Antikropp färgning i Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-cracking," en metod för att exponera de inre vävnaderna i nematoden C. elegans till antikroppar för proteinlokalisering, demonstreras.

Abstract

Att färga C. elegans med antikroppar, måste den relativt ogenomträngliga nagelband kringgås genom kemiska eller mekaniska metoder. "Freeze-cracking" är en metod som används för att fysiskt dra i nagelbanden från nematoder genom att komprimera nematoder mellan två tillhörande bilder, frysa dem och dra bilderna isär. Fryst krackning ger ett enkelt och snabbt sätt att få tillgång till vävnaderna utan kemisk behandling och kan användas med en mängd olika fixeringsmedel. Däremot leder det till förlust av många av proverna och den nödvändiga kompressionen snedvrider mekaniskt provet. Öva krävs för att maximera återvinningen av prover med god morfologi. Fryst sprickbildning kan optimeras för specifika fixeringsförhållanden, återvinning av prover, eller låg ospecifik färgning, men inte för alla parametrar på en gång. För antikroppar som kräver mycket hårda fixeringsförhållanden och tål de kemiska behandlingar som behövs för att kemiskt permeabilize nagelbanden, treatment av intakta nematoder i lösning kan vara att föredra. Om antikroppen kräver en lättare fix eller om de optimala fixeringsförhållandena är okänd, tillhandahåller frys krackning ett mycket användbart sätt att snabbt analysera antikroppen och kan ge specifika subcellulära och cellulära lokaliseringen informationen för antigenet av intresse.

Introduction

För att bestämma den cellulära och subcellulära lokalisering av proteiner, har forskare traditionellt märkta vävnader med antikroppar som valts för att specifikt känna igen särskilda proteiner ^1. I vissa modellorganismer såsom C. elegans har antikroppsfärgning ofta ersatts av molekylärgenetiska tekniker, vilka ger resultat snabbare. Dessa innefattar transformerande organismer med konstrukt bestående av genfusioner mellan promotor och kodande regioner av genen av intresse och grönt fluorescerande protein. Molekylära tekniker är dock föremål för ett antal artefakter, bland annat problem med att känna den sanna promotorn och förändringar i uttryck av konstruktioner på ett stort antal kopior (de vanliga teknikerna i C. elegans) ^2,3. Därför färgning med antikroppar förblir ett mål för många forskare som studerar proteiners funktion in vivo.

Färgning vävnader med antikroppar som kan vara svårt, eftersom entibodies får bara erkänna deras antigen i en viss konforma ^1. Till exempel kan antikroppar känner igen endast denatureras eller intakt antigen fast på ett visst sätt och kanske inte känner igen antigenet in situ. Problemet med antikroppar färgning i nematoder förvärras av det faktum att nagelbanden av nematoden bildar en relativt ogenomtränglig barriär, blockera åtkomst av antikroppar till vävnaderna.

Det finns flera olika metoder som används för antikroppsfärgning i C. elegans (över i vårt tidigare arbete ^4). Att färga intakta "maskar," har metoder utvecklats för att frysa och tina i ett relativt hårt fixativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), de frys-tö cykler hjälpa knäcka nagelbanden för att möjliggöra en snabb penetration av fixativ ^5. Efter fixering till ytterhud permeabiliseras för att medge penetrering av antikroppen; metoder inkluderade behandling med reduktionsmedel, kollagenas, eller både och ^5-7. Dessa treatments bevarade morfologi, men ofta reduceras eller förstörda antikroppsigenkänning. Alternativa metoder inkluderar dissektion ⁸ för att möjliggöra penetration antikropp.

"Freeze-cracking" är ett sätt att få tillgång till det inre av det halv intakt mask för att tillåta antikroppsfärgning ^9-10. Fryst krackningen kan genomföras med en mängd olika fixeringsförhållanden samtidigt som man undviker kollagenas-och reduktionsbehandlingar. Nematoderna är placerade mellan två lim diabilder, frysta och sedan objektglasen separerades, lämnar de flesta av nematoden på botten sliden och mycket av ytterhud på översta objektglaset. Den nedre bild kan placeras i fixativ och hela bilden med vidhäftade nematoder överförs genom antikroppsfärgningsproceduren. Metoden ställer dock två stora problem. För det första är det svårt att tillämpa rätt mängd tryck som krävs för att dela upp de nematoder utan att allvarligt deformera dem. För det andra, många av maskarna kommer inte skryssa antingen glida, och kommer att gå förlorade i fixativ eller sköljningar. Men med de riktiga diabilder och praxis, varvid förfarandet kommer snabbt erhållande nematoder med rimlig morfologi som kan användas med en mängd olika fixativ och antikroppar.

