Антитела Окрашивание в Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-трещин," метод подвергая внутренние ткани нематод C. Элеганс к антител для локализации белка, демонстрируется.

Abstract

Чтобы окрасить C. Элеганс с антителами, относительно непроницаемой кутикулы должны быть обойдены с помощью химических или механических методов. "Заморозить взлома" является одним из методов, используемое для физического тянуть кутикулу от нематод путем сжатия нематоды между двумя прикрепленных горками, замораживая их, и потянув слайды друг от друга. Freeze-крекинга обеспечивает простой и быстрый способ получить доступ к тканям без химической обработки и могут быть использованы с различными фиксаторов. Однако, это приводит к потере многих образцов и требуемое сжатие механически искажает образец. Практика требуется, чтобы максимизировать восстановление образцов с хорошей морфологией. Freeze-крекинг могут быть оптимизированы для конкретных условий фиксации, сбора проб или низкой неспецифической окрашивания, но не по всем параметрам сразу. Для антител, которые требуют очень жестких условий фиксации и терпеть химических обработок, необходимых для химически проницаемыми кутикулу, ЛЕЧЕНИИможет быть предпочтительным т интактных нематод в растворе. Если антитело требует более легкий исправление или, если оптимальные условия фиксации неизвестны, сублимационной крекинг обеспечивает очень полезный способ быстро анализе антитело и может дать определенную внутриклеточную и клеточный информации для локализации представляющим интерес антигеном.

Introduction

Для определения клеточного и внутриклеточную локализацию белков, ученые традиционно помечены ткани с антителами, выбранными специфически распознавать специфические белки ^1. В некоторых модельных организмов, таких как C. Элеганс, окрашивание антител часто заменяется молекулярно-генетических методов, которые быстрее дают результаты. Они включают трансформирующие организмов с конструкциями, состоящими из гена слияния между промотором и кодирования областей интересующего гена и зеленый флуоресцентный белок. Тем не менее, молекулярные методы с учетом ряда артефактов, в том числе проблем с зная истинного промотор и изменения в экспрессии конструктов на большого числа копий (обычные методы в C. Элеганс) ^2,3. Поэтому окрашивание с антителами остается целью для многих ученых, изучающих функцию белка в естественных условиях.

Окрашивание ткани с антителами может быть трудно, посколькуtibodies может признать только их антиген в определенной конформации ^1. Например, антитела могут распознавать только денатурированный или интактный антиген фиксированный в определенном направлении и не может распознавать антиген на месте. Проблема окрашивания антител у нематод усугубляется тем, что кутикула нематод образует относительно непроницаемый барьер, блокируя доступ антител к тканям.

Есть несколько различных методов, используемых для окрашивания антител в С. Элеганс (отзывы в нашей предыдущей работе ^4). Чтобы окрасить нетронутыми "червей," методы были разработаны, чтобы заморозить и разморозить в относительно жестком фиксатором (формальдегида или глутаральдегида); циклы замораживания-оттаивания помочь взломать кутикулу, чтобы позволить быстрое проникновение закрепляющего ^5. После фиксации кутикула был проницаемыми, чтобы позволить проникновение антитела; методы включали лечение с восстанавливающими агентами, коллагеназы, или обоих ^5-7. Эти тreatments сохранились морфологию, но часто сводится или уничтожены признание антител. Альтернативные методы включают рассечение ^8, чтобы позволить проникновение антител.

"Заморозить взлома" является одним из способов получить доступ к внутренней части полу-нетронутыми червя, чтобы антитела окрашивания ^9-10. Freeze-крекинг может быть выполнена с различными условий фиксации, избегая при этом коллагеназы и сокращению процедуры. Нематоды помещают между двумя клеев слайдов, замораживают, а затем скользит разделены, в результате чего большую часть нематод на нижней стекло и большую часть кутикулы на верхнем слайде. В нижней слайд могут быть помещены в фиксаторе и весь слайд с прилипших нематод передается с помощью процедуры окрашивания антителом. Метод действительно представляет две основные трудности. Во-первых, это трудно применить правильное количество давления, необходимого, чтобы разделить нематод без серьезного деформируя их. Во-вторых, многие из червей не будет сотметка о любом слайде, и будут потеряны в фиксатора или полосканий. Тем не менее, с соответствующими слайдами и практике метод быстро дает нематод с достаточной морфологии который может быть использован с широким спектром фиксаторов и антител.

Способ может быть изменена незначительно, в зависимости от цели экспериментатора. Если окрашивание отдельных нематод нужен (например, чтобы определить, был ли изменен один трансформант окрашивание антител), а затем скользит с максимальной адгезии (но выше фона окрашивание) может быть использована, например, в лабораторных подготовлен слайдов с дополнительной полилизина (см. ниже). Для формальдегида или глутаральдегида фиксации, более высокие горки адгезии (лабораторные подготовлены Полилизиновые слайды) следует использовать, так как нематоды придерживаться более плохо с полилизином после этих записей. Если нематоды дикого типа в настоящее время фиксировали метанолом и / или ацетоном, затем слайды с низкой адгезией и ниже окрашивание фона следует использовать (коммерческая или лaboratory подготовлены слайды). Если разнообразие антител и фиксаторов используются в лаборатории, выбор слайдов могут быть получены заранее и хранить до необходимости.

После доступ к нематоде ткани был накоплен, процедуры окрашивания антител следовать стандартные методы (с более длинными инкубации, характерных для тканей, а не клеток ^1,11).

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько шагов протокола представлены варианты настройки и подготовки в зависимости от конкретных условий эксперимента. Для этих случаев альтернативные шаги представлены в виде A, B, C и т.д. Протокол с альтернативными шагами изложен на рисунке 1.

1. Подготовка Polylysine покрытием Слайды

Три различных типа слайдов могут быть использованы, в зависимости от желаемого компромисса между легкостью подготовки, относительной адгезии и неспецифическое связывание антитела. Информация о подготовке альтернатив скольжения приведены ниже на стадиях 1А-1С в порядке возрастания адгезии и сложности. Слайды подготовленные этих различных методов могут быть использованы вместе для одного эксперимента.

1А. Нет подготовка слайд

Коммерчески доступные Полилизиновые покрытием слайды обеспечить низкую адгезию и низкий фон.

1B. Презентация пр.Оптимальная eparation для метанола и ацетона фиксации

Средний адгезия и низкий фон.

1. Готовят раствор полилизина для погружением слайдов: Добавить 400 мг очень высокой молекулярной массой (150000 - 300000 D) поли-L-лизина в 200 мл дважды дистиллированной воды. Добавить 2 мл 10% азид натрия запас (конечная концентрация 0,1%) в качестве консерванта. ВНИМАНИЕ: сухой азид натрия является реактивным и все формы являются токсичными. Носите маску и перчатки во время взвешивания порошок, чтобы сделать 10% акций в дважды дистиллированной воде.
2. Протрите одиночный конец матового стекла слайды с безворсовых салфеток, удаление пятен и частиц. Это должно быть сделано даже на слайдах, приобретенных с обозначением "предварительную очистку."
3. Место скользит назад к спине в держатель слайдов, Коплин банку или другой окрашивания слайд контейнера, сохраняя обмороженные края и не совсем идеально ровные (сделать позже разделение легче). Поместите держатель ломтик в стакан с 70% этанола (сорт реагента спирта не требуется) с 1%-ной HCl в дизамер воды или заполните окрашивания банку до уровня глазурью. Rock слайдов в растворе в течение как минимум 5 мин. ВНИМАНИЕ: Это решение вызывает коррозию, наденьте перчатки. ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение может быть использованы несколько раз (до нескольких месяцев).
4. Промыть слайды в управлении дистиллированную воду в течение 1 мин.
5. Сухие горки полностью в сухом чистом месте либо путем размещения в 40-60 ° С духовке в течение 30-60 мин или по поддержанию ночи при комнатной температуре.
6. Выдержите слайды в полилизином решения (охватывающий unfrosted частей) на качалке в течение 15 мин.
7. Повторите сушка слайдов.
8. Повторите полилизином решение инкубации и сушки.
9. Отдельные слайды, используя объект тонкий металла, такой как тонкий весом шпателем. Если они правильно соблюдаться, их трудно отделить. Носите соответствующий механизм безопасности (защитные очки) и работать на скамейке верхней бумаги (для выбрасывания после использования), так как небольшие фрагменты стекла могут летать свободно, когда слайды разделены.
10. Храните скользит в чистой(Без пыли) слайд коробка при 4 ° С до использования.

1С. Слайд оптимум подготовка к формальдегида фиксации

Высокая адгезия, но высокий фон.

1. Место слайдов, подготовленных с метод 1B квартире в пыли, печь-безопасной блюдо (для сушки в печи) или на плоской пыли свободной поверхности (для сушки на воздухе).
2. Поместите каплю 20-60 мкл полилизина раствора на середине каждого слайда.
3. Сухие горки полностью в духовке или при комнатной температуре. Полилизиновый оставит позади бледно овалов, как она испаряется. Эти овалы очень клей. К сожалению, они также связываются с первичными и вторичными антителами, даже после блокировки.
4. Храните скользит в чистой (без пыли) слайд-поле при 4 ° С до использования.

2. Подготовка ледяной нематоды Слайды

Подготовка нематод для окрашивания, полностью промывки от бактерий, использующих метод 2А (для пластин нематод) или2B (для индивидуальных нематод).

2А. Подготовка слайдов из пластин нематод

1. Поместите плоский кусок металла на сухом льду, чтобы prechill.
2. Используйте дистиллированную воду и стеклянную пипетку (уменьшает потерю червей) или микропипетки для полоскания червей из NGM пластины с бактериями в 1,5 мл пробирке. Плиты могут быть синхронизированы или смешанных возрастов, не используйте пластины со многими dauers (трудно взломать) или от голода червей (увеличился аутофлюоресценция), если это необходимо.
3. Промыть черви 3-4x дистиллированной водой до полного удаления бактерий. (Для уменьшения потери червей использовать тот же стеклянную пипетку.) Для осаждения червей, либо пусть они сидят на скамейке в течение 3-5 мин (для сбора в основном взрослых в нижней части трубы) или спин 30 сек при температуре ~ 1000 оборотов в минуту (~ 500 г) в настольной центрифуге (собрать взрослых, личинка, и эмбрионов).
4. Удалить большую часть воды из трубки с червями, оставив примерно в два раза объем воды, как черви (но не менее 25 мкл общего объема).
5. Есть равное количество регулярных (протирать, но не полилизиновый обработанных) "сверху" слайдов доступных.
6. Место ~ 25 мкл червей в воде на "нижней" клейкого слайда и распространение жидкости, содержащей червей над центральной части ползуна с помощью сторону кончика пипетки.
7. Пусть черви довольствоваться 30 сек до 2 мин. Если слайд соответствующим липкий, концы червей будет придерживаться, поскольку они связаться слайд.
8. Держите нижнюю слайд в одной руке и поместите верхнюю слайд над нижним горкой, так что все, кроме обмороженные участки накладываются друг на друга. Жидкость должна сохранять слайды слегка расставьте, так что черви-прежнему немного двигаться Не позволяйте горки скольжения друг над другом -. Этот крутит червей.
9. Осторожно нажмите прямо вниз сслегка на верхнем слайде, используя большими и указательными пальцами каждой руки. С идеальным количеством давления, некоторые из крупнейших гермафродитов на краю слайдах будет разрыв, в то время как большинство взрослых особей и личинок свяжется каждого слайда, но останется неизменным.
10. Немедленно и тщательно (без проскальзывания) положить слайды на кусок металла на сухом льду. Слайды должны отображаться замораживают в течение одной минуты. Хранить в сухом льду в течение 5 мин пока полностью не заморожены.
11. В этот момент, слайды могут храниться в меченым коробки при -80 ° С в течение нескольких дней. (Если они хранятся недели при -80 ° С, вода начнет сублимировать в сторону и черви не будет пятно, а). Если слайды хранятся при -80 ° С, то пусть "разогреть" на сухом льду в течение 10 мин до образования трещин.
12. Перейдите к шагу 3 (фиксация).

2B. Подготовка слайдов отдельных нематод

1. Поместите плоский кусок металла на сухом льду, чтобы Precхолм.
2. Используйте червя выбор для передачи отдельных нематод в капле воды на NGM пластины, чтобы освободить их от бактерий. Нематоды (ы) должны быть сытым, чтобы уменьшить аутофлюоресценция, если это возможно. Повторите передачу на новые пятна воды по мере необходимости, пока червь (ов) свободны от бактерий.
3. Этикетка матовое сторону «дно» полилизиновых слайдам с несмываемыми чернилами и место скользит по прилавке рядом с контейнером с сухим льдом, этикеткой вверх. Есть равное количество меньше единомышленником "сверху" (необработанные) слайды доступные.
4. Поместите 5-10 мкл каплю воды на регион нижнего слайда дважды обработанной полилизином. Используйте больший объем, если передачи больше червей, чтобы предотвратить воду от испарения до завершения.
5. Трансфер червя (ы) в капле воды с червячной выбор, используя микроскоп, чтобы смотреть, как черви опуститься коснуться липкой поверхностью слайд. Перевести всего лишь как один червь целых 20 + червей на капли.
6. Держите нижние секLiDE в одной руке и поместите верхнюю салазки на нижней слайд, так что все, кроме обмороженные участки накладываются друг на друга.
7. Немедленно и тщательно (без проскальзывания или сжатия) положить слайды на кусок металла на сухом льду. Держите на сухом льду в течение 5-30 мин. (Не храните Эти слайды долгий срок, как слайды легко высыхает.)
8. Перейдите к шагу 3 (фиксация).

3. Фиксация

Фиксаторы необходимы 'установить' антигена на месте в камере, либо посредством осаждения ("свет фиксации") или сшивающего ("жесткой фиксации") антиген. Фиксация может нарушить антигенностью; наиболее известные антитела лучше всего работают с определенным условиям фиксации. Для новых антител, ряд условий фиксации должны быть проверены.

Для любого фиксации, первый шаг должен сделать фосфата буферного физиологического раствора. Следующая исправить слайды с нематод для окрашивания антител с использованием метода А (светаисправить, используя метанол и ацетон) или B (труднее исправить с помощью формальдегида или глутаральдегида).

1. Подготовьте стерильную 10x PBS (фосфатный солевой буфер) маточного раствора, добавляя 80 г NaCl, 2,0 г KCl, 27,2 г Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 г KH ₂ PO _4, 20 мл 10% азида складе натрия. Чтобы сделать этот исходный раствор, отвешивать порошок азида натрия, чтобы сделать 10%-ный раствор в дважды дистиллированной воде. Перемешать физиологический раствор с медленном огне до полного растворения. ВНИМАНИЕ: сухой азид натрия является реактивным и все формы являются токсичными. Носите маску и перчатки при работе с сухой азида натрия или решений.
2. Пусть солевой круто (Трис рН чувствительна к температуре), то рН до 7,2 с 1-10 М NaOH. Топ до 1 л дважды дистиллированной воде и автоклав для стерилизации. Хранить при комнатной температуре и разбавляют до 1x мере необходимости стерильной дважды дистиллированной воде. ВНИМАНИЕ: NaOH едкий - носить перчатки во время использования.

3А. Свет исправить, используя метанол-ацетон

1. Поместите 100% метанола, 100% ацетон и 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в окрашивания банок на льду в prechill по крайней мере 10 мин. ВНИМАНИЕ: метанол и ацетон являются токсичными, наденьте перчатки.
2. Возьмите пару нижних и верхних слайдов из сухого льда, стремительно крутить их друг от друга, и сразу же погрузите "снизу" слайд в ледяной метанола в течение 2 мин. "Сверху" слайд могут быть отброшены.
3. Трансфер слайды из метанола с ледяным ацетон в течение 4 мин. Если слайды было много червей, большинство (90%) будет падать в исправить, даже с наиболее подготовленных слайдов. Если одиночные горки червь были должным образом подготовлены, черви должны оставаться придерживался.
4. Наведите или окунуть слайды в банку с PBS (чтобы смыть фиксатором) и перейдите к шагу 4 (окрашивание).

3B. Жесткий исправить с помощью формальдегида или глутаральдегида

1. Развести х.ч. формальдегид или глютаральдегида решение в 1x PBS в 0,5-4% конечной концентрации. Аликвоты (1,5 мл) мау храниться плотно закрывают при температуре от -20 до -30 ° С; аликвоты размораживания на льду непосредственно перед использованием. ПРИМЕЧАНИЕ: формальдегид решения со временем ухудшаться и с воздействием воздуха. ВНИМАНИЕ: формальдегид и глутаральдегид токсичны, носить перчатки и работать в капюшоне.
2. Возьмите пару нижних и верхних слайдов из сухого льда, стремительно крутить их друг от друга, и сразу же поместить "снизу" слайд с червями в плоском блюде с крышкой. (Верхний слайд может быть отброшен).
3. Сразу пипетки 200 мкл токсическое фиксатор над центром области слайда с червей. Фиксатор частично заморозить на месте, то таять, чтобы покрыть большую область слайда.
4. Если черви не полностью покрыты фиксатора, немедленно и тщательно добавить больше фиксатором помощью микропипетки. Не допускать фиксатор течь через край слайда.
5. Накройте блюдо крышкой и оставить на 10 мин, чтобы на ночь при комнатной температуре. Убедитесь, что блюдо увлажняется, если более длительные инкубации аре используется - это может быть сделано путем добавления сложенные влажные безворсовые салфетки к блюду. Не позволяйте салфетки прикоснуться слайды.
6. После фиксации завершена, тщательно пипетки фиксатор со свободными червей в 1,5 мл трубки и опустите слайда в окрашивания банку с PBS.
7. Спин трубку с червями, которые пришли свободные на высокой скорости в течение 30 секунд для осаждения. Промыть червей дважды PBS, затем обработать параллельно с червями на слайдах (делают шаги в микроцентрифужные пробирки, а не на слайдах).
8. Перейдите к шагу 4 (окрашивание).

4. Антитела Окрашивание

Протокол окрашивания антител аналогичен стандартным протоколам для любой ткани на слайдах. Этот протокол является одинаковым для всех слайдов, независимо от препарата на этапах 1-3.

1. Подготовка Антитела буфера путем смешивания 700 мл дважды дистиллированной воде, 100 мл 10х PBS, 5 мл Тритона Х-100 (0,5% конечный), 2 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8 (1 мМ конечной), 1 г BSA (0,1% конечный), 5 мл 10% аз натрияязь решение (0.05% конечная). рН до 7,2 с помощью HCl, затем добавить дистиллированную воду двойной до 1 л; хранят при температуре 4 ° С.
2. Подготовка блока путем восстановления осла сыворотки с дважды дистиллированной воде, с последующим добавлением 5 мл сыворотки на 45 мл буфера антител (конечная 10% сыворотки).
3. Подготовка первичных и вторичных антител Решения путем разбавления антитела в буфере антител плюс 1% BSA. Рекомендуемые разведения являются 1:50-1:2,000 для первичных антител и 1:1,000-1:5,000 для вторичных антител (Cy3or OG488 сопряженные осел антител против видов, используемых для повышения первичного антитела).
4. Подготовка DAPI акции путем смешивания 2,5 мг / мл в дважды дистиллированной воде; магазин в 8 мкл аликвоты замораживали при -30 ° С ВНИМАНИЕ: DAPI является токсичным связывания ДНК краситель, носить перчатки во время взвешивания и дозирования на аликвоты.
5. Подготовка 10 мл монтажную среду путем смешивания 200 мг н-пропилгаллат, 0,3 мл 1 М Трис рН 9, 2,7 мл дважды дистиллированной воды в 15 мл коническую пробирку. Нагревают при 65 ° С в течение примерно 10 мин до полного растворения.Добавить 7 мл глицерина и 8 мкл аликвоты DAPI и вихрь хорошо. Алиготе среднего в 1,5 мл пробирки, заверните в фольгу и хранить в темном месте при температуре 4 ° С (как воздух и свет ухудшить среду - если она становится более желтым, откинуть на биологически опасных отходов). ВНИМАНИЕ: н-пропилгаллат представляет собой реакционноспособную антиоксидант, в то время как в перчатках весом.
6. Трансфер слайды окрашивания банку с блока в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С (ночью предпочтительной для жесткого исправить). Избегайте встряхивания, чтобы не потерять червей.
7. Передача скользит к образованию пятен банку с первичным антителом или место слайдов плоских в увлажненной блюдо и сверху каждого с 100-500 мкл первичных антител. Выдержите слайды в течение ночи при 4 ° С без встряхивания.
8. После первичного антитела инкубации, передачи скользит к образованию пятен банку PBS.
9. Фильтр блок через воронку выложены фильтровальной бумаги и хранить при температуре 4 ° С, если стерильной фильтрации каждые 1-2 недели, блок может быть использован повторно в течение 1 или более месяцев. Точно так же, фильтровать и сохранятьПервичное антитело при 4 ° С для повторного использования (до 10 и более раундов окрашивания).
10. Промыть слайды три раза (~ 20 мин каждый) в буфере антител.
11. Поместите слайды в вторичными антителами в светонепроницаемый окрашивания контейнера и инкубировать 4 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
12. Передача скользит к образованию пятен банку PBS. Фильтр и сохранить вторичного антитела при 4 ° С для повторного использования (до 10 и более раундов окрашивания).
13. Промыть слайды три раза (~ 20 мин каждый) в буфере антител.
14. Передача слайды PBS и не оставляют в PBS (минут, чтобы в течение ночи при 4 ° С) до момента монтажа.
15. Быстро работать с отдельными слайдами, так что черви на передней части слайда остаются влажными. Удалить один слайд из PBS, сухой задней части слайда с ворса протрите, и место на бумажном полотенце.
16. Место ~ 20 мкл монтажа среду над червей, так что есть примерно равные части средних и PBS на слайде и наклона слайд осторожно, чтобы смешать два решения. CautION: Монтаж среднего токсичен.
17. Тент слайд так матовое края ниже, а решение собирает около глазурью, затем поместите один край 24 х 60 мм покровным на решения.
18. Осторожно опустите покровное минимизировать пузырьки воздуха (которые увеличивают отбеливание и нарушить осмотр). Если пузырьки образуют, поднимите край покровного стекла медленно, то relower его без скольжения покровное через червей.
19. Тщательно высушить край слайда, не двигаясь покровное, сжимая края с ворса протрите. Относительно сухой край слайда должен быть виден по всему краю покровного стекла
20. Уплотнение покровное с 2-3 слоями лака для ногтей. Слайды могут быть помещены в плоском держателе слайдов во время приготовления и хранения для защиты от света. После того, как слайд хорошо закрытой и сухой, очистить покровное и задней части слайда.
21. Хорошо прилегающие слайды могут храниться в темноте в течение нескольких дней при 4 ° С или недель при температуре -20 ° С. В более долгосрочной перспективе ДАПИ станцииining ДНК и самых зеленых красителей (например, 488 нм возбуждения) исчезают. Reseal покровное с большим лака для ногтей по мере необходимости, например, после того, как с помощью любого масла погружения линзы.

Representative Results

Когда черви правильно сжатый, трещины, и слегка фиксированной, практически весь червь может быть доступным для окрашивания антител (см. рисунок 2). Расположение ядер, как показано окрашивание DAPI указывает, какие части червя целы Когда черви подвергают более жесткой фиксатора, такого как формальдегид, морфология червя может быть искажено (как видно на неестественно волнистой появления Мышцы на фиг.3А-D). Другой распространенной проблемой является неравномерное фиксация или проникновение частности тканей. Пример этого показан на фиг 3E-H, где мышца, окрашенных только в части червя, несмотря на то, что присутствие других окрашивания, в том числе окрашивания ДНК, указывает, что по крайней мере часть тела присутствовал ( т.е. не удаляется во время ледостава трещин). Полученный образец частичного окрашивания могут быть легко идентифицированы с практикой, так что весь распрена окрашивания можно определить, даже если какой-либо одной червь показывает неравномерное окрашивание.

Общие проблемы, связанные с замораживанием-крекинга с использованием любого состояния фиксации проиллюстрированы в конечном рисунке (рис. 4). Самая распространенная проблема крутит образца из-за относительного движения двух слайдов во время сжатия. Тот факт, что тело червя закручивается только задняя глотки можно увидеть, морфологии окрашенных тканей. Это изображение также показывает проблему с фоновое окрашивание, за счет антитело прилипает к поли-лизина покрытие слайда. Заметим, однако, что все эти образы были собраны с использованием слайдов, сделанных в ходе первых попыток окрашивания антител из высшего образования в клеточной биологии лабораторного практикума. Даже с практикой, многие отдельные черви покажет проблемы показано на рисунке 4. Тем не менее, на любом одном слайде, червей, подобные видно на рисунках 2 и 3 может быть осног и рассмотрены.

Рисунок 1. План процедур. Блок-схема с указанием шаги для выполнения полную процедуру замораживания взлома. Альтернативы для различных условий фиксации и количества червей указаны.

Рисунок 2. Слегка фиксированные, хорошо окрашенные черви Главы двух взрослых гермафродитов фиксировали метанолом-ацетоном и меченных нескольких антител и красителей:.) Первичного антитела общаться (холинацетилтрансферазы) и Су3-сопряженных вторичными антителами, В) DAPI (синий ДНК) , С) Рудаугольник Зеленый 488-анти-GFP (зеленый флуоресцентный белок), D) показывает накладку (с двумя холинергических маркеров, Су3 анти-чат и Су5-анти-VAChT (везикулярного ацетилхолин транспортера) показано, как красный). Это трансгенных штамм (PS4657) выражает перевода слияние между GFP и AJM-1, найденный в глотки верхушечных переходов. Образы являются максимальными проекции серии конфокальных изображений; масштабная линейка составляет 50 мкм.

Рисунок 3. Формальдегид связанных искажения. Формальдегида фиксированные взрослых, окрашенные Cy3-фаллоидином (связывает нитчатые актина), DAPI (синий ДНК), и Орегон Зеленый 488-анти-GFP. Н.э.) Fours образы тела просто задняя вульвы (крайний слева) в том же нематоды, показывая неестественно волнистые морфологию из-за искажения втанавливайте фиксации.) красных фаллоидином показывает немного неправильную морфологию мышц. Б) Ядра (синий) равномерно распределены по всей червя. C) Зеленый показывает распределение в CED-1 :: GFP слитого белка в плазменной мембране гонадная оболочка клеток, вызванный Ит-7 промоутер (штамм MD701). D) Показывает наложение этих трех красителей. EH) Маркировка может меняться при различных красителей на той же нематоды. Е) фаллоидином (красный) этикетки только часть мышц на одной стороне червя. F) Ядра (синий) присутствуют в червя (хотя окрашивали неровной интенсивности). G) OG488-анти-GFP этикетки коллаген-19 :: GFP в кутикуле на стороне червь, не хватает окрашивание более центральное мышечной ткани, что свидетельствует, что мышцы присутствует, но не окрашивания на одной поверхности. H) Показывает наложение трех красителей. Изображения максIMAL проекции серии конфокальных изображений; масштабные бары 50 мкм.

Рисунок 4. Компрессионные связанных искажения. Формальдегид фиксированной личинка окрашивали А) Су3 фаллоидином (связывает нитчатые актина), В) DAPI (синий ДНК), С) Орегон-зеленый 488-анти-GFP, D) Наложение. Поворот в организме только задняя глотки очевидно, как зеленый выделительной клетки и брюшной нервной креста шнура над остальной частью тела. Высокая фон окрашивание Также очевидно, с Cy3-phallodin. Этот штамм выражает VHA-8 :: GFP слитый белок, расположенный преимущественно в выделительной клетки. Образы являются максимальными проекции серии конфокальных изображений, которые простирались на поверхность слайда (что приводит к высокой фона окрашивания); масштабная линейка составляет 50 мкм.

Discussion

Протокол замораживания взлома является одним из нескольких методов окрашивания антител в С. Элеганс. Это обеспечивает относительно простой способ окрасить червей, но требует специфических реагентов и практики для достижения оптимальных результатов. Критические шаги (изложенные на рисунке 1) включают в себя: 1) подготовка слайд (см. шаги 1 и 2) ручной сжатие нематод (см. пункты 2 и 3) быстрое фиксацию (см. шаг 3). Во-первых, чтобы максимизировать сцепление нематод в слайдах, то лучше подготовить слайды с высокой молекулярной массой (долго полимер) полилизином, вместо того чтобы полагаться на коммерчески подготовленные слайды. Коммерческие горки покрыты полилизином чтобы клетки придерживаться, в то время как замораживание взлома скользит предназначены придерживаться кутикулы целых нематод. Во-вторых, процедура для правильного сжатия червей между слайдами до замораживания имеет решающее значение. Это требует твердой рукой и практики нажать слайды вместе, используя правильное количестводавление так, что отдельные черви связаться обе слайды, не разрушая их морфологию. Либо слишком много или слишком мало сжатие приводит к увеличению потерь червей во время фиксации. Далее необходимо проявлять осторожность, чтобы переместить слайды на охлажденной сухим льдом поверхности для замораживания без перемещения слайдов относительно друг друга. Любое такое предложение вызовет черви рвать или крутить. В-третьих, как с любой техникой фиксации, замороженные черви должны быть размещены непосредственно в фиксатора перед размораживанием. В противном случае, антиген может диффундировать, предоставление ложной информации о субклеточной локализации. Если эти критические шаги все сделано правильно, для достижения наилучших результатов все еще необходимо отсканировать несколько окрашенных слайды найти червей с лучшим морфологии.

Один неизбежным аспектом этого метода является то, что черви будут сжаты в одном измерении. Сжатие наиболее заметен у взрослых, где видимый диаметр круглого тела в оси может быть только один-четырего, что видели в рентгеновских и у-осей. Это сжатие имеет тенденцию к снижению в меньшем личинок, и может быть незначительным в эмбрионах. В связи с тем, как нематоды двигаться во время подготовки слайд, окрашенные черви часто на боку. Это имитирует ориентацию червей на агар блюд, с боковой средней линии, лежащей расширения по середине окрашенных червя (см. рисунки 2-4). Таким образом, сжатие, как правило, в поперечном измерении. Хотя это на самом деле делает стандартная люминесцентная микроскопия легче (более образца будут в фокусе одновременно), это означает, что 3-D реконструкции не будет точно.

Как и в любой окрашивания антител, важно, чтобы проверить специфичность связывания. У большинства видов, это делается с помощью элементов управления, таких как близость разрушающих ваш антитела или без использования первичного. В С. Элеганс, более конкретные средства проверки на специфичность часто доступны. Нулевые мутанты по гену и интересующего белка обеспечиваютпревосходный контроль для окрашивания специфичности. Оба штамма должны быть закреплены в одинаковых условиях перед сравнением, поскольку окрашивание, как правило, фиксация зависит. Если не нуль мутант не доступен, то он сравнительно легко в С. Элеганс, уменьшая уровни белка с РНК-интерференции (RNA ингибирования ¹²⁾ и искать снизилась окрашивания в РНК-интерференции, получавших червей.

Поликлональные антитела часто показывают неспецифическую окрашивание, даже если аффинно очищенным антигеном. Часто, легкий фиксирующий с использованием метанола и ацетона (которые фиксируют белки путем осаждения их, а не сшивания их) дает нижнюю неспецифическую окрашивание, чем формальдегид или глутаральдегид (которые генерируют больше вариантные эпитопы из-за разнообразной сшивания) ^1,11. Тем не менее, в С. Элеганс неспецифическое окрашивание очень часто при любых условиях фиксации, особенно в кишечнике. Если антиген экспрессируется в кишечнике, то это неспецифическое окрашивание может маскировать свой конкретный stainiнг. Если нулевые мутанты, доступных для белка, то черви фиксированные с помощью этого метода можно использовать для аффинной истощать свой сыворотки. С Антигенность зависит от условий фиксации, черви, которые вы используете, чтобы исчерпать свой антитела должны быть готовы так же, как дикого типа червей вы окрашивания. После одного раунда истощения неспецифического окрашивания, мутанта и дикого типа червей могут быть окрашены параллельно с обедненным сыворотки для превосходного управления. Дополнительная раунд истощения с мутантами можно сделать по мере необходимости.

Эта техника очень полезна для тестирования новых антител для специфического окрашивания при различных условиях. Они могут быть антитела, полученные против C. Элеганс белки или антитела, полученные против консервативных белков из других видов. Хотя этот метод дает наилучшее морфологию с слегка фиксированных нематод, это было сравнительно просто, чтобы попробовать ряд фиксаторов чтобы определить, какие условия, если таковые имеются, дают конкретный результатс. В отличие от других методов жесткой фиксации с использованием формальдегида или глутаральдегида, ферментативную или сокращения процедуры не нужны для подготовки проб. Поскольку эти процедуры могут снизить антигенность, это увеличивает способность идентифицировать специфические антитела и их оптимальные условия фиксации. Если жесткие условия фиксации работать лучше, экспериментатор может обратиться к методам, выполненных на неповрежденных червей для получения лучшего морфологии (обобщенные в нашей предыдущей работе ^4). Если легкий фиксирующий сохраняет антигенность, то этот метод может быть использован для всех дальнейших окрашивания для световой микроскопии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable