 목표에 따라 다소 변할 수있다. 단일 선충의 염색이 (예를 들어, 하나의 형질 전환 항체 염색을 변경했는지 여부를 확인하기 위해) 필요한 경우, 최대 접착력과 슬라이드 (그러나 높은 배경 염색) (아래 참조)와 같은 별도의 폴리 라이신 실험실 준비된 슬라이드로 사용할 수 있습니다. 선충이 고착 후 폴리 라이신을 더 가난하게 준수하기 때문에 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드 고정 용, 높은 접착 슬라이드 (실험실에서 제조 된 폴리 라이신 슬라이드), 사용되어야한다. 야생형 선충은 메탄올 및 / 또는 아세톤으로 고정되는 경우, 낮은 밀착성 슬라이드 및 하부 배경 염색 표기 (상업적 또는 L) 슬라이드를 aboratory - 준비. 항체 및 고정 제의 다양한 실험실에서 사용중인 경우, 슬라이드의 선택은 미리 제조 될 수 있고, 필요할 때까지 저장된다.
선충 조직에 대한 액세스가 획득 한 후, 항체 염색 절차는 (더 이상 조직의 특성 배양보다는 세포 1,11으로) 표준 방법을 따릅니다.
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Protocol
참고 : 다중 프로토콜 단계를 설정 및 실험의 특정 조건에 따라 준비를위한 옵션이 표시됩니다. 이러한 경우, 다른 단계는 다른 단계와 프로토콜이 그림 1에 설명되어 있습니다 A, B, C 등으로 표시하고 있습니다.
1. 폴리 라이신 코팅 슬라이드의 준비
슬라이드의 세 가지 종류가 준비, 상대 밀착성, 및 항체의 비특이적 결합의 용이성 간의 희망 트레이드 오프에 따라 사용될 수있다. 슬라이드 준비 대안의 세부 밀착성 및 복잡성을 증가하는 순서의 단계 1A-1C에서 아래에 주어진다. 이러한 다양한 방법에 의해 제조 된 슬라이드는 하나의 실험을 위해 함께 사용될 수있다.
1A. 더 슬라이드 준비하지
상업적으로 이용 가능한 폴리 라이신 코팅 된 슬라이드는 낮은 접착력과 낮은 배경을 제공합니다.
1B. 슬라이드 홍보메탄올, 아세톤 고정 용 eparation의 최적
중간 접착력과 낮은 배경.
- 슬라이드를 찍기 위해 폴리 라이신 솔루션을 준비 : 매우 높은 분자량 400 mg의 추가 - 증류수 200 ㎖에 (150,000 300,000 D) 폴리-L-라이신을. 방부제로 2 ㎖의 10 % 아 지드 화 나트륨 재고 (최종 농도 0.1 %)를 추가합니다. 주의 : 건조 아 지드 화 나트륨은 반응성이 모든 형태의 독성이 있습니다. 무게 분말을 증류수에 10 %의 주식을 확인하는 동안 마스크와 장갑을 착용 할 것.
- 보풀이없는 잎사귀 제거 얼룩 및 입자와 단일 엔드 젖빛 유리 슬라이드를 닦아냅니다. 이것은 지정과 함께 구입 한 슬라이드에도 수행해야합니다 "미리 세정."
- 장소는 백 - 투 - 백 슬라이드 홀더, 코 플린 항아리 또는 기타 슬라이드 염색 용기, (나중에 분리를 쉽게하기 위해) 위로 꽤 완벽하게 정렬 프로스트 가장자리를 유지하는 슬라이드. 70 % 에탄올 (시약 급 알코올 필요하지) 디 1 % 염산과 함께 비커에 슬라이스 홀더를 배치물을 잠잠 또는 설탕의 수준으로 염색 항아리를 채우십시오. 최소 5 분을위한 솔루션에 슬라이드를 록. 주의 :이 솔루션은 부식성, 장갑을 착용하십시오. 참고 :이 솔루션은 (몇 개월까지) 여러 번 재사용 할 수 있습니다.
- 1 분 동안 증류수를 실행에 슬라이드를 씻어.
- 30 ~ 60 분 동안 40 ~ 60 ° C의 오븐에 배치하거나 하룻밤 동안 실온에서 유지하여 하나 먼지가없는 환경에서 완전히 건조 슬라이드.
- 15 분 동안 로커에 (unfrosted 부분을 커버) 폴리 라이신 용액에 슬라이드를 품어.
- 슬라이드의 건조를 반복합니다.
- 폴리 라이신 솔루션 배양 및 건조 단계를 반복합니다.
- 같은 얇은 무게 주걱으로 슬림 금속 물체를 사용하여 슬라이드를 분리합니다. 이들이 적절하게 부착하는 경우, 그들은 분리하기 어렵다. 적절한 안전 장비 (보안경)를 착용하고 슬라이드가 분리 될 때 유리의 작은 비트가 느슨한 날 수 있기 때문에, (사용 후 폐기되는) 벤치 탑 종이에 작동합니다.
- 청소에 보관 슬라이드4 ° C에서 (먼지가없는) 슬라이드 상자 필요할 때까지.
1C. 포름 알데히드 고정을위한 준비의 최적의 슬라이드
최고 접착하지만 높은 배경.
- (공기 건조) (오븐에서 건조) 먼지가없는, 레인지 용 그릇이나 먼지가없는 평평한 표면에 방법 1b의 평면을 준비 장소 슬라이드.
- 각 슬라이드의 중간에 폴리 라이신 용액 20 ~ 60 ㎕의 드롭 놓습니다.
- 완전히 오븐에서 또는 실내 온도에서 건조 슬라이드. 이 증발 폴리 라이신 창백 타원 뒤에 떠날 것이다. 이 타원은 매우 접착제입니다. 불행하게도, 그들은 또한 심지어 차단 후, 일차 및 이차 항체에 결합한다.
- 4 ° C에서 청소 (먼지가없는) 슬라이드 상자에 보관 슬라이드는 필요할 때까지.
2. 냉동 선충류 슬라이드의 준비
완전히 (선충의 접시에) 방법 2A를 사용하여 박테리아의 무료 세척 또는에 의해 염색에 대한 선충 준비2B (개인 선충에 대한).
2A. 선충의 플레이트에서 슬라이드의 준비
- prechill하는 드라이 아이스에 금속의 평면 조각을 놓습니다.
- 1.5 밀리리터의 microfuge 튜브에 박테리아 NGM 접시에서 벌레를 씻어 증류수 및 유리 피펫 (웜의 손실을 감소) 또는 마이크로 피펫을 사용합니다. 플레이트는 나이를 동기화하거나 혼합 할 수 있으며, 필요한 경우가 아니면 (금하기 어려운) 많은 dauers 또는 굶주린 벌레 (증가 형광도)와 플레이트를 사용하지 않습니다.
- 박테리아의 무료 때까지 증류수로 벌레에게 3 배를 씻어. (웜의 손실을 줄이기 위해 같은 유리 피펫을 사용합니다.) 중 하나, 웜 펠렛 그들 (튜브의 바닥에 주로 성인을 수집하기 위해) 3 ~ 5 분 동안 벤치에 앉아 또는 ~ 1,000 rpm에서 30 초를 회전하도록하려면 (~ 500 탁상 원심 분리기 G) () 성인, 유충, 배아를 수집합니다.
- 웜과 같은 물을 약 2 배 볼륨을 떠나, 웜과 튜브에서 대부분의 물을 제거합니다 (그러나 적어도 25 ㎕의 총 부피).
- 가능한 일반 (닦아 깨끗하지만, 폴리 라이신 처리하지 않음) "최고"슬라이드의 같은 수 있습니다.
- 플레이스 ~ "바닥"부착 슬라이드 및 피펫 팁의 측면을 사용하여 슬라이드의 중앙부 위에 벌레를 함유 액을 확산 물 25 μL 웜.
- 벌레가 30 초 분 2에 대한 해결하자. 슬라이드가 적절하게 끈적 끈적한 경우가 슬라이드를 문의로, 벌레의 끝을 찌를 것이다.
- 한 손으로 바닥 슬라이드를 잡고 서리 낀 부분 만 모두가 중복되도록 아래 슬라이드를 통해 상단 슬라이드를 놓습니다. 웜은 여전히 흔들리지 않도록 액체는 약간 떨어져 슬라이드를 유지해야 슬라이드가 서로 미끄러시키지 말라 -.이 벌레를 튼다.
- 조심스럽게의 바로 아래로 눌러가볍게 상단 슬라이드를, 각 손의 엄지 손가락과 집게 손가락을 사용하여. 압력의 이상 양, 슬라이드의 가장자리에서 가장 큰 나온 것 중 일부는 성인과 애벌레의 대부분은 각각의 슬라이드에 문의 반면, 파열하지만 그대로 유지됩니다.
- 즉시 조심스럽게 (미끄러지지 않고는) 드라이 아이스에 금속 조각에 슬라이드를 넣어. 슬라이드는 1 분 이내에 냉동 나타납니다. 완전히 고정 될 때까지 5 분 동안 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 이 시점에서, 슬라이드는 며칠 동안 -80 ° C에서 표지 된 박스에 저장 될 수있다. (그들은 -80 ° C에서 주 동안 유지하는 경우, 물이 떨어져 승화하기 시작하고 벌레도 얼룩이되지 않습니다.) 슬라이드는 -80 ° C에 저장되어있는 경우, 그 균열 전에 10 분 동안 드라이 아이스에 '따뜻하게'할 수 있습니다.
- 3 (고정)을 단계로 진행합니다.
2B. 개인 선충의 슬라이드의 준비
- PREC하는 드라이 아이스에 금속의 평면 조각을 놓으십시오언덕.
- 박테리아를 무료로 NGM 접시에 물 한 방울에 개별 선충을 전송하는 웜의 선택을 사용합니다. 선충 (들)은 가능하면, 형광도를 감소 잘 공급해야한다. 필요에 따라 웜 (들) 박테리아의 분리 될 때까지 물을 새로운 장소로 이동을 반복합니다.
- 다음 드라이 아이스, 라벨이 붙어있는 곳을 위로하여 용기에 카운터에 지울 수없는 잉크 및 장소 슬라이드와 "아래"폴리 라이신 슬라이드 프로스트 측 레이블을 지정합니다. 적은 부착 "최고"의 동일한 수의 가능 (치료) 슬라이드가있다.
- 폴리 라이신과 이중 처리 된 하단 슬라이드의 지역에 물 5 ~ 10 ㎕의 드롭 놓습니다. 더 웜을 전송하면 완료되기 전에 증발 물을 방지하기 위해, 더 큰 볼륨을 사용한다.
- 벌레 스티커 슬라이드 표면을 만지지 아래로 침몰로 볼 수있는 현미경을 사용하여 웜의 선택과 물방울에 웜 (들)을 전송합니다. 하락에 따라 많은 + 20 웜에 적은 하나 웜을 전송합니다.
- 하단의를 개최한 손으로 슬라 이드와 프로스트 부분 만 모두가 중복되도록 하단 슬라이드에 상단 슬라이드를 놓습니다.
- 즉시 조심스럽게 (미끄러지거나 압축하지 않고)를 드라이 아이스에 금속 조각에 슬라이드를 넣어. 5 ~ 30 분 동안 드라이 아이스에 보관하십시오. (슬라이드가 쉽게 건조로,이 슬라이드에게 장기간 보관하지 마십시오.)
- 3 (고정)을 단계로 진행합니다.
3. 정착
고정 제는 어느 침전시켜 '수정'셀 장소에서 항원 ( "빛 고정") 또는 가교 ( "하드 고정") 항원에 필요합니다. 고정은 항원 성을 방해 할 수 있습니다, 대부분의 알려진 항체는 특정 고정 상태에서 가장 잘 작동합니다. 새로운 항체를 들면, 고정 상태의 범위는 테스트되어야한다.
임의의 고정 용, 첫 번째 단계는 인산염 완충 식염수를 확인하기위한 것이다. 방법 A (빛을 사용하여 항체 염색에 대한 선충과 다음 수정 슬라이드메탄올, 아세톤) 또는 B (포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드를 사용하여 열심히 수정)를 사용하여 고정합니다.
- 80g의 NaCl, 2.0 g의 KCl, 27.2 g 2 HPO 4 • H 나 추가하여 멸균 배 PBS (인산염 완충 생리 식염수) 주식 솔루션을 준비 2 0, 2.4 g의 KH 2 PO 4, 20 ㎖의 10 % 아 지드 화 나트륨의 주식. 이 스톡 용액을 만들기 위해, 이중 증류수에 10 %의 용액을 나트륨 아 지드 분말을 달아. 용해 될 때까지 부드러운 열이 식염수를 저어. 주의 : 건조 아 지드 화 나트륨은 반응성이 모든 형태의 독성이 있습니다. 건조 아 지드 화 나트륨 또는 솔루션 작업을 할 때 마스크와 장갑을 착용 할 것.
- 1-10 M NaOH로 7.2 식염수 쿨 (트리스 pH가 온도에 민감하다)하자, 다음의 pH. 증류수 및 살균하는 오토 클레이브 1 L에 최고. 실온에서 보관 및 멸균 증류수로 필요에 따라 1 배인 희석. 주의 : 수산화 나트륨 가성입니다 - 사용하는 동안 장갑을 착용하십시오.
3A. 메탄올, 아세톤을 사용하여 빛 수정
- 적어도 10 분 동안 prechill하기 위해 얼음에 염색 항아리에 100 % 메탄올, 100 % 아세톤 및 1X 인산 완충 식염수 (PBS)를 넣습니다. 주의 : 메탄올, 아세톤, 독성이 장갑을 착용하십시오.
- , 드라이 아이스에서 하단과 상단 슬라이드를 한 쌍을 신속하게 따로 따로 트위스트, 바로 2 분 동안 얼음 냉 메탄올의 "바닥"슬라이드를 체험. "최고"슬라이드가 삭제 될 수 있습니다.
- 4 분 동안 차가운 아세톤을 얼음 메탄올에서 슬라이드를 전송합니다. 슬라이드가 많은 벌레를 가지고있는 경우 (90 %) 대부분은 심지어 최고의 준비 슬라이드와 수정에 떨어질 것입니다. 단일 웜 슬라이드가 제대로 준비가되어 있다면, 웜은 준수를 유지해야한다.
- 배치 또는 PBS (정착액을 씻어)와 함께 항아리에 슬라이드를 찍어 4 (염색) 단계로 진행합니다.
(b). 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드를 사용하여 하드 수정
- 0.5-4 % 최종 농도에 1X PBS에서 시약 급 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드 용액을 희석. 분취 량 (1.5 ㎖) 엄마Y 단단히 -20 -30 ° C에서 출장 저장, 그냥 사용하기 전에 얼음에 분주 해동. NOTE : 포름 알데히드 용액이 시간에 공기에 노출되면 분해. 주의 : 포름 알데히드 및 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)는 장갑을 착용하고 후드에서 작동, 독성.
- , 드라이 아이스에서 하단과 상단 슬라이드를 한 쌍을 신속하게 따로 따로 트위스트, 즉시 뚜껑 평평한 접시에 벌레와 "아래"슬라이드를 놓습니다. (상단 슬라이드가 삭제 될 수 있습니다.)
- 즉시 벌레와 슬라이드의 영역의 중앙에 200 ㎕의 독성 정착을 피펫. 정착 제는 부분적 슬라이드 큰 영역을 커버하는 용융 후, 장소에 고정된다.
- 벌레가 완전히 정착으로 덮여 있지 않은 경우, 즉시 조심스럽게 마이크로 피펫을 사용하여 더 많은 정착을 추가합니다. 정착 슬라이드의 가장자리에 흐름을 허용하지 않습니다.
- 뚜껑 접시를 덮고 10 분에 하룻밤 실온에서 방치. 이상 배양 아칸소하면 요리가 가습되어 있는지 확인합니다사용하는 전자 - 이것은 요리에 웨트 보풀이없는 닦음을 추가하여 수행 할 수 있습니다. 와이프가 슬라이드를 접촉하지 마십시오.
- 고정이 완료되면, 조심스럽게 1.5 ML 튜브에 느슨한 벌레와 정착을 피펫과 PBS와 염색 항아리에 슬라이드를 찍어.
- 펠렛 30 초 동안 고속으로 느슨한 온 벌레와 튜브를 스핀. PBS로 두 번 벌레를 씻어 후 슬라이드에 벌레 (오히려 슬라이드보다의 미세 튜브의 단계를 수행)와 병렬로 처리합니다.
- 4 (염색) 단계로 진행합니다.
4. 항체 염색법
항체 염색 프로토콜은 슬라이드에있는 모든 조직에 대한 표준 프로토콜과 유사합니다. 이 프로토콜에 관계없이 1-3 단계의 준비의 모든 슬라이드에 대해 동일합니다.
- 700 ML을 두 번 증류수를 혼합하여 항체 버퍼를 준비, 100 ㎖의 10 배 PBS, 5 ㎖ 트리톤 X-100 (0.5 % 최종), 2 ml의 0.5 M EDTA pH를 8 (1 mM의 최종), 1g의 BSA (0.1 % 최종) 5 ㎖의 10 % 나트륨 AZIDE 용액 (최종 0.05 %). HCl로 pH를 7.2로, 다음 1 L에 증류수를 추가, 4 ℃에서 저장
- 45 ml의 항체 버퍼 (최종 10 %의 혈청)에 5 ㎖의 혈청을 추가 한 다음, 두 번 증류수로 당나귀 혈청을 재구성하여 블록을 준비합니다.
- 항체 버퍼 플러스 1 % BSA에 항체를 희석하여 기본 및 보조 항체 솔루션을 준비합니다. 권장 희석 차 항체 (일차 항체를 발생시키는 데 사용 종에 대한 Cy3or OG488 복합 당나귀 항체)에 대한 기본 항체 1:50-1:2,000 및 1:1,000-1:5,000 있습니다.
- 증류수에 2.5 ㎎ / ㎖를 혼합하여 DAPI 재고를 준비, -30 ℃에서 냉동 8 ㎕의 분취 량에 저장 주의 : DAPI는 독성 DNA 결합 염료 계량 및 분취에 분배하는 동안 장갑을 착용하십시오.
- 200 mg의 n-프로필 갈 레이트를 혼합하여 10 ㎖ 설치 미디어를 준비 0.3 ML 1 M 트리스 산도 9, 15 ML 원뿔 튜브에 2.7 ㎖의 증류수. 약 10 분 동안 65 ° C에서 가열 용해 될 때까지이.잘 7 ML 글리세롤과 DAPI의 8 μL 나누어지는 및 소용돌이를 추가합니다. 나누어지는 매체의 1.5 ML 튜브로, 호일에 포장, 4 ° C에서 어둠 속에서 저장 (공기와 빛을 모두 매체를 저하 - 더 노란색이되면, 방사성 폐기물의 폐기). 주의 : n-프로필 갈 레이트는 무게 동안 장갑을 착용, 반응성 산화 방지제이다.
- 4 ° C (하드 수정을 위해 밤새 바람직)에 실온에서 1 시간 동안이나 밤새 블록과 염색 항아리에 슬라이드를 전송합니다. 손실 벌레를 피하기 위해 흔들림.
- 전송 가습 요리와 최고 100 ~ 500 ㎕의 일차 항체와 각 평면 차 항체 또는 장소 슬라이드와 항아리를 염색하는 슬라이드. 흔들림없이 4 ° C에서 밤새 슬라이드를 품어.
- 일차 항체 배양 한 후, 전송 PBS의 항아리를 염색하는 슬라이드.
- 4 ° C에서 여과지 매장이 줄 지어 깔때기를 통해 블록 필터, 살균 여과 모든 1-2주 경우, 블록은 1 개월 이상 재사용 할 수 있습니다. 이와 유사하게, 필터링 및 저장(염색까지 10 개 이상의 라운드를위한) 재사용을위한 4 ° C에서 차 항체.
- 린스는 항체 버퍼에 세 번 (~ 20 분마다)를 슬라이드.
- 빛 단단한 염색 용기에 차 항체에 슬라이드를 넣고 4 ℃에서 실온에서 하룻밤 동안 4 시간을 품다
- 전송 PBS의 항아리를 염색하는 슬라이드. 필터 (염색까지 10 개 이상의 라운드를위한) 재사용을위한 4 ° C에서 이차 항체를 저장합니다.
- 린스는 항체 버퍼에 세 번 (~ 20 분마다)를 슬라이드.
- 전송 PBS로 슬라이드와 마운트 할 준비가 될 때까지 (분 4 ° C에서 하룻밤) PBS에 둡니다.
- 슬라이드 전면에 벌레가 젖어있을 수 있도록, 각각의 슬라이드에 신속하게 작업 할 수 있습니다. 보풀이없는 닦아으로 다시 슬라이드의 건조, PBS에서 하나의 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 장소.
- 장소 ~ 슬라이드 가볍게 두 용액을 혼합하는 틸트 슬라이드 매체와 PBS 거의 동일한 부분이되도록 웜에 매체를 장착 20 ㎕. CAUTION : 설치 매체는 독성이다.
- 틸트 슬라이드 그래서 프로스트 엣지가 낮고 솔루션 설탕 근처에 수집 한 다음 솔루션에 24 X 60mm의 coverslip에의 한 모서리를 놓습니다.
- 부드럽게 (표백을 높이고 시청을 방해) 공기 방울을 최소화하기 위해 커버 슬립을 낮 춥니 다. 거품이 형성되면, 벌레에 걸쳐 coverslip에 슬라이딩하지 않고 relower, 천천히 커버 슬립의 가장자리를 들어 올립니다.
- 조심스럽게 보풀이없는 닦아으로 가장자리를 압축하여, 커버 슬립을 이동하지 않고 슬라이드의 가장자리를 건조. 슬라이드의 상대적으로 건조한 날은 모두 커버 슬립의 가장자리 주위를 볼 수 있어야합니다
- 매니큐어의 2 ~ 3 층으로 커버 슬립을 봉인. 슬라이드 준비와 빛으로부터 보호하기 위해 보관시 평평한 슬라이드 홀더에 배치 할 수 있습니다. 슬라이드가 잘 밀봉하여 건조되면, 슬라이드 커버 슬립 다시 청소.
- 잘 밀봉 된 슬라이드는 -20 ° C에서 11 ° C 또는 주에 일 어둠 속에서 유지 될 수있다 더 이상 기간, DAPI 역DNA와 대부분의 녹색 염료 (예를 들어 488 nm의 여기) 페이드 ining. 기름 침지 렌즈를 사용 후 필요에 따라 더 매니큐어, 예와 커버 슬립을 봉인.
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Representative Results
웜이 제대로 압축 금, 가볍게 고정하는 경우, 사실상 전체 웜 (그림 2 참조) 항체 염색법에 액세스 할 수 있습니다. DAPI 염색에 의해 표시된 바와 같이 핵의 위치는 웜의 일부 웜은 포름 알데히드 등 어렵게 정착액을 거치게 될 때의 부자연 물결 모양으로 된 것과 같이, 웜의 형태학 (그러질 그대로 나타냅니다 도 3A-D에있는 근육). 또 다른 일반적인 문제는 고르지 고정 또는 특정 조직의 침투이다. 이것의 예는 근육이 DNA 염색을 포함한 다른 염색의 존재는, (본체의 적어도 일부가 존재하는 것을 의미한다는 사실에도 불구하고, 오직 웜의 일부에 더러워도 3E-H에 도시된다 즉,) 동결 균열 중에 제거되지. 부분 얼룩의 발생 패턴은 쉽게 연습을 식별 할 수 있도록 전체 분배 블록염색에 단일 웜이 고르지 못한 염색을 표시도 확인할 수 있습니다.
동결 균열 어떤 고정 상태를 이용하여 발생하는 일반적인 문제는 마지막 그림 (그림 4)에 나와 있습니다. 가장 일반적인 문제는 압축하는 동안 두 개의 슬라이드의 상대 운동에 샘플의 왜곡된다. 웜의 본체가 단지 인두 후방 꼬여 있다는 사실은 더러워 조직의 형태로 볼 수있다. 이 이미지는 또한으로 인해 항체가 슬라이드를 코팅 폴리 라이신 고집에, 배경 염색의 문제를 보여줍니다. 이 모든 이미지는 세포 생물학 실험실 과정에있는 대학생의 첫 번째 항체 염색을 시도 중에 슬라이드를 사용하여 수집 된 것을 유의하십시오. 심지어 연습, 많은 개인 벌레는 그림 4에서 볼 수있는 문제를 보여줍니다. 그러나, 하나의 슬라이드에 그림 2와 3에서 본 것과 같은 벌레는 foun이 될 수 있습니다D 및 검사.
그림 1. 절차의 개요. 완전한 동결 균열 절차를 수행하는 단계를 나타내는 흐름도. 다양한 고정 조건 및 웜의 숫자에 대한 대안이 표시됩니다.
그림 2. 가볍게 고정, 잘 스테인드 웜 메탄올, 아세톤으로 고정 된 여러 항체 및 염료로 표지 두 성인 자웅 동체의 머리 :. A) 차 항체) (콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 채팅을하고 Cy3에 - 복합 이차 항체, B) DAPI (파란색 DNA) , C) 광석그린 488 - 안티 GFP (녹색 형광 단백질) 곤, D)는 (두 콜린성 마커, Cy3가 안티 - 채팅 및 Cy5에 안티 - VAChT (기공을 갖는 아세틸 콜린 수송) 오버레이 빨간색으로 표시)을 보여줍니다. 이 유전자 변형 (PS4657)는 인두 혀끝의 분기점에서 찾을 GFP 및 AJM-1 사이의 번역 융합을 표현한다. 이미지는 공 초점 이미지의 시리즈의 최대 예상되며 스케일 바는 50 ㎛이다.
그림 3. 신체를 Cy3-phalloidin도 염색 포름 알데히드 관련 왜곡. 포름 알데히드 고정 성인 (사상 굴지 바인딩), DAPI (파란색 DNA), 오레곤 그린 488 - 안티 GFP. AD) 포즈 이미지는 단지) 맨 왼쪽 (외음부의 후부 왜곡으로 인해 자연스럽게 물결 모양의 형태를 보여 같은 선충에서고정으로 duced.는) 레드 - phalloidin도 약간 불규칙한 근육의 형태를 보여줍니다. B) 핵 (파란색)이 균일하게 웜에 걸쳐 확산된다. C) 녹색의 세포막에있는 CED-1 :: GFP 융합 단백질의 분포를 보여줍니다 LIM-7 프로 (변형 MD701). D)에 의해 구동 생식선 칼집 전지는. EH) 레이블이 같은 선충에 다른 염료와 다를 수 있습니다 세 가지 염료의 오버레이를 표시합니다. E) Phalloidin의 (빨간색)의 일부만 레이블 고르지 못한 강도로 염색 있지만 웜의 한쪽 근육. F) 핵 (파란색)) (웜에 걸쳐 존재한다. G) OG488-안티 GFP는 쪽의 표피에있는 콜라겐-19 :: GFP 레이블 그 근육을 나타내는 이상의 중앙 근육 조직의 염색이 부족 웜이 존재하지만 하나의 표면에 얼룩 없습니다. H)의 세 가지 염료의 오버레이를 보여줍니다. 이미지는 최대입니다공 촛점 이미지의 시리즈의 근위의 전망은, 스케일 바는 50 μm의 수 있습니다.
그림 4. 염색 압축 관련 왜곡. 포름 알데히드 고정 유충)를 Cy3-phalloidin도 (사상 굴지 바인딩), B) DAPI (파란색 DNA), C) 오레곤 그린 488 - 안티 GFP, D) 오버레이. 다만 인두 후방 신체의 트위스트 신체의 나머지 위에 배설 그린 셀 및 복부 신경 코드 크로스 같이 명백하다. 고 배경 염색도를 Cy3-phallodin와 명백하다. 이 균주는 배설 셀에 주로 위치하고 VHA-13 :: GFP 융합 단백질을 표현한다. 스케일 바는 50 ㎛이며, 이미지는 (높은 배경 염색을 선도) 슬라이드의 표면에 확장 공 촛점 이미지의 시리즈의 최대 전망이다.
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Discussion
동결 균열 프로토콜 C. 항체 염색을위한 여러 가지 방법 중 하나입니다 엘레. 그것은 벌레를 염색 할 수있는 비교적 간단한 방법을 제공하지만, 특정 시약을 필요로하고 최적의 결과를 위해 연습 않습니다. (그림 1에 나와있는) 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 슬라이드 준비 () 3 단계 참조 (2 단계와 3 단계) 빠른 고정을 참조하십시오 (1 단계와 선충의 2) 수동 압축을 참조하십시오. 첫째, 슬라이드에 선충의 밀착성을 최대화하기 위해, 대신 상업적으로 제조 된 슬라이드에 의존하는 고 분자량 (긴 중합체) 폴리 리신으로 슬라이드를 준비하는 것이 최상이다. 동결 균열 슬라이드는 전체 선충의 표피에 충실하도록 설계하는 동안 상용 슬라이드는 세포가 준수 할 수 있도록 폴리 라이신으로 코팅되어 있습니다. 둘째, 냉동 전에 슬라이드 사이에 벌레의 정확한 압축하는 절차는 매우 중요하다. 그것은 정확한 양을 사용하여 함께 슬라이드를 눌러 꾸준한 손과 연습이 필요개인 벌레가 자신의 형태를 파괴하지 않고 모두 슬라이드를 문의하도록 압력. 너무 많이 또는 너무 작은 압축 하나는 고정시 웜의 증가 손실로 연결됩니다. 또한주의가 서로 상대적으로 슬라이드 이동없이 냉동 드라이 아이스 냉각 된 표면에 슬라이드 이동이 필요하다. 그러한 운동은 벌레가 찢어 또는 비틀의 원인이됩니다. 셋째, 어떤 고정 기법으로, 고정 된 벌레는 해동되기 전에 정착에 직접 배치해야합니다. 그렇지 않으면, 항원은 세포 내 지역화 대한 잘못된 정보를 제공하고, 확산있다. 이 중요한 단계가 모두 제대로 수행하는 경우, 최상의 결과를 위해 최선의 형태를 가진 벌레를 찾기 위해 여러 스테인드 슬라이드를 스캔하는 것이 여전히 필요하다.
이 기술의 하나의 피할 수없는 측면은 벌레가 하나의 차원으로 압축 될 것입니다. 압축은 z 축에 둥근 몸체의 겉보기 지름은 1-4 일 수있다 인원수에 가장 두드러x-및 y-축에서 본 것과 번째. 이러한 압축은 더 작은 유충 감소하는 경향이 있고, 배아에서 무시할 수있다. 때문에 생활 선충 슬라이드 준비하는 동안 이동하는 방식으로, 스테인드 웜은 종종 그들의 양쪽에 있습니다. 이것은 횡 정중선이 (도 2-4 참조) 더러워 웜의 중간 아래 연장 누워, 한천 접시에 웜의 배향을 모방. 따라서, 압축 측 방향 치수에 일반적이다. 이것은 실제로 표준 형광 현미경은 쉽게 동안 (시편의 이상이 동시에 초점이 될 것입니다), 그것은 3 차원 복원이 정확하지 않을 것을 의미합니다.
어떤 항체 염색과 마찬가지로 결합 특이성을 확인하는 것이 중요하다. 대부분의 종에서, 이것은 이러한 선호도가 항체를 파괴 또는 프라이 머리를 사용하지 않는 등의 컨트롤에 의해 이루어집니다. C.에서 엘레, 특이 검사의 구체적인 방법은 자주 사용할 수 있습니다. 관심의 유전자와 단백질에 대한 널 돌연변이 제공염색의 특이성에 대한 우수한 제어. 염색은 일반적으로 고정 의존하기 때문에 두 균주를 비교하기 전에 동일한 조건에서 고정되어야한다. 제공된 NULL 돌연변이가 없다면, 그때는 C. 비교적 쉽다 의 RNAi (RNA 억제 12)와 단백질 수준을 감소하고 RNAi의 치료 웜의 감소 염색을 찾기 위해 엘레.
클론 항체들은 항원 친 화성 정제해도, 비특이적 염색을 보여준다. 종종, 메탄올, 아세톤을 (를 침전보다는 그들을 가교 단백질을 고정하는)를 사용하여 빛을 고정 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드 (다양한 가교로 인해 더 많은 변형 항원을 생성하는) 1,11보다 낮은 비 특정 얼룩을 제공합니다. 그러나, C.에서 엘레 비 특정 염색 특히 창자에서, 어떤 고정 상태에서 매우 일반적입니다. 당신의 항원이 장내에 표현하면, 다음이 아닌 특정 얼룩은 특정 staini 마스크 수 있습니다NG. 널 (null) 돌연변이가 단백질을 사용할 수있는 경우,이 방법으로 고정 웜은 혈청을 고갈 선호도를 사용할 수 있습니다. 항원이 고정 조건에 의존하기 때문에, 당신은 당신의 항체를 소모하는 데 사용하는 웜은 염색하는 야생 형 웜과 같은 방법으로 준비를해야합니다. 비 특정 염색, 돌연변이와 야생 형 웜의 고갈의 한 라운드 후 우수한 컨트롤에 대한 고갈 혈청과 병렬로 염색 할 수 있습니다. 필요에 따라 돌연변이와 고갈의 추가 라운드를 할 수 있습니다.
이 기술은 다양한 조건 하에서 특정 염색에 대한 새로운 항체를 테스트하기 위해 매우 유용하다. 이들은 C.에 대해 생성 된 항체가있을 수 있습니다 엘레 다른 종의 보존 단백질에 대해 생성 된 단백질 또는 항체. 어떤 경우에는이 방법이 가볍게 고정 선충과 함께 최고의 형태를 제공하지만, 어떤 조건을 결정하는 고정 제의 범위를 시도하는 비교적 간단하다, 특정한 결과를 줄의. 포름 알데히드 또는 글루 타르 알데히드, 효소 또는 치료를 줄일 수를 사용하여 하드 고정을위한 다른 방법과는 달리 샘플 준비를 위해 필요하지 않습니다. 이러한 치료는 항원 성을 감소시킬 수 있기 때문에, 이것은 특정 항체와 그들의 최적 정착 조건을 식별하는 능력을 증가시킨다. 하드 고정 조건이 가장 적합한 경우, 실험은 (우리의 이전 작업 4에 요약) 더 나은 형태를 얻기 위해 그대로 웜에 수행 방법을 설정할 수 있습니다. 광 고정 항원 성을 유지하는 경우,이 기술은 광학 현미경을위한 모든 더 염색에 사용될 수있다.
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Disclosures
저자는 그녀가 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
자금은 NSF CCLI 번호 0,633,618 및 오하이오 대학에 의해 제공되었다. 일부 변종은 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다. 대학원생 Reetobrata 바수는 비디오에 나타납니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
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