Metoden kan varieras något, beroende på målet för den som utför experimentet. Om färgning av enstaka nematoder önskas (t.ex. för att fastställa om en enda trans har förändrat antikroppsfärgning), glider sedan med maximal vidhäftning (men högre bakgrundsfärgning) kan användas, till exempel laboratorie förberedda bilder med extra polylysin (se nedan). För formaldehyd eller glutaraldehyd fixering bör högre vidhäftnings diabilder (laboratorie förberedda polylysin diabilder) användas, eftersom nematoder hålla sig sämre till polylysin efter dessa upptagningar. Om vildtyp nematoder slås fast med metanol och / eller aceton, glider sedan med lägre friktion och lägre bakgrundsfärgning bör användas (kommersiella eller laboratory förberedda diabilder). Om en mängd olika antikroppar och fixativ som används i laboratoriet, kan ett urval av glas förberedas i förväg och lagras tills det behövs.

Efter tillgång till nematoden vävnad har vunnits, antikroppsfärgningsförfaranden följer standardmetoder (med längre inkubationer karakteristiska av vävnader snarare än celler ^1,11).

Protocol

OBS: Flera protokollsteg presenteras med alternativ för installation och förberedelse beroende på de särskilda villkoren för experimentet. För dessa fall finns alternativa åtgärder presenteras som A, B, C, etc. Protokollet med alternativa åtgärder som skisseras i figur 1.

1. Beredning av Polylysin Coated Slides

Tre olika typer av bilder kan användas, beroende på den önskade avvägningen mellan enkel framställning, relativ vidhäftning, och icke-specifik bindning av antikroppen. Uppgifter om glid förberedelse alternativ ges nedan i steg 1A-1C för att öka vidhäftning och komplexitet. Slides framställda genom dessa olika metoder kan användas tillsammans i ett enda experiment.

1A. Ingen glaspreparering

Kommersiellt tillgängliga polylysin belagd slides ge låg vidhäftning och låg bakgrund.

1B. Slide preparation optimum för metanol-aceton-fixering

Medel vidhäftning och låg bakgrund.

1. Bered en polylysine lösning för att doppa bilderna: Lägg till 400 mg med mycket hög molekylvikt (150.000 - 300.000 D) poly-L-lysin till 200 ml dubbeldestillerat vatten. Lägg till 2 ml 10% natriumazid lager (slutkoncentration 0,1%) som konserveringsmedel. VARNING: torr natriumazid är reaktivt och alla former är giftiga. Bär mask och handskar när vägnings pulver för att göra 10% lager i dubbeldestillerat vatten.
2. Torka enda end frostade glasskivor med luddfria våtservetter, ta bort fläckar och partiklar. Detta bör göras även på objektglas som köpts med beteckningen "förrenade."
3. Placera glider back-to-back i en glashållare, coplinkärlet eller annan glasfärgbehållare, hålla frostade kanter upp och inte helt perfekt i linje (för att senare separation lättare). Placera slice hållare i bägare med 70% etanol (reagenskvalitet alkohol inte behövs) med 1% HCl i distillade vatten eller fyll färgning burk till nivån av glasyr. Vagga objektglasen i lösningen under minst 5 min. VARNING: Denna lösning är frätande, använd handskar. OBS: Denna lösning kan återanvändas flera gånger (upp till flera månader).
4. Skölj objektglasen i rinnande destillerat vatten i 1 min.
5. Torra glider helt i en dammfri miljö, antingen genom att placera i en ugn vid 40-60 ° i 30-60 min eller genom att hålla över natten i rumstemperatur.
6. Inkubera objektglasen i polylysin lösning (som täcker unfrosted delar) på rocker i 15 min.
7. Upprepa torkning av diabilder.
8. Upprepa polylysine lösning inkubation och torkningssteg.
9. Separera bilderna med hjälp av en tunn metallföremål som en tunn väger spatel. Om de är korrekt fäst, de är svåra att separera. Använd lämplig skyddsutrustning (skyddsglasögon) och arbeta på bänk papper (som ska kastas efter användning), eftersom små bitar av glas kan flyga lös när diabilder separeras.
10. Lagra bilder i ren(Dammfri) glid låda vid 4 ° C tills de behövdes.

1C. Skjut förberedelse optimala för formaldehyd fixering

Högsta vidhäftning men hög bakgrund.

1. Placera objektglasen framställda med metod 1B lägenhet i en dammfri, ugn-säker skål (för torkning i ugn) eller på en plan dammfri yta (för lufttorkning).
2. Placera en 20-60 l droppe av polylysin lösningen på mitten av varje bild.
3. Torra glider helt i ugnen eller i rumstemperatur. Den polylysin kommer att lämna efter bleka ovaler som det avdunstar. Dessa ovaler är mycket lim. Tyvärr är de också binda till de primära och sekundära antikropparna, även efter blockering.
4. Lagra bilder i ren (dammfritt) slide rutan vid 4 ° C tills det behövs.

2. Beredning av Frozen Nematode Slides

Förbered nematoder för färgning genom att helt skölja fri från bakterier med metod 2A (för plattor av nematoder) eller2B (för enskilda nematoder).

2A. Beredning av diabilder från plattor av nematoder

1. Placera en platt bit metall på torris till prechill.
2. Använd destillerat vatten och ett glas pipett (minskar förlust av maskar) eller mikropipett för att skölja maskar från NGM tallrik med bakterier i en 1,5 ml mikrofugrör. Plattorna kan synkroniseras eller blandade åldrar, använd inte plåtar med många dauers (svåra att knäcka) eller svalt maskar (ökad autofluorescens) om inte nödvändigt.
3. Skölj maskarna 3-4x med destillerat vatten tills den är fri från bakterier. (För att minska förlusten av maskar använder samma glas pipett.) Att pellets maskar, antingen låta dem sitta på bänken i 3-5 min (för att samla mestadels vuxna i botten av röret) eller snurra 30 sek vid ~ 1000 rpm (~ 500 g) i en bordscentrifug (samla vuxna, larver och embryon).
4. Avlägsna det mesta av vattnet från röret med maskar, vilket innebär att ungefär två gånger den volym vatten som maskar (men åtminstone 25 ^ il total volym).
5. Har lika många vanliga (torkas men inte polylysine behandlats) "top" Bilder tillgängliga.
6. Placera ~ 25 il maskar i vattnet på "botten" vidhäftande slide och sprider vätskan innehåller maskar över den centrala delen av bilden med sidan av pipettspetsen.
7. Låt maskarna sedimentera under 30 sek till 2 min. Om bilden är lämpligt klibbig, kommer ändarna av maskar fastnar när de kontaktar bilden.
8. Håll den nedersta bilden i ena handen och placera den övre sliden över bottenglid så att alla utom de frusna kroppsdelar överlappar. Vätskan bör hålla bilderna något isär, så att maskarna rör sig fortfarande något Låt inte bilderna glida över varandra -. Detta vrider maskarna.
9. Tryck försiktigt rakt ner slätt på den övre bilden, med hjälp av tumme och pekfinger i varje hand. Med den perfekta mängden tryck, kommer några av de största hermafroditer på kanten av bilderna brista, medan de flesta av de vuxna och larver kommer att kontakta varje bild, men kommer att stanna intakt.
10. Omedelbart och försiktigt (utan att halka) satte bilderna på metallbit på torris. Bilderna ska visas frysas inom en minut. Förvara på torr is i 5 minuter tills den är helt frusen.
11. Vid denna punkt, kan diabilder förvaras i en märkt ruta vid -80 ° C under flera dagar. (Om de hålls veckor vid -80 ° C, kommer vattnet att börja sublimera bort och maskarna kommer inte fläckar också). Om diabilder förvaras vid -80 ° C, låt dem "värma upp" på torris i 10 min innan sprickbildning.
12. Gå vidare till steg 3 (fixering).

2B. Beredning av diabilder enskilda nematoder

1. Placera ett plant stycke av metall på torris till föregkulle.
2. Använd en mask val för att överföra enskilda nematoder till en droppe vatten på ett NGM platta för att befria dem från bakterier. Nematod (s) bör vara välnärda att minska autofluorescens, om möjligt. Upprepa överföring till nya fläckar av vatten som behövs till dess mask (s) är fri från bakterier.
3. Märk frostat sidan av "botten" polylysin diabilder med outplånligt bläck och placera objektglasen på disken bredvid behållare med torris, etikettsidan uppåt. Har ett lika stort antal mindre adherent "topp" (obehandlade) Bilder tillgängliga.
4. Placera en 5 till 10 | il droppe vatten på den region i den nedre gliddubbel behandlades med polylysin. Använd den större volymen om att överföra fler maskar, för att hindra vattnet från att avdunsta före färdigställande.
5. Överför masken (er) till droppe vatten med snäck plockning med hjälp av mikroskop för att titta på när maskar sjunker ner för att röra den klibbiga glidyta. Ta så få som en mask för att så många som 20 + maskar per droppe.
6. Håll botten slide i ena handen och placera den övre sliden över botten sliden så att alla utom de frusna kroppsdelar överlappar.
7. Omedelbart och försiktigt (utan att halka eller komprimera) satte bilderna på metallbit på torris. Förvara på torr is i 5-30 minuter. (Förvara inte dessa bilder på lång sikt, eftersom de glider lätt torka ut.)
8. Gå vidare till steg 3 (fixering).

3. Fixering

Fixeringsmedel är nödvändiga för att "fixa" antigenet på plats i cellen, antingen genom fällning ("lätt fixering") eller tvärbindning ("hård fixering") antigenet. Fixering kan störa antigenicitet, mest kända antikroppar fungerar bäst med en viss fixering tillstånd. För nya antikroppar, bör en rad fixeringsförhållanden testas.

För varje fixering, är det första steget för att göra fosfatbuffrad saltlösning. Nästa fix diabilder med nematoder för antikroppsfärgning med metod A (ljusfixa med hjälp av metanol och aceton) eller B (hårdare fix med hjälp av formaldehyd eller glutaraldehyd).

1. Bered en steril 10x PBS (fosfatbuffrad saltlösning) förrådslösning genom tillsats av 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27,2 g Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g KH ₂ PO _4, 20 ml 10% natriumazid lager. För att göra denna stamlösning, väg upp natriumazid pulver för att ge 10%-ig lösning i dubbeldestillerat vatten. Rör saltlösning med svag värme tills det är upplöst. VARNING: torr natriumazid är reaktivt och alla former är giftiga. Bär mask och handskar när du arbetar med torr natriumazid eller lösningar.
2. Låt saltlösning svalt (Tris pH är temperaturkänsligt), sedan pH-värdet till 7,2 med 1-10 M NaOH. Upp till 1 L med dubbeldestillerat vatten och autoklav för att sterilisera. Förvara i rumstemperatur och späd till 1x efter behov med sterilt dubbeldestillerat vatten. VARNING: NaOH är frätande - bära handskar vid användning.

3A. Lätt fix använder metanol-aceton

1. Sätt 100% metanol, 100% aceton, och 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i färgningskärl på is för att prechill under åtminstone 10 min. VARNING: Metanol och aceton är giftiga, handskar.
2. Ta ett par av botten-och topp diabilder från torris, snabbt vrida isär dem, och omedelbart doppa "botten" slide in iskall metanol i 2 min. Den "övre" slide kan kasseras.
3. Överför objektglasen från metanol för att iskall aceton under 4 min. Om bilderna hade många maskar, kommer de flesta (90%) faller av i fix, även med de bäst förberedda bilder. Om enstaka mask diabilder var ordentligt förberedda, bör maskarna hålla följas.
4. Placera eller Doppa dem i burken med PBS (att skölja bort fixativ) och gå vidare till steg 4 (missfärgning).

3B. Hård fix använder formaldehyd eller glutaraldehyd

1. Späd reagenskvalitet formaldehyd eller glutaraldehydlösning i 1x PBS till 0,5 till 4% slutlig koncentration. Alikvoter (1,5 ml), may förvaras väl försluten vid -20 till -30 ° C; tina alikvoter på is strax före användning. OBSERVERA: formaldehydlösningar försämras med tiden och med exponering för luft. VARNING: formaldehyd och glutaraldehyd är giftiga, använda handskar och arbeta i huven.
2. Ta ett par av botten-och topp diabilder från torris, snabbt vrida isär dem, och omedelbart placera "botten" slide med maskar i lägenheten skålen med lock. (Den övre slide kan kasseras).
3. Omedelbart pipett 200 l giftig fixativ över mitten av det område av bilden med maskar. Den fixativ kommer delvis frysa på plats, sedan smälta att täcka ett större område av bilden.
4. Om maskarna inte är helt täckt med fixeringsmedel, omedelbart och försiktigt lägga mer fixativ med hjälp av en mikropipett. Låt inte fixativ att strömma ut över kanten av sliden.
5. Täck skålen med ett lock och låt stå i 10 min till över natten vid rumstemperatur. Se till skålen fuktas om längre inkubationer are används - detta kan göras genom att tillsätta hopvikta våta luddfria våtservetter till skålen. Låt inte våtservetter röra bilderna.
6. Efter fixering är klar försiktigt pipet fixativ med lösa maskar i ett 1,5 ml rör och doppa sliden i en färgnings burk med PBS.
7. Centrifugera röret med maskar som lossnade vid hög hastighet under 30 sekunder för att pelletera. Skölj maskarna två gånger med PBS, sedan bearbeta parallellt med maskarna på bilderna (gör steg i mikrofugrör, snarare än på objektglas).
8. Gå vidare till steg 4 (missfärgning).

4. Antikroppsfärgning

Antikroppsfärgningsprotokollet liknar standardprotokoll för varje vävnad på diabilder. Detta protokoll är densamma för alla objektglas oberoende av preparatet i steg 1-3.

1. Förbered Antikropp Buffert genom att blanda 700 ml dubbeldestillerat vatten, 100 ml 10 x PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% slutlig), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM slutlig), 1 g BSA (0,1% slutlig), 5 ml 10% natrium-azide-lösning (0,05% slutlig). pH till 7,2 med HCl, lägga dubbel destillerat vatten till 1 L, förvara vid 4 ° C.
2. Förbered Block genom beredning åsna serum med dubbeldestillerat vatten, därefter tillsätta 5 ml serum till 45 ml antikroppsbuffert (slutlig 10% serum).
3. Förbered primära och sekundära Antikroppslösningar genom utspädning av antikroppen i antikroppsbuffert plus 1% BSA. Rekommenderade späd är 1:50-1:2,000 för primära antikroppar och 1:1,000-1:5,000 för sekundära antikroppar (Cy3or OG488 konjugerade åsna antikroppar mot arter som används för att höja primär antikropp).
4. Förbered DAPI lager genom att blanda 2,5 mg / ml i dubbeldestillerat vatten, butik i 8 l alikvoter frysta vid -30 ° C. VARNING: DAPI är en giftig DNA-bindande färgämne, handskar medan vägning och dispensering in i portioner.
5. Bered 10 ml Mounting Medium genom blandning av 200 mg n-propylgallat, 0,3 ml 1 M Tris, pH 9, 2,7 ml dubbeldestillerat vatten i ett 15 ml koniskt rör. Värm vid 65 ° C under ca 10 minuter tills det är upplöst.Lägg till 7 ml glycerol och en 8 pl alikvot av DAPI och skaka väl. Fördela medel till 1,5 ml rör, linda in i folie och förvara i mörker vid 4 ° C (både luft och ljus försämra mediet - om det blir mer gul, kasta i Biohazard avfall). VARNING: n-propylgallat är en reaktiv antioxidant, handskar när vägning.
6. Överför objektglasen till en färgnings burk med Block under 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C (över natten att föredra för hård fix). Undvik att skaka för att undvika att förlora maskar.
7. Överföring glider färgning burk med primär antikropp eller placera objektglasen platta i en fuktig skål och toppa varje med 100-500 l primära antikroppen. Inkubera objektglasen över natt vid 4 ° C utan skakning.
8. Efter primär antikropp inkubation, glider överföring till färgning burk PBS.
9. Filter Block genom tratt fodrad med filterpapper och förvara vid 4 ° C, om sterila filtrerade var 1-2 veckor, kan block återanvändas för en eller flera månader. På samma sätt, filtrera och sparaprimära antikroppen vid 4 ° C för återanvändning (för upp till 10 eller fler rundor av färgning).
10. Skölj objektglasen tre gånger (~ 20 min vardera) i buffert antikropp.
11. Placera objektglasen i sekundär antikropp i en ljustät färgning behållare och inkuberas 4 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
12. Överföring glider färgning burk PBS. Filter och spara sekundär antikropp vid 4 ° C för återanvändning (för upp till 10 eller fler rundor av färgning).
13. Skölj objektglasen tre gånger (~ 20 min vardera) i buffert antikropp.
14. Överför objektglasen till PBS och lämna i PBS (minuter till över natten vid 4 ° C) tills redo att montera.
15. Arbeta snabbt på enskilda bilder, så att maskar på framsidan av bild stannar våt. Avlägsna ett objektglas från PBS, torka baksidan av bilden med en luddfri torka, och lägg på hushållspapper.
16. Placera ~ 20 l av monteringsmedium över maskar, så att det finns ungefär lika delar medel och PBS på skjut-och tilt glida försiktigt för att blanda de två lösningarna. CAUTION: Monteringsmedium är giftig.
17. Tilt glida så frostat kanten är lägre och lösningen samlar nära glasyr, sedan placera en kant av 24 x 60 mm täckglas på lösning.
18. Sänk försiktigt täckglas för att minimera luftbubblor (som ökar blekning och störa visning). Om det bildas bubblor, lyfta kanten av täckglaset långsamt, sedan relower det utan att glida täckglas över maskar.
19. Försiktigt torka av kanten av bilden utan att flytta täckglas, genom att komprimera kanterna med en luddfri torka. Den relativt torra kanten av bilden skall vara synlig över hela kanten av täckglas
20. Täta täckglas med 2-3 lager nagellack. Diabilder kan placeras i ett plant glashållare under beredning och lagring för att skydda mot ljus. När sliden är väl förseglad och torka, rengör täckglas och baksidan av bilden.
21. Väl förslutna glasen kan förvaras i mörker under dagar vid 4 ° C eller veckor vid -20 ° C. Över längre perioder, DAPI staining av DNA och de flesta gröna färgämnen (t.ex. 488 nm excitation) blekna. Täta täckglas med mer nagellack som behövs, till exempel efter att ha använt en oljeimmersionslins.

Representative Results

När maskarna är ordentligt komprimerade, knäckt, och lätt fast, kan i stort sett hela masken vara tillgänglig för antikroppsfärgning (se figur 2). Placeringen av kärnorna vilket indikeras av DAPI färgning visar vilka delar av masken är intakta När maskarna utsätts för en hårdare fixeringsmedel, såsom formaldehyd, kan morfologi masken blir förvrängd (som ses av onaturligt vågig utseende muskler i figurerna 3A-D). Ett annat vanligt problem är ojämn fixering eller penetrering av särskilda vävnader. Ett exempel på detta visas i figurerna 3E-H, där muskeln färgas endast i en del av masken, trots det faktum att närvaron av annan färgning, inklusive DNA-färgning, indikerar att åtminstone en del av kroppen var närvarande ( dvs inte bort under frys sprickbildning). Den resulterande mönstret av partiell färgning kan lätt identifieras med praktiken, så att hela FÖRDELNINGpå av färgning kan bestämmas även om någon enstaka mask visar ojämn färgning.

Vanliga problem med frys sprickbildning använda någon fixering tillstånd illustreras i den slutliga siffran (Figur 4). Det vanligaste problemet är vridning av provet på grund av den relativa rörelsen av de två bilderna under kompression. Det faktum att kroppen av masken är vriden just posterior i svalget kan ses av morfologin hos de färgade vävnader. Denna bild visar också problemet med bakgrundsfärgning, på grund av antikroppar fastnar på poly-lysin beläggning bilden. Observera dock att alla dessa bilder samlades in med diabilder som gjorts under de första antikroppsfärgningsförsök av studenter i ett cellbiologi laborationskurs. Även med praktiken kommer många enskilda maskar visar de problem som ses i figur 4. Men på någon bild, kan maskar som de sett i figurerna 2 och 3 vara stiftelserd och undersöktes.

Figur 1. Disposition av rutiner. Flödesschema som anger steg för att utföra hela fryst sprickbildning procedur. Alternativ till olika fixeringsförhållanden och antalet maskar anges.

Figur 2. Lätt fasta, väl färgade maskar cheferna två vuxna hermafroditer fast med metanol-aceton och märkta med flera antikroppar och färgämnen:. A) Primära antikroppar att chatta (kolinacetyltransferas) och Cy3-konjugerad sekundär antikropp, B) DAPI (blå DNA) , C) Oregon Grön 488-anti-GFP (grönt fluorescerande protein), D) visar överlagring (med två kolinerga markörer, Cy3-anti-chatt och Cy5-anti-VAChT (vesikulär acetylkolintransportör) visas som rött). Denna transgen stam (PS4657) uttrycker en översättning fusion mellan GFP och AJM-1, finns på faryngeala apikala korsningar. Bilderna är maximal projektioner av serie konfokala bilder, skala bar är 50 pm.

Figur 3. Formaldehyd-associerade snedvridningar. Formaldehyd fasta vuxna färgade med Cy3-falloidin (binder fintrådiga aktin), DAPI (blå DNA), och Oregon Grön 488-anti-GFP. AD) Fours bilder av kroppen bara posterior i vulva (längst till vänster) i samma nematoder, som visar ett onaturligt vågig morfologi grund av distorsion iproducerat av fixering. A) Röd-falloidin visar något oregelbunden muskel morfologi. B) Kärnor (blå) är jämnt spridda över hela masken. C) Grönt visar fördelningen av en CED-1 :: GFP-fusionsprotein i plasmamembranet av gonadal mantel cell, som drivs av den begrän-7-promotorn (stam MD701). d) visar en överlagring av dessa tre färgämnen. EH) Märkning kan variera med olika färgämnen på samma nematod. E) Phalloidin (röd) etiketter endast en del av muskeln på ena sidan av masken. F) Nuclei (blå) är närvarande i hela masken (även färgas med ojämn intensitet). G) Den OG488-anti-GFP-etiketter kollagen-19 :: GFP i nagelband på en sida av den mask som saknar färgning av mer central muskelvävnad, vilket tyder på att muskeln är närvarande men inte färgning på en yta. H) Visar en överlagring av de tre färgämnena. Bilderna är maximal projektioner av serie konfokala bilder, skal barer är 50 pm.

Figur 4. Compression-associerade snedvridningar. Formaldehyd fast larv färgas med A) Cy3-phalloidin (binder fintrådiga aktin), B) DAPI (blå DNA), C) Oregon-Grön 488-anti-GFP, D) overlay. Den twist i kroppen bara bakre delen av svalget är uppenbart, eftersom den gröna utsöndringscellen och ventrala nerv sladd kors över resten av kroppen. Hög bakgrundsfärgning framgår också med Cy3-phallodin. Denna stam uttrycker en VHA-8 :: GFP-fusionsprotein, som ligger främst i utsöndrings cellen. Bilderna är maximal projektioner av serie konfokala bilder som utökade till ytan av bilden (som leder till hög bakgrundsfärgning), skala bar är 50 pm.

Discussion

Den fryst sprickbildning protokollet är en av flera metoder för antikroppsfärgning i C. elegans. Det ger ett relativt enkelt sätt att färga maskar, men kräver specifika reagenser och träna för bästa resultat. Kritiska steg (som beskrivs i figur 1) är: 1) glaspreparering (se steg 1 och 2) manuell kompression av nematoder (se steg 2 och 3) snabb fixering (se steg 3). Först, för att maximera vidhäftningen av nematoderna till bilderna, är det bäst att förbereda bilder med hög molekylvikt (lång polymer) polylysin, i stället för att förlita sig på kommersiellt beredd diabilder. Kommersiella diabilder är belagda med polylysin att låta celler att hålla sig, medan fryst sprickbildning diabilder är utformade för att hålla sig till nagelbanden av hela nematoder. För det andra, är det förfarande för korrekt komprimering av maskarna mellan glasen före frysning kritisk. Det kräver stadiga händer och praxis för att trycka bilderna tillsammans med rätt mängdtryck så att enskilda maskar kontakt med båda glider utan att förstöra deras morfologi. Antingen för mycket eller för lite kompression leder till en ökad förlust av maskar under fixering. Det behövs ytterligare omsorg för att flytta sliderna på torris kyld yta för frysning utan att flytta sliderna i förhållande till varandra. Varje sådan rörelse kommer att orsaka maskarna att riva eller vrida. För det tredje, som med alla bindningsteknik, de frusna maskar bör placeras direkt i fixativ innan upptining. Annars kan antigen diffusa, att lämna vilseledande information om subcellulär lokalisering. Om dessa kritiska steg är alla gjort på rätt sätt, är det för bästa resultat fortfarande nödvändigt att skanna flera färgade diabilder för att hitta maskar med bästa morfologi.

En oundviklig aspekt av denna teknik är att maskarna kommer att komprimeras i en dimension. Kompressionen är mest märkbar i vuxna där den skenbara diametern för den runda kroppen i z-axeln kan vara endast 1-4e som ses i x-och y-axlarna. Denna kompression tenderar att minska i mindre larver, och kan vara försumbar i embryon. På grund av det sätt de levande nematoder rör sig under glaspreparering, de färgade maskar är ofta på deras sidor. Detta efterliknar orienteringen av maskar på agar rätter, med den laterala mittlinjen liggande sträcker sig ned i mitten av den färgade mask (se figurerna 2-4). Sålunda är komprimering i allmänhet i tvärgående dimension. Även om detta faktiskt gör standard fluorescensmikroskopi lättare (mer av provet kommer att vara i fokus samtidigt), betyder det att 3-D rekonstruktioner inte kommer att vara korrekt.

Som med alla antikroppar färgning, är det viktigt att kontrollera specificiteten av bindning. I de flesta arter, görs detta genom kontroller såsom affinitet tömma din antikropp eller med hjälp av någon primär. I C. elegans, mer specifika medel för kontroll av specificitet är ofta tillgängliga. Null-mutanter för genen och proteinet av intresse tillhandahållaen utmärkt kontroll för färgning specificitet. Båda stammarna bör fastställas under identiska förhållanden före jämförelse, eftersom färgning är oftast fixering beroende. Om ingen null mutant är tillgänglig, då är det relativt lätt i C. elegans för att minska proteinnivåer med RNAi (RNA-hämning ¹²⁾ och leta efter minskad färgning i RNAi behandlade maskar.

Polyklonala antikroppar ofta visar icke-specifik färgning, även om affinitetsrenat med antigenet. Ofta lätt fixering med hjälp av metanol och aceton (som fixar proteiner genom att fälla dem i stället för att tvärbinda dem) ger lägre ospecifik färgning än formaldehyd eller glutaraldehyd (som genererar fler variant epitoper på grund av varierande tvärbindning) ^1,11. Men i C. elegans ospecifik färgning är mycket vanligt under någon fixering tillstånd, speciellt i tarmen. Om antigenet uttrycks i tarmen, då denna icke-specifik färgning kan dölja din specifika staining. Om null mutanter är tillgängliga för ditt protein, då maskar fast med denna metod kan användas för att affinitets tömma din serum. Eftersom antigenicitet beror på fixeringsförhållanden, bör de maskar som du använder för att tömma din antikropp framställas på samma sätt som de vildtyp maskar du färgning. Efter en runda av förbrukning av icke-specifik färgning, mutant och vildtyp maskar kan färgas parallellt med utarmat serum för en utmärkt kontroll. Ytterligare omgången av utarmning med mutanter kan göras vid behov.

Denna teknik är mycket användbar för att testa nya antikroppar för specifik färgning under en mängd olika förhållanden. Dessa kan vara antikroppar genererade mot C. elegans proteiner eller antikroppar genererade mot konserverade proteiner från andra arter. Även om denna metod ger den bästa morfologi med lätt fasta nematoder, är det relativt enkelt att prova en rad olika fixativ för att avgöra vilka villkor, om någon, ger specifika resultater. Till skillnad från andra metoder för hård fixering med hjälp av formaldehyd eller glutaraldehyd, enzymatiska eller minska behandlingar behövs inte för provberedning. Eftersom dessa behandlingar kan minska antigenicitet, ökar det möjligheten att identifiera specifika antikroppar och deras optimala fixeringsförhållanden. Om hårda fixeringsförhållanden fungerar bäst, kan försöksledaren sedan vända sig till metoder som utförs på intakta maskar för att få bättre morfologi (sammanfattade i vårt tidigare arbete ^4). Om ljus fixering bevarar antigenitet, då denna teknik kan användas för all vidare färgning för ljusmikroskop.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable