Antikörperfärbung in Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

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Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-Cracking", ein Verfahren zur Freilegung der inneren Gewebe des Nematoden C. elegans, um Antikörper für die Proteinlokalisierung, wird demonstriert.

Abstract

Um C. Fleck elegans mit Antikörpern müssen die relativ undurchlässig Kutikula durch chemische oder mechanische Verfahren umgangen werden. "Freeze-Cracking" ist eine Methode verwendet, um körperlich ziehen Sie die Nagelhaut von Nematoden durch Komprimieren Nematoden zwischen zwei haftenden Folien, Einfrieren, und ziehen Sie die Folien auseinander. Gefrier Cracken liefert eine einfache und schnelle Möglichkeit, den Zugang zu den Geweben ohne chemische Behandlung erhalten und kann mit einer Vielzahl von Fixiermitteln verwendet werden. Sie führt aber zum Verlust von vielen der Proben und die erforderliche Kompression der Probe mechanisch verformt. Praxis ist erforderlich, um Rückgewinnung der Proben mit guter Morphologie zu maximieren. Gefrier Cracken kann für bestimmte Fixierbedingungen, Rückgewinnung der Proben oder niedrige nicht-spezifische Färbung optimiert werden, aber nicht für alle Parameter auf einmal. Für Antikörper, die sehr schwer Fixierung Bedingungen erfordern und tolerieren die chemischen Behandlungen erforderlich, um chemisch permeabilisieren die Nagelhaut, treatment intakter Nematoden in Lösung bevorzugt werden. Wenn der Antikörper erfordert eine leichtere Lösung oder, wenn die optimale Fixierung Bedingungen bekannt sind, bietet gefrier Cracken eine sehr nützliche Methode, um schnell zu testen, die den Antikörper und spezifische subzelluläre und zelluläre Lokalisation Information für das Antigen von Interesse zu ergeben.

Introduction

Um die zellulären und subzellulären Lokalisation von Proteinen zu bestimmen, haben Wissenschaftler traditionell mit Antikörpern ausgewählt, um bestimmte Proteine ​​spezifisch erkennen, ^ein markierter Gewebe. In einigen Modellorganismen wie C. elegans, Antikörperfärbung wurde oft durch molekulargenetische Techniken, die Ergebnisse schneller erzielen ersetzt. Diese umfassen die Umwandlung Organismen mit Konstrukten aus Genfusionen zwischen dem Promotor und der codierenden Regionen des Gens von Interesse und das grün fluoreszierende Protein. Jedoch unterliegen einer Anzahl von Artefakten, einschließlich der Probleme mit Kenntnis der wahren Promotor und Veränderungen in der Expression von Konstrukten mit hoher Kopienzahl (die üblichen Techniken in C. elegans) ^2,3 molekularen Techniken. Daher Färbung mit Antikörpern bleibt ein Ziel für viele Wissenschaftler, die Proteinfunktion in vivo.

Anfärben mit Antikörpern Gewebe kann schwierig sein, da eineAntikörpern kann nur ihre Antigen in einer bestimmten Konformation ¹ zu erkennen. Zum Beispiel können Antikörper nur denaturiert oder intakten Antigen fixiert in einer bestimmten Weise zu erkennen und nicht das Antigen in situ zu erkennen. Das Problem der Antikörperfärbung in Nematoden wird durch die Tatsache, dass die Kutikula der Nematoden bildet eine relativ undurchlässige Barriere, die Blockierung des Zugangs von Antikörpern gegen Gewebe verstärkt.

Es gibt mehrere verschiedene Methoden für die Antikörper-Färbung verwendet in C. ⁽⁴ in unserer bisherigen Arbeit überprüft) elegans. Um intakte Fleck "Würmer", wurden Methoden entwickelt, zu frieren und tauen in einem relativ harten Fixiermittel (Formaldehyd oder Glutaraldehyd), die Frost-Tau-Zyklen helfen, die Nagelhaut zu knacken, um eine schnelle Durchdringung der Fixiermittel ⁵ zu ermöglichen. Nach der Fixierung wurde die Kutikula permeabilisiert, um das Eindringen der Antikörper zu ermöglichen; Methoden enthalten eine Behandlung mit Reduktionsmitteln, Collagenase oder beides ^5-7. Diese Treatments Morphologie erhalten, aber oft reduziert oder zerstört Antikörpererkennung. Alternative Methoden sind Dissektion ⁸ bis Antikörper Eindringen zu ermöglichen.

"Freeze-Cracking" ist eine Möglichkeit, den Zugang zum Inneren des Halb intakt Wurm gewinnen, damit Antikörperfärbung ^9-10. Gefrier Cracken kann mit einer Vielzahl von Befestigungs Bedingungen durchgeführt werden, während die Vermeidung Kollagenase-und Reduktionsbehandlungen. Die Nematoden sind zwischen zwei Folien gelegt Klebstoffe, gefroren, und dann werden die Folien voneinander getrennt sind, so dass die meisten der Nematode auf der Bodenschieber und viel von der Kutikula auf der oberen Folie. Die untere Folie kann in Fixiermittel gelegt und die gesamte Folie mit haft Nematoden durch den Antikörper Färbeverfahren übertragen. Die Methode hat derzeit zwei große Schwierigkeiten. Erstens ist es schwierig, die richtige Menge von Druck notwendig, um die Nematoden, ohne ernsthaft zu verformen aufgeteilt anzuwenden. Zweitens sind viele der Würmer wird nicht sTick ​​zu jeder Folie, und werden in der Fixiermittel oder Spülungen verloren. Doch mit den richtigen Folien und Praxis wird das Verfahren rasch ergeben Nematoden mit vernünftigen Morphologie, die mit einer Vielzahl von Fixiermittel und Antikörpern verwendet werden kann.

Das Verfahren kann leicht in Abhängigkeit von dem Ziel der Experimentator variiert werden. Wenn Färbung der einzelnen Nematoden erwünscht ist (z. B. um zu bestimmen, ob eine einzelne Transformante wurde Antikörperfärbung verändert), gleitet dann mit maximaler Haftung (aber höhere Hintergrundfärbung) verwendet werden können, wie Labor hergestellte Folien mit zusätzlichen Polylysin (siehe unten). Für Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Fixierung, sollte höher Adhäsions-Objektträger (Labor vorbereitet Polylysin Dias) verwendet werden, da Nematoden mehr haften schlecht auf Polylysin nach diesen Fixierungen. Wenn Wildtyp-Nematoden werden mit Methanol und / oder Aceton fixiert, gleitet dann mit geringerer Haftung und geringer Hintergrundfärbung verwendet werden sollte (kommerziell oder labor vorbereiteten Folien). Wenn eine Vielzahl von Antikörpern und Fixiermittel werden im Labor verwendet werden, kann eine Auswahl von Folien voraus hergestellt und gelagert, bis sie benötigt werden.

Nach dem Zugriff auf die Nematoden-Gewebe wurde gewonnen, Antikörperfärbung Verfahren folgen Standardverfahren (mit längeren Inkubationszeiten Merkmal von Geweben statt Zellen ^1,11).

Protocol

HINWEIS: Mehrere Protokollschritte sind mit Optionen für die Einrichtung und Vorbereitung abhängig von den spezifischen Bedingungen des Experiments vorgestellt. Für diese Fälle sind alternative Schritte A, B, C usw. dargestellt Das Protokoll mit alternativen Schritte ist in Fig. 1 skizziert.

1. Vorbereitung von Polylysin beschichtete Objektträger

Drei verschiedene Arten von Folien verwendet werden können, abhängig von dem gewünschten Kompromiß zwischen der Leichtigkeit der Herstellung, relativ Haftung und nicht-spezifische Bindung des Antikörpers. Details der Objektträgerpräparations Alternativen sind unten in den Schritten 1A-1C in der Reihenfolge zunehmender Komplexität und Adhäsion gegeben. Folien mit diesen verschiedenen Verfahren hergestellt werden, können für ein einzelnes Experiment zusammen verwendet werden.

1A. Keine Rutsche Vorbereitung

Im Handel erhältliche Polylysin beschichtete Objektträger bieten geringe Haftung und niedrigen Hintergrund.

1B. Slide preparation Optimum für Methanol-Aceton-Fixierung

Medium Haftung und geringe Hintergrund.

1. Bereiten Sie einen Polylysin-Lösung für das Eintauchen der Objektträger: In 400 mg mit sehr hohem Molekulargewicht (150.000 - 300.000 D) Poly-L-Lysin zu 200 ml doppelt destilliertem Wasser. 2 ml 10% Natriumazid Lager (Endkonzentration 0,1%) als Konservierungsmittel. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Maske tragen und Handschuhe beim Wiegen Pulver zu 10% Lager in doppelt destilliertem Wasser zu machen.
2. Wischen einzelne Ende Milchglasobjektträger mit fusselfreien Tüchern, Entfernen Flecken und Partikel. Dies sollte auch auf Objektträger mit der Bezeichnung gekauft getan werden "vorgereinigt."
3. Die Objektträger Rücken an Rücken in einer Objektträgerhalter, Glasküvette oder andere Dia-Färbung Behälter, halten mattierte Kanten und nicht ganz perfekt ausgerichtet (um spätere Trennung einfacher). Zeigen Scheibe Halter im Becherglas mit 70% Ethanol (Alkohol Reagenzqualität nicht erforderlich) mit 1% HCl in diWasser gestillt oder füllen Küvette zu Ebene der Zuckerguss. Steinschlag in der Lösung für mindestens 5 min. ACHTUNG: Diese Lösung ist ätzend, Handschuhe tragen. HINWEIS: Diese Lösung kann mehrfach wiederverwendet werden können (bis zu mehreren Monaten).
4. Spülen Sie Folien in destilliertem Wasser läuft für 1 min.
5. Trockenrutschen komplett in einer staubfreien Umgebung entweder, indem in einem Ofen 40-60 ° C für 30-60 Minuten oder über Nacht bei Raumtemperatur zu halten.
6. Die Objektträger in Polylysin-Lösung (für unfrosted Teile) auf Wippe für 15 min.
7. Wiederholen Trocknung von Folien.
8. Wiederholen Polylysin-Lösung Inkubation und Trocknungsschritte.
9. Trennen Sie die Folien mit einem schlanken Metallgegenstand mit einem Gewicht von einer dünnen Spachtel. Wenn sie korrekt eingehalten werden, sind sie schwierig zu trennen. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (Schutzbrille) und die Arbeit an Tischpapier (nach Gebrauch weggeworfen werden), da kleine Glassplitter fliegen können lose, wenn Folien voneinander getrennt sind.
10. Shop Dias in Rein(Staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt.

1C. Schieben Vorbereitung optimal für Formaldehyd-Fixierung

Höchste Haftung, aber hohe Hintergrund.

1. Objektträger mit der Methode 1B Wohnung in einer staubfreien, ofenfeste Form (für das Trocknen im Ofen) oder auf einer flachen Oberfläche staubfrei vorbereitet (für die Lufttrocknung).
2. Platzieren einer 20-60 &mgr; l Tropfen der Polylysin-Lösung auf die Mitte der einzelnen Folien.
3. Trocken Folien vollständig im Ofen oder bei Raumtemperatur. Die Polylysin hinter blass Ovale lassen, wie es verdunstet. Diese Ovale sind sehr Kleber. Leider sind sie auch für die primären und sekundären Antikörper zu binden, auch nach der Blockierung.
4. Shop Folien sauber (staubfrei) Dia-Box bei 4 ° C bis benötigt.

2. Herstellung von Frozen Nematode Slides

Bereiten Nematoden für die Färbung durch Spülen vollständig frei von Bakterien mit der Methode 2A (für Platten von Nematoden) oder2B (für einzelne Nematoden).

2A. Herstellung von Folien aus Platten von Nematoden

1. Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis Vorkühlung.
2. Verwenden Sie destilliertes Wasser und einer Glaspipette (verringert Verlust von Würmern) oder Mikropipette, um Würmer aus NGM-Platte mit Bakterien in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen spülen. Die Platten können synchronisiert werden oder gemischt Alters; verwenden Sie keine Platten mit vielen dauers (schwer zu knacken) oder verhungert Würmer (erhöhte Autofluoreszenz), sofern erforderlich.
3. Mit destilliertem Wasser spülen die Würmer 3-4x, bis sie frei von Bakterien. (Um den Verlust von Würmern verringern die gleiche Glaspipette.) Zum Pellet Würmer, entweder wir sie auf der Bank sitzen für 3-5 min (zu meist Erwachsene auf dem Boden des Röhrchens zu sammeln) oder Spin 30 Sekunden bei ~ 1000 rpm (~ 500 g) in einer Tischzentrifuge (für Erwachsene, Larve, sammeln und Embryonen).
4. Entfernen Sie die meisten von Wasser aus Rohr mit Würmern, so dass etwa die doppelte Menge Wasser wie Würmer (mindestens jedoch 25 ul Gesamtvolumen).
5. Eine gleiche Anzahl von regelmäßigen (sauber gewischt, aber nicht behandelt Polylysin) "oben" Folien zur Verfügung.
6. Platz ~ 25 ul Würmer im Wasser auf dem "Boden" haftRutsche und die Ausbreitung der Flüssigkeit, die die Würmer über den mittleren Abschnitt des Schlittens mit der Seite der Pipettenspitze.
7. Lassen Sie die Würmer für 30 Sekunden bis 2 Minuten zu begleichen. Wenn der Schieber entsprechend klebrig, werden die Enden der Schnecken halten, wie sie den Schieber kontaktieren.
8. Halten Sie den Boden gleiten in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen. Die Flüssigkeit sollte die Folien leicht auseinander halten, so dass die Würmer noch leicht bewegen lassen Sie sich nicht die Folien gleiten übereinander -. Diese verdreht die Würmer.
9. Drücken Sie vorsichtig gerade nach unten sleicht auf den Oberschlitten, mit dem Daumen und Zeigefinger jeder Hand. Mit der idealen Menge an Druck, wird ein paar der größten Hermaphroditen am Rande der Folien reißen, während die meisten Erwachsenen und Larven wird jede Folie zu kontaktieren, aber intakt bleiben.
10. Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Die Folien sollten innerhalb einer Minute eingefroren erscheinen. Halten Sie auf Trockeneis für 5 Minuten, bis sie gründlich eingefroren.
11. An diesem Punkt können die Objektträger in ein Eingabefenster bei -80 ° C für mehrere Tage gelagert werden. (Wenn sie bei -80 ° C gehalten Wochen sind, wird das Wasser anfangen zu sublimieren entfernt und die Würmer nicht so gut färben). Wenn Folien werden bei -80 ° C gelagert, lassen Sie sie "warm up" auf Trockeneis für 10 min vor Rissbildung.
12. Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt.

2B. Herstellung von Folien aus einzelnen Nematoden

1. Stellen Sie ein flaches Stück Metall auf Trockeneis precHügel.
2. Verwenden Sie einen Wurm holen, um einzelne Nematoden zu einem Wassertropfen auf einem NGM Platte übertragen, um sie von Bakterien zu befreien. Nematode (n) sollte gut zugeführt, um die Autofluoreszenz zu verringern, wenn möglich. Wiederholen Übertragung auf neue Spots von Wasser wie nötig, bis Wurm (n) frei von Bakterien.
3. Beschriften mattierte Seite der "Boden" Polylysin-Objektträger mit wasserfester Tinte und Objektträger auf Zähler nächsten Behälter mit Trockeneis Etikett nach oben. Eine gleiche Anzahl von weniger haft "oben" (unbehandelt) Folien zur Verfügung.
4. Platzieren 5-10 &mgr; l-Tropfen Wasser auf den Bereich der Bodenträger mit Polylysin doppelt behandelt. Verwenden Sie die größere Lautstärke, wenn die Übertragung mehr Würmer, um das Wasser zu verdunsten vor Fertigstellung zu verhindern.
5. Übertragen Sie die Schnecke (s) an die Wassertropfen mit dem Wurm-Pick, mit dem Mikroskop zu beobachten, wie die Würmer sinken, um die klebrige Gleitfläche berühren. Übertragen so wenig wie ein Wurm, so viele wie 20 + Würmer pro Tropfen.
6. Halten Sie den Boden slide in einer Hand und legen Sie den Oberschlitten über den Boden gleiten, so dass alle, aber die Vereiste Bereiche überlappen.
7. Sofort und vorsichtig (ohne zu rutschen oder Kompression) setzen die Folien auf dem Stück Metall auf Trockeneis. Halten Sie auf Trockeneis für 5-30 min. (Diese Folien lagern langfristig, da die Folien leicht austrocknen.)
8. Gehen bis 3 (Fixierung) Schritt.

3. Fixierung

Fixierungsmittel sind notwendig, um "fix" das Antigen an Ort und Stelle in der Zelle, entweder durch Ausfällen ("light-Fixierung") oder Vernetzung ("harte Fixierung") das Antigen. Die Fixierung kann Antigenität stören, die meisten bekannten Antikörper funktionieren am besten mit einer bestimmten Fixierung Zustand. Für neue Antikörper, sollte ein Bereich der Fixierung Bedingungen getestet werden.

Für jede Fixierung, ist der erste Schritt, um Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung herzustellen. Weiter fix Folien mit Nematoden zur Antikörperfärbung nach Methode A (Lichtfix mit Methanol und Aceton) oder B (härter fix mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd).

1. Bereiten Sie eine sterile 10x PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) Stammlösung durch Zugabe von 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g KH ₂ PO _4, 20 ml 10% Natriumazid Lager. Um diese Stammlösung zu machen, wiegen Natriumazid Pulver zu 10% ige Lösung in doppelt destilliertem Wasser zu machen. Rühren Sie mit Kochsalzlösung sanfte Wärme bis gelöst. ACHTUNG: trocken Natriumazid ist reaktiv und alle Formen sind giftig. Tragen Maske und Handschuhe bei der Arbeit mit trockenen Natriumazid oder Lösungen.
2. Lassen Salz cool (Tris pH temperaturempfindlich ist), dann pH-Wert auf 7,2 mit 1-10 M NaOH. Top auf 1 L mit doppelt destilliertem Wasser und Autoklaven zu sterilisieren. Lagerung bei Raumtemperatur und verdünnt auf 1x als mit sterilem doppelt destilliertem Wasser benötigt. ACHTUNG: NaOH ist ätzend - Handschuhe während der Anwendung zu tragen.

3A. Licht fix mit Methanol-Aceton-

1. Setz 100% Methanol, 100% Aceton und 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Küvetten auf Eis für mindestens 10 min Vorkühlung. ACHTUNG: Methanol und Aceton sind giftig, Handschuhe.
2. Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort tauchen die "unten" slide in eiskaltem Methanol für 2 min. Die "Top"-Rutsche können verworfen werden.
3. Objektträger aus Methanol kaltem Aceton für 4 min Eis. Wenn die Folien hatte viele Würmer, die meisten (90%) wird in dem Update fallen, auch mit den am besten vorbereiteten Folien. Wenn einzigen Wurm Träger wurden richtig vorbereitet, sollten die Würmer eingehalten bleiben.
4. Zeigen oder tauchen Sie die Folien in das Glas mit PBS (abzuspülen Fixiermittel) und fahren bis 4 (Färbung) Schritt.

3B. Fest fix unter Verwendung von Formaldehyd oder Glutaraldehyd

1. Verdünnen Reagenzqualität Formaldehyd oder Glutaraldehyd-Lösung in 1x PBS auf 0,5-4% Endkonzentration. Aliquots (1,5 ml) may gespeichert dicht bei -20 bis -30 ° C begrenzt werden; auftauen Aliquots auf Eis kurz vor der Verwendung. HINWEIS: Formaldehyd-Lösungen mit der Zeit abgebaut und an der Luft. ACHTUNG: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind giftig, Handschuhe und arbeiten in der Kapuze.
2. Nehmen Sie ein Paar von unteren und oberen Dias aus dem Trockeneis, schnell verdrehen sie auseinander, und sofort legen Sie die "unten" slide mit Würmern in der flachen Schale mit Deckel. (Der Oberschlitten kann verworfen werden).
3. Unmittelbar pipettieren 200 ul giftig Fixiermittel über der Mitte der Fläche des Objektträgers mit Würmern. Das Fixiermittel wird teilweise an Ort und Stelle einzufrieren, dann schmelzen, um einen größeren Bereich der Folie abzudecken.
4. Wenn die Würmer nicht völlig mit Fixiermittel bedeckt, sofort und vorsichtig mehr Fixiermittel mit einer Mikropipette. Nicht Fixiermittel über den Rand der Folie fließen.
5. Decken Sie die Schüssel mit einem Deckel und lassen für 10 min bis über Nacht bei Raumtemperatur. Seien Sie sicher, dass das Gericht wird befeuchtet, wenn längere Inkubationen are verwendet - dies kann durch Zugabe von gefalteten feuchten, fusselfreien Tüchern in die Schale durchgeführt werden. Lassen Sie sich nicht die Tücher berühren Sie die Folien.
6. Nach der vollständigen Fixierung vorsichtig pipettieren Fixiermittel mit losen Würmer in ein 1,5-ml-Röhrchen und tauchen Sie die Folie in eine Küvette mit PBS.
7. Drehen Sie das Rohr mit Würmern, die locker für 30 Sekunden kam mit hoher Geschwindigkeit zu pelletieren. Zweimal mit PBS spülen Würmer, verarbeitet dann parallel zu den Schnecken auf den Folien (tut Schritte Mikrozentrifugenröhrchen statt auf Folien).
8. Gehen bis 4 (Färbung) Schritt.

4. Antikörperfärbung

Die Antikörperfärbung Protokoll ist ähnlich wie Standard-Protokolle für jedes Gewebe auf Folien. Dieses Protokoll ist für alle Folien, unabhängig von der Herstellung in den Schritten 1-3.

1. Antikörper herzustellen Puffer durch Mischen 700 ml doppelt destilliertem Wasser, 100 ml 10-fach PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% Endkonzentration), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM final), 1 g BSA (0,1% Endkonzentration), 5 ml 10% iger azide-Lösung (0,05% endg.). pH-Wert auf 7,2 mit HCl, fügen Sie dann doppelt destilliertem Wasser auf 1 L; lagern bei 4 ° C
2. Bereiten Blockieren durch Rekonstitution Esel-Serum mit doppelt destilliertem Wasser, dann Zugabe von 5 ml Serum 45 ml Antikörperpuffer (final 10% Serum).
3. Bereiten Sie Primär-und Sekundärantikörperlösungen durch Verdünnen Antikörper in Antikörperpuffer plus 1% BSA. Empfohlene Verdünnungen 1:50-1:2,000 für Primärantikörper und 1:1,000-1:5,000 für Sekundärantikörper (Cy3or OG488 konjugierte Antikörper gegen Esel verwendet, um primäre Antikörper erhöhen Arten).
4. Bereiten DAPI Lager durch Mischen von 2,5 mg / ml in doppelt destilliertem Wasser; Store in 8 ul Aliquots bei -30 ° C eingefroren ACHTUNG: DAPI ist ein giftiges DNA-bindenden Farbstoff, Handschuhe, während Einwaage aliquotiert.
5. Vorbereitung 10 ml Mounting Medium durch Mischen von 200 mg n-Propylgallat, 0,3 ml 1 M Tris, pH 9, 2,7 ml doppelt destilliertem Wasser in einem 15 ml konischen Röhrchen. Hitze bei 65 ° C für etwa 10 min bis gelöst.In 7 ml Glycerin und eine 8 ul Aliquot von DAPI und Wirbel auch. Aliquot Medium in 1,5-ml-Röhrchen, in Folie wickeln und nur im Dunkeln bei 4 ° C (sowohl Luft und Licht verschlechtern die Mittel - wenn es mehr gelb, verwerfen in Biohazard Abfall). ACHTUNG: n-Propylgallat ist eine reaktive Anti-Oxidationsmittel, Handschuhe beim Wiegen.
6. Übertragen Objektträger in eine Küvette mit Sperren für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C (bevorzugt über Nacht hart fix). Vermeiden Sie Schütteln, um zu verlieren, Würmer zu vermeiden.
7. Objektträger auf Glas mit primären Antikörper oder Objektträger flach in einer Schüssel und befeuchtet oben mit jeweils 100-500 ul primären Antikörper-Färbung. Dias über Nacht bei 4 ° C ohne Schütteln inkubiert.
8. Nach der primären Antikörper-Inkubation, Transfer gleitet, um Glas PBS Färbung.
9. Filterblock durch den Trichter mit Filterpapier und bei 4 ° C gefüttert, und wenn steril filtriert alle 1-2 Wochen, können Sperren für 1 oder mehrere Monate wiederverwendet werden. Ebenso filtern und speichernprimären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (bis zu 10 oder mehr Runden der Färbung).
10. Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer.
11. Die Objektträger in sekundäre Antikörper in einem lichtdichten Behälter Färbung und Inkubation 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
12. Objektträger auf Glas PBS Färbung. Filter und sparen sekundären Antikörper bei 4 ° C für die Wiederverwendung (für bis zu 10 oder mehr Runden-Färbung).
13. Rinse gleitet dreimal (~ 20 min jeweils) in Antikörperpuffer.
14. Objektträger zu PBS und lassen in PBS (Minuten bis über Nacht bei 4 ° C) bis bereit zu montieren.
15. Arbeiten Sie schnell auf einzelne Folien, so dass die Würmer auf der Vorderseite der Folie bleiben nass. Einen Objektträger aus dem PBS, trocknen Rückseite der Folie mit einem fusselfreien abwischen, und auf Küchenpapier.
16. Platz ~ 20 ul Montagemedium über Würmer, so dass es zu etwa gleichen Teilen Mittel-und PBS auf Schiebe-Kipp-Schiebe sanft auf die beiden Lösungen mischen. CAUTION: Montage Medium ist giftig.
17. Kippschiebers so Mattrand ist niedriger und Lösung sammelt in der Nähe von Zuckerguss, dann legen Sie einen Rand von 24 x 60 mm Deckglas auf Lösung.
18. Senken Sie die Deckglas, um Luftblasen (die Bleich erhöhen und stören Leser) zu minimieren. Wenn sich Blasen bilden, heben Sie den Rand des Deckglases langsam, dann relower ohne Verschieben des Deckglases über die Würmer.
19. Die Kante der Folie vorsichtig trocknen, ohne den Deckglas, durch Zusammendrücken der Kanten mit einem fusselfreien zu wischen. Der relativ trockene Kante der Folien müssen rund um den Rand des Deckglases sichtbar
20. Deckglas mit 2-3 Schichten Nagellack. Dias können in einem flachen Trägerhalter bei Herstellung und Lagerung vor Licht zu schützen platziert werden. Sobald Schlitten gut verschlossen und trocken, reinigen Sie die Deckglas-und Rückseite der Folie.
21. Gut verschlossenen Folien können im Dunkeln Tage bei 4 ° C oder Wochen bei -20 ° C gehalten werden, Über längere Zeiträume, DAPI staining von DNA und die meisten grünen Farbstoffe (z. B. 488 nm Anregung) verblassen. Verschließen Sie das Deckglas mit Nagellack nach Bedarf, z. B. nach Verwendung eines Ölimmersionsobjektiv.

Representative Results

Wenn Würmer richtig komprimiert, rissig, und leicht fixiert ist, kann nahezu die gesamte Schnecken zugänglich Antikörper-Färbung (siehe Abbildung 2). Die Lage der Kerne durch DAPI-Färbung angezeigt anzeigt, welche Teile der Schnecke sind intakt, wenn die Würmer zu einem härteren Fixiermittel wie Formaldehyd ausgesetzt wird, kann sich die Morphologie der Schnecke verzerrt werden (wie durch die unnatürlich wellige Aussehen der gesehen Muskeln in den Fig. 3A-D). Ein weiteres häufiges Problem ist uneben Fixierung oder Eindringen von bestimmten Geweben. Ein Beispiel hierfür ist in den Fig. 3E-H, wobei der Muskel nur in einem Teil der Schnecken gefärbt, obwohl das Vorhandensein anderer Färbung, einschließlich DNA-Färbung, zeigt an, dass zumindest ein Teil des Körpers vorhanden war (gezeigt dh nicht während der Gefriert Cracken entfernt). Das resultierende Muster von Teilfärbung leicht mit der Praxis identifiziert werden, so dass die gesamte DISTRIBUTIauf der Färbung bestimmt werden kann, auch wenn jeder einzelne Wurm zeigt ungleichmäßige Färbung.

Häufige Probleme mit gefrierRissBildung mit jeder Fixierung Zustand angetroffen werden, in der letzten Abbildung (Abbildung 4) veranschaulicht. Das häufigste Problem ist Verdrehen der Probe durch eine relative Bewegung der beiden Schlitten beim Einfedern. Die Tatsache, dass der Körper der Schnecke verdreht nur posterior des Pharynx kann durch die Morphologie der angefärbten Geweben erkennen. Diese Abbildung zeigt auch das Problem mit der Hintergrundfärbung aufgrund Antikörper Kleben an der Polylysin-Beschichtung der Folie. Beachten Sie jedoch, dass alle diese Bilder wurden mit Folien während der ersten Antikörperfärbung Versuche der Studenten in einer Zelle Biologie Praktikum gemacht gesammelt. Auch mit der Praxis werden viele einzelne Würmer, die Probleme in Abbildung 4 zu sehen zeigen. Jedoch auf einem Objektträger, Würmer, wie sie in Fig. 2 und 3 gesehen werden kann found und untersucht.

Fig. 1 ist. Überblick über Verfahren. Flussdiagramm, Schritte, um die komplette Gefriertriss Verfahren durchführen. Alternativen für abwechslungsreiche Fixierung Bedingungen und Anzahl von Würmern sind angegeben.

2. Leicht festen, gut gefärbten Würmer Köpfe von zwei mit Methanol-Aceton fixiert und mit mehreren Antikörpern und Farbstoffen markiert erwachsenen Hermaphroditen:. A) Primäre Antikörper Chat (Cholinacetyltransferase) und Cy3-konjugierten sekundären Antikörper, B) DAPI (blau DNA) , C) Erzgon Grün 488-anti-GFP (green fluorescent protein), D) zeigt die Überlagerung (mit zwei cholinerge Marker, Cy3-Anti-ChAT und Cy5-anti-VAChT (vesikulären Acetylcholin-Transporter) als rot dargestellt). Diese transgenen Stamm (PS4657) drückt eine Übersetzung Fusion zwischen GFP und AJM-1, bei Rachen apikal Gänge gefunden. Die Bilder sind Projektionen der maximalen Serie von konfokalen Bildern; Maßstab ist 50 um.

3. Formaldehyd-assoziierten Störungen. Formaldehyd fixiert Erwachsene mit Cy3-Phalloidin gefärbt (Aktin bindet Faden), DAPI (blau DNA) und Oregon Green 488-anti-GFP. AD) Fours Bilder des Körpers nur posterior der Vulva (ganz links) in der gleichen Nematoden, zeigt eine unnatürlich wellige Morphologie aufgrund der Verzerrung inreduzierten durch Fixierung. A) Red-Phalloidin zeigt leicht unregelmäßige Muskelmorphologie. B) Die Zellkerne (blau) gleichmäßig über den Wurm zu verbreiten. C) Grün zeigt die Verteilung eines CED-1 :: GFP-Fusionsprotein in der Plasmamembran der gonadalen Zellhülle, durch die Maximum-7-Promotor (Stamm MD701). D) angetrieben zeigt die Überlagerung der drei Farben. EH) Markierung kann mit verschiedenen Farben auf dem gleichen Faden variieren. E) Phalloidin (rot) markiert, nur einen Teil der der Muskel auf der einen Seite des Wurms. F) Kerne (blau) während der Wurm vorhanden sind (wenn auch mit ungleichen Intensität gefärbt). G) Die OG488-anti-GFP-Etiketten Kollagen-19 :: GFP in der Kutikula auf einer Seite der Wurm, die Färbung der zentraleren Muskelgewebe fehlt, was darauf hinweist, dass Muskel vorhanden ist, aber nicht auf einer Oberfläche Färbung. H) Zeigt die Überlagerung der drei Farbstoffe. Die Bilder sind maximal Projektionen der Serie von konfokalen Bildern, Maßstabsbalken sind 50 um.

4. Compression-assoziierten Störungen. Formaldehyd fixiert Larve mit A gebeizt) Cy3-Phalloidin (Aktin bindet Faden), B) DAPI (blau DNA), C), Oregon-Green-488-anti-GFP, D) Überlagerung. Die Wendung im Körper nur posterior des Pharynx ist offensichtlich, wie die grüne Ausscheidungszelle und Bauchmark Kreuz über dem Rest des Körpers. Hohe Hintergrundfärbung ist auch offensichtlich mit Cy3-phallodin. Dieser Stamm drückt eine VHA-8 :: GFP-Fusionsprotein, überwiegend in der Ausscheidungs ​​Zelle. Die Bilder sind maximale Projektionen Reihe von konfokalen Bildern, die auf der Oberfläche der Folie erstreckt (was zu hohen Hintergrundfärbung), Maßstabsbalken 50 &mgr; m.

Discussion

Das gefrierCrack Protokoll ist eines von mehreren Verfahren zur Antikörperfärbung in C. elegans. Es bietet eine relativ einfache Möglichkeit, Würmer Fleck, erfordert aber spezifische Reagenzien und Praxis für optimale Ergebnisse. Kritische Schritte (in Abbildung 1 dargestellt) umfassen: 1) Bei Objektträgervorbereitung (siehe Schritte 1 und 2) manuelle Kompression der Nematoden (siehe Schritte 2 und 3) schnelle Fixierung (siehe Schritt 3). Erstens, um die Haftung der Nematoden auf die Objektträger zu maximieren, ist es am besten, Folien mit hohem Molekulargewicht (lange Polymer) Polylysin, anstatt sich auf kommerziell hergestellten Folien, vorbereiten. Handelsträger werden mit Polylysin beschichtet, sodass die Zellen haften, während gefrierRiss Folien sind so konzipiert, um die Kutikula der gesamten Nematoden bleiben. Zweitens ist das Verfahren für die richtige Kompression der Schnecken zwischen den Folien vor dem Einfrieren kritisch. Es erfordert eine ruhige Hand und Praxis, um die Folien zusammen drücken mit der richtigen Menge anDruck, so dass die einzelnen Würmer treten beide Folien ohne Zerstörung ihrer Morphologie. Entweder zu viel oder zu wenig Kompression führt zu einer erhöhten Verlust der Würmer während der Fixierung. Weitere Pflege ist notwendig, um die Folien auf dem Trockeneis gekühlten Oberfläche für das Einfrieren, ohne die Folien relativ zueinander bewegen. Eine solche Bewegung führt dazu, dass die Würmer zu reißen oder zu verdrehen. Drittens, wie bei jedem Fixationstechnik, die gefrorenen Würmern sollten direkt in Fixiermittel vor dem Auftauen platziert werden. Andernfalls kann das Antigen diffundieren, wodurch irreführende Informationen über subzelluläre Lokalisation. Wenn diese kritischen Schritte sind alle richtig gemacht, es ist für beste Ergebnisse immer noch notwendig, mehrere Objektträger scannen, um Würmer mit der besten Morphologie finden.

Eine unvermeidbarer Aspekt dieses Verfahrens ist, dass die Würmer in einer Dimension zusammengedrückt werden. Die Kompression ist am deutlichsten bei Erwachsenen, wobei der scheinbare Durchmesser des Rundkörpers in der z-Achse kann nur ein vier betragenten der in den x-und y-Achse gesehen. Diese Kompression neigt dazu, in kleinere Larven zu verringern, und kann in Embryonen vernachlässigbar. Aufgrund der Art, die lebenden Nematoden während der Diashow Vorbereitung bewegen, sind die gefärbten Würmer oft auf ihren Seiten. Dies ahmt die Ausrichtung der Würmer auf Agar-Gerichte, die mit der Quermittellinie liegen, die sich in der Mitte des gefärbten Wurm (siehe Abbildungen 2-4). Somit ist die Kompression im allgemeinen in der Querdimension. Während dies tatsächlich macht Standard-Fluoreszenzmikroskopie einfacher (mehr von der Probe wird gleichzeitig scharf sein), bedeutet dies, dass 3-D-Rekonstruktionen wird nicht genau sein.

Wie bei jedem Antikörper-Färbung, ist es wichtig, Spezifität der Bindung überprüfen. Bei den meisten Arten wird dies durch Steuerelemente wie Affinität abbau Ihre Antikörper oder Verwendung keine primäre geführt. In C. elegans, präziser Mittel zur Kontrolle Spezifität sind oft vorhanden. Nullmutanten für die Gen-und Protein von Interesse bereitzustelleneine ausgezeichnete Kontrolle für die Färbung Spezifität. Beide Stämme sollten unter identischen Bedingungen vor dem Vergleich festgelegt werden, da die Färbung ist in der Regel Fixierung abhängig. Wenn keine Nullmutante verfügbar ist, dann ist es relativ einfach in C elegans auf Protein-Ebene mit RNAi (RNA-Hemmung ¹²⁾ zu verringern und nach verringert Färbung in RNAi behandelten Würmer.

Polyklonalen Antikörper zeigen häufig unspezifische Färbung, auch wenn mit dem Antigen-Affinität gereinigt. Oft Licht Fixation mit Methanol und Aceton (die Proteine ​​hergestellt, indem sie zu beheben, anstatt sie Vernetzungs) ergibt niedrigere unspezifische Färbung als Formaldehyd oder Glutaraldehyd (was Variante Epitope durch vielseitige Vernetzung generieren) ^1,11. Aber in C. elegans unspezifische Färbung ist sehr häufig unter jeder Befestigungszustand, insbesondere im Darm. Wenn Ihr Antigen wird im Darm exprimiert wird, dann kann diese nicht-spezifische Färbung spezifische staini Maskeng. Wenn Null-Mutanten sind in dem Protein vorhanden ist, dann Würmer mit dieser Methode behoben werden zur Affinitäts führen Ihre Serum werden. Da Antigenität hängt Fixierung Bedingungen sollten die Würmer, die Sie zu Ihrem Verringerung des Antikörper verwenden, in der gleichen Weise wie die Wildtyp-Würmern Sie Färbung vorbereitet werden. Nach einer Runde der Verbrauch nicht-spezifische Färbung, mutierten und Wildtyp-Würmer können parallel mit dem verarmten Serum für eine ausgezeichnete Kontrolle gefärbt werden. Weitere Runde der Erschöpfung mit Mutanten können nach Bedarf durchgeführt werden.

Diese Technik ist sehr nützlich zum Testen neuer Antikörper zur spezifischen Färbung unter einer Vielzahl von Bedingungen. Diese können Antikörper gegen C. erzeugt sein elegans Proteine ​​oder Antikörper gegen konservierten Proteinen aus anderen Spezies erzeugt. Während dieses Verfahren ergibt die beste Morphologie mit leicht fest Nematoden, ist es relativ einfach, eine Reihe von Fixiermitteln, welche Bedingungen zu bestimmen versuchen, wenn vorhanden, geben bestimmte Ergebniss. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Fest Fixation mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd, enzymatische oder Senkung Behandlungen sind nicht für die Probenvorbereitung notwendig. Da diese Behandlungen die Antigenität zu verringern, erhöht sich die Fähigkeit, spezifische Antikörper und deren optimale Fixierung Bedingungen identifizieren. Wenn die Fest Fixierung Bedingungen am besten funktionieren, kann der Experimentator dann Methoden auf intakten Würmern durchgeführt, um eine bessere Morphologie (in unserer bisherigen Arbeit ⁴ zusammengefasst) erhalten einzuschalten. Wenn Licht Fixierung erhält die Antigenität, dann kann diese Technik für alle weiteren Färbung für die Lichtmikroskopie verwendet werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable