Antistoffarvning i Published: October 14, 2013 doi: 10.3791/50664

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Janet S. Duerr¹

¹Department of Biological Sciences, Ohio University

Summary

"Freeze-cracking", en metode til at afsløre de indre væv af rundorm C. elegans til antistoffer til protein lokalisering, demonstreres.

Abstract

At farve C. elegans med antistoffer, skal den relativt uigennemtrængelige neglebånd blive omgået ved kemiske eller mekaniske metoder. "Freeze-cracking" er en metode, der anvendes til fysisk at trække neglebånd fra nematoder ved at komprimere nematoder mellem to vedhængende dias, frysning dem, og trække dias fra hinanden. Fryse-krakning giver en enkel og hurtig måde at få adgang til vævet uden kemisk behandling og kan anvendes med en række af fikseringsmidler. Men det fører til tab af mange af de prøver og den nødvendige kompression mekanisk fordrejer prøven. Praksis er nødvendig for at maksimere genvinding af prøver med god morfologi. Fryse-revnedannelse kan optimeres til specifikke fikseringen forhold, genvinding af prøver eller lav ikke-specifik farvning, men ikke for alle parametre på en gang. For antistoffer, der kræver meget hårde fikseringen forhold og tolerere de kemiske behandlinger er nødvendige for at kemisk permeabilisere neglebånd, behandlit intakte nematoder i opløsning kan være foretrukket. Hvis antistoffet kræver en lysere fix eller hvis de optimale fikseringen betingelser er ukendt, fryse-krakning giver en meget nyttig måde til hurtigt at analysere antistoffet og kan give specifikke subcellulære og cellulære lokalisering information for antigenet af interesse.

Introduction

For at bestemme den cellulære og subcellulære lokalisering af proteiner, har forskerne traditionelt mærkede væv med antistoffer udvalgt til specifikt at genkende bestemte proteiner ^1. I nogle modelorganismer såsom C. elegans har antistoffarvning ofte blevet erstattet af molekylærgenetiske teknikker, der giver resultater hurtigere. Heriblandt transformerende organismer med konstruktioner der består af genfusioner mellem promotoren og kodende regioner af genet af interesse og grønt fluorescerende protein. Men molekylære teknikker er underlagt en række af artefakter, herunder problemer med at kende den sande promotor og ændringer i ekspression af konstruktioner ved høje kopital (de sædvanlige teknikker i C. elegans) ^2,3. Derfor farvning med antistoffer er fortsat et mål for mange forskere studerer protein funktion in vivo.

Farvning væv med antistoffer kan være vanskelig, idet entibodies kan kun anerkende deres antigen i en bestemt kropsbygning ^1. For eksempel kan antistoffer genkender kun denatureres eller intakt antigen fast på en bestemt måde, og kan ikke genkende antigenet in situ. Problemet med antistoffarvning i nematoder forværres af det faktum, at cuticula nematoden danner en relativt uigennemtrængelig barriere, blokerer adgangen af ​​antistoffer til væv.

Der er flere forskellige metoder til antistoffarvning i C. elegans (revideret i vores tidligere arbejde ^4). At plette intakte 'orme' blev metoder udviklet til at fryse og tø i en forholdsvis hård fiksativ (formaldehyd eller glutaraldehyd), de fryse-tø cykler med til at knække neglebånd at tillade hurtig penetration af fiksativet ^5.. Efter fiksering blev kutikula permeabiliseret til at tillade indtrængning af antistoffet, metoder indgår behandling med reduktionsmidler, collagenase eller begge ^5-7. Disse treatments bevarede morfologi, men ofte nedsat eller ødelagt antistof anerkendelse. Alternative fremgangsmåder indbefatter dissektion ⁸ for at tillade antistof penetration.

"Freeze-krakning" er en måde at få adgang til det indre af den semi-intakte orm at tillade antistof farvning ^9-10. Fryse-revnedannelse kan udføres med en bred vifte af fikseringen betingelser samtidig undgå collagenase og reduktion behandlinger. Nematoderne placeret mellem to klæbende slides, frosset, og derefter glider adskilles, således at de fleste af nematoden på bunden slide og meget af kutikula på tværslæde. Den nederste side kan være placeret i fiksativ og hele objektglasset med adhærerede nematoder overføres gennem antistoffarvning procedure. Metoden gør nuværende to store vanskeligheder. Det første er det vanskeligt at anvende den korrekte mængde pres nødvendigt at opdele de nematoder uden alvorligt at deformere dem. For det andet er mange af de orme vil ikke skryds til enten dias, og vil blive tabt i fiksativ eller skylninger. Men med den korrekte dias og praksis er det vil hurtigt give nematoder med rimelig morfologi, som kan anvendes med en bred vifte af fikseringsmidler og antistoffer.

Fremgangsmåden kan varieres en smule, afhængigt af mål eksperimentatoren. Hvis der ønskes farvning af enkelte nematoder (fx til at afgøre, om en enkelt transformant har ændret antistoffarvning), og derefter glider med maksimal friktion (men højere baggrundsfarvning) kan anvendes, såsom laboratorie-forberedt dias med ekstra polylysin (se nedenfor). For formaldehyd eller glutaraldehyd fiksering, bør anvendes højere vedhæftning slides (laboratorie-forberedt polylysin slides), da nematoder holde mere dårligt på polylysin efter disse optagelser. Hvis vildtype-nematoder fastsættes med methanol og / eller acetone, så glider med lavere vedhæftning og lavere baggrundsfarvning bør anvendes (kommerciel eller laboratory forberedte slides). Hvis en række antistoffer og fikseringsmidler bliver brugt i laboratoriet, kan et udvalg af objektglas fremstilles i forvejen og opbevares indtil brug.

Efter adgang til nematode væv er opnået, antistof farvningsprocedurer følge standardmetoder (med længere inkubationer karakteristiske af væv snarere end celler ^1,11).

Protocol

BEMÆRK: Flere protokoltrin er præsenteret med muligheder for opsætning og forberedelse, afhængigt af de særlige betingelser for eksperimentet. For disse tilfælde er alternative skridt præsenteret som A, B, C, osv. protokol med alternative trin er skitseret i figur 1.

1.. Udarbejdelse af Polylysin Coated Slides

Tre forskellige typer af dias kan anvendes afhængigt af den ønskede afvejning mellem let fremstilling, relative adhæsion og ikke-specifik binding af antistoffet. Nærmere oplysninger om slide forberedelse alternativer er givet nedenfor i trin 1A-1C efter stigende vedhæftning og kompleksitet. Slides fremstillet ved disse forskellige fremgangsmåder kan anvendes sammen til et enkelt eksperiment.

1A. Ingen slide forberedelse

Kommercielt tilgængelige polylysin coatede objektglas giver lav friktion og lav baggrund.

1B. Slide PReparation optimale for methanol-acetone fiksering

Mellem vedhæftning og lav baggrund.

1. Forbered en polylysin løsning til at dyppe dias: Tilføj 400 mg meget høj molekylvægt (150.000 - 300.000 D) poly-L-lysin til 200 ml dobbeltdestilleret vand. Der tilsættes 2 ml 10% natriumazid lager (slutkoncentration 0,1%) som konserveringsmiddel. ADVARSEL: tør natriumazid er reaktiv og alle former er giftige. Bær maske og handsker mens vejer pulver til at gøre 10% lager i dobbelt destilleret vand.
2. Tør enkelt ende matteret objektglas med fnugfri klude, fjerne snavs og partikler. Dette bør ske, selv på dias købt med betegnelsen "precleaned".
3. Sted glider back-to-back i et dias holder, Coplin krukke eller anden slide farvning container, holder matteret kanter op og ikke helt perfekt afstemt (at gøre senere adskillelse lettere). Placer skive holder i bæger med 70% ethanol (reagensrenhed alkohol ikke nødvendigt) med 1% HCI i distilnede vand eller fyld farvning krukke til niveau af frosting. Rock objektglassene i opløsning i mindst 5 minutter. ADVARSEL: Denne løsning er ætsende, brug handsker. BEMÆRK: Denne løsning kan genbruges flere gange (op til flere måneder).
4. Skyl objektglassene i rindende destilleret vand i 1 min.
5. Dry slides helt i et støvfrit miljø enten ved anbringelse i en 40-60 ° C varm ovn i 30-60 min, eller ved at holde natten over ved stuetemperatur.
6. Inkuber slides i polylysin løsning (der dækker unfrosted dele) på rocker i 15 min.
7. Gentag tørring af dias.
8. Gentag polylysin opløsning inkubation og tørring trin.
9. Adskil dias ved hjælp af en slank metalgenstand, såsom en tynd vejer spatel. Hvis de er korrekt overholdt, er de svære at adskille. Bær passende sikkerhed gear (sikkerhedsbriller) og arbejde på bænk top papir (kasseres efter brug), da små stumper af glas kan flyve løs, når dias er adskilt.
10. Store dias i ren(Støvfri) slide boks ved 4 ° C indtil brug.

1C. Skub forberedelse optimal for formaldehyd fiksering

Højeste vedhæftning men høj baggrund.

1. Anbring objektglassene tilberedt med metode 1B lejlighed i et støvfrit, ovn-safe fad (til tørring i ovn) eller på en flad støvfri overflade (for lufttørring).
2. Placer en 20-60 ul dråbe af polylysin løsning på midten af ​​hvert dias.
3. Dry slides helt i ovn eller ved stuetemperatur. Den polylysin vil efterlade blege ovaler som det fordamper. Disse ovaler er meget klæbende. Desværre er de også binder til de primære og sekundære antistoffer, selv efter blokering.
4. Store dias i ren (støvfri) slide kasse ved 4 ° C indtil brug.

2. Udarbejdelse af Frozen Nematode Slides

Forbered nematoder for farvning ved fuldstændig skylning fri for bakterier ved metode 2A (for plader af nematoder) eller2B (for individuelle nematoder).

2A. Forberedelse af lysbilleder fra plader af nematoder

1. Placer et fladt stykke metal på tøris til prechill.
2. Brug destilleret vand og et glas pipette (nedsætter tab af orme), eller mikropipette at skylle orme fra NGM plade med bakterier i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Pladerne kan synkroniseres eller blandet aldre, ikke bruger plader med mange dauers (svære at knække) eller sultet orme (øget autofluorescens), medmindre det er nødvendigt.
3. Skyl orme 3-4x med destilleret vand, indtil fri af bakterier. (For at mindske tabet af orme bruge den samme glas pipette.) For at pelletere orme, enten lade dem sidde på bænken i 3-5 min (for at samle oftest voksne i bunden af ​​røret) eller spin 30 sek ved ~ 1000 rpm (~ 500 g) i en bordplade centrifuge (til at indsamle voksne, larve, og embryoner).
4. Fjern det meste af vand fra rør med orme, der forlader omkring det dobbelte volumen af ​​vand som orme (men mindst 25 ul samlede mængde).
5. Har et lige antal af regelmæssige (visket ren, men ikke polylysin behandlet) "top" slides til rådighed.
6. Place ~ 25 orme ul i vand på "bunden" klæbende slide og sprede væsken indeholdende orme over den midterste del af slæden ved hjælp af siden af ​​pipettespidsen.
7. Lad orme nøjes med 30 sek til 2 min. Hvis slæden er passende klæbrig, vil enderne af orme stick, som de kontakter diaset.
8. Hold bunden slide i den ene hånd og placer den øverste dias over bunden dias, så alle, men de frosne områder overlapper hinanden. Væsken bør holde dias lidt fra hinanden, så ormene stadig bevæge sig en anelse Lad ikke slides glide over hinanden -. Dette vrider ormene.
9. Tryk forsigtigt lige ned slet på den øverste dias, ved hjælp af tommelfingre og pegefingre på hver hånd. Med den ideelle mængde pres, vil et par af de største hermafroditter på kanten af ​​dias briste, mens de fleste af de voksne og larver vil kontakte de enkelte dias, men vil forblive intakt.
10. Straks og omhyggeligt (uden at glide) sætte dias på det stykke metal på tøris. De slides skal vises nedfryses inden for et minut. Hold på tøris i 5 min indtil grundigt frosset.
11. På dette tidspunkt, kan objektglassene opbevares i en mærket kasse ved -80 ° C i flere dage. (Hvis de holdes uger ved -80 ° C, vil vandet begynde at sublimere væk og orme vil ikke pletter så godt). Hvis objektglassene opbevares ved -80 ° C, lad dem 'varme op' på tøris i 10 min før revnedannelse.
12. Fortsæt til trin 3 (fiksering).

2B. Udarbejdelse af præsentationer af de enkelte nematoder

1. Placer et fladt stykke metal på tøris til Præcbakke.
2. Brug en orm pick at overføre individuelle nematoder til en dråbe vand på en NGM plade til at befri dem fra bakterier. Nematode (er) skal være velnærede at falde autofluorescens, hvis muligt. Gentag overførsel til nye pletter af vand efter behov, indtil orm (e) er fri for bakterier.
3. Mærk frosted side af "bunden" polylysin lysbilleder med uudsletteligt blæk og sted glider på tælleren ved siden af ​​beholderen med tøris, etiketten opad. Har et tilsvarende antal mindre klæbende "top" (ubehandlede) præparater til rådighed.
4. Placer en 5-10 pi dråbe vand på det område af bunden slide dobbelt-behandlet med polylysin. Brug større volumen, hvis overføre flere orme, for at forhindre vandet i at fordampe før afslutning.
5. Overfør ormen (e) til dråbe vand med ormen pick, ved hjælp af mikroskop til at se som orme synke ned at røre klæbrig slide overflade. Overfør så få som en orm til så mange som 20 + orme pr dråbe.
6. Hold bunden sLiDE i den ene hånd og placer den øverste dias over bunden dias, så alle, men de frosne områder overlapper hinanden.
7. Straks og omhyggeligt (uden at glide eller komprimere) sætte dias på det stykke metal på tøris. Hold på tøris i 5-30 min. (Må ikke gemme disse slides lang sigt, da de glider let tørre ud.)
8. Fortsæt til trin 3 (fiksering).

3. Fiksering

Fiksativer er nødvendige for at "fix" antigenet på plads i cellen, enten ved fældningen ("light fiksering"), eller cross-linking ("hård fiksering") antigenet. Fiksering kan forstyrre antigenicitet, mest kendte antistoffer fungerer bedst med en bestemt fiksering tilstand. For nye antistoffer, bør en række fikseringen betingelser skal testes.

For enhver fiksering, det første skridt er at gøre phosphatpufret saltopløsning. Næste fix dias med nematoder til antistoffarvning med metode A (lysløse ved hjælp af methanol og acetone) eller B (hårdere fix anvendelse af formaldehyd eller glutaraldehyd).

1. Forbered en steril 10x PBS (phosphatpufret saltvand) stamopløsning ved at tilsætte 80 g NaCl, 2,0 g KCI, 27,2 g Na ₂ HPO ₄ • H ₂ 0, 2,4 g KH ₂ PO _4, 20 ml 10% natriumazid lager. For at gøre denne stamopløsning afvejes natriumazid pulver til at gøre 10% opløsning i dobbelt destilleret vand. Rør saltvand med blid varme, indtil opløst. ADVARSEL: tør natriumazid er reaktiv og alle former er giftige. Bær maske og handsker, når der arbejdes med tørre natriumazid eller løsninger.
2. Lad saltvand cool (Tris pH er temperaturfølsom), så pH til 7,2 med 1-10 M NaOH. Top til 1 L med dobbelt destilleret vand og autoklave til at sterilisere. Opbevares ved stuetemperatur og fortyndes til 1x efter behov med sterilt dobbelt destilleret vand. ADVARSEL: NaOH er ætsende - bære handsker under brug.

3A. Lys fix anvendelse af methanol-acetone

1. Sæt 100% methanol, 100% acetone og 1x phosphatpufret saltvand (PBS) i farveskålene på is for at prechill mindst 10 minutter. ADVARSEL: Methanol og acetone er giftige, bære handsker.
2. Tag et par bund og top slides fra tøris, hurtigt vride dem fra hinanden, og straks fordybe "bunden" slide i iskold methanol i 2 min. Den "top" slide kan kasseres.
3. Overfør dias fra methanol til iskold acetone i 4 min. Hvis objektglassene havde mange orme, vil de fleste (90%) falder i fix, selv med de bedst forberedte dias. Hvis en enkelt orm slides var ordentligt forberedt, bør orme forblive klæbet.
4. Placer eller dyppe dias i krukken med PBS (at skylle fiksativ) og fortsæt til trin 4 (farvning).

3B. Hård fix hjælp formaldehyd eller glutaraldehyd

1. Reagenskvalitet formaldehyd eller glutaraldehyd fortyndes i 1x PBS til 0,5-4% slutkoncentration. Portioner (1,5 ml) may opbevares tæt lukket ved -20 til -30 ° C, optøs aliquoter på is lige før brug. BEMÆRK: formaldehydopløsninger nedbrydes over tid og udsættelse for luft. ADVARSEL: formaldehyd og glutaraldehyd er giftige, bære handsker og arbejde i hætten.
2. Tag et par bund og top slides fra tøris, hurtigt vride dem fra hinanden, og straks placere "bunden" slide med orm i det flade fad med låg. (Den øverste dias kan kasseres).
3. Umiddelbart pipettere 200 pi toksisk fiksativ over midten af ​​det område af objektglasset med orme. Fiksativet vil delvist fryse på plads, så smelter for at dække et større område af diaset.
4. Hvis ormene ikke helt dækket med fiksativ, straks og omhyggeligt tilføje mere fiksativ ved hjælp af en mikropipette. Lad ikke fiksativ til at flyde over kanten af ​​diaset.
5. Dæk fadet med et låg og lad for 10 minutter til natten over ved stuetemperatur. Vær sikker på parabol er befugtet hvis længere inkubationer are anvendes - dette kan gøres ved at tilføje foldede våde fnugfri klude til fadet. Lad ikke klude røre dias.
6. Efter fiksering er færdig, omhyggeligt pipette fiksativet med løse orme ind i et 1,5 ml rør og dyppe dias i en farvning krukke med PBS.
7. Spin rør med orme, der fulgte løs ved høj hastighed i 30 sek til pellet. Skyl orme to gange med PBS, så behandle parallelt med orme på dias (gør trin i mikrocentrifugerør, snarere end på dias).
8. Fortsæt til trin 4 (farvning).

4.. Antistoffarvning

Antistoffet farvningsprotokol svarer til standardprotokoller til ethvert væv på objektglas. Denne protokol er den samme for alle objektglas uafhængigt af præparatet i trin 1-3.

1. Forbered antistofbuffer ved at blande 700 ml dobbelt destilleret vand, 100 ml 10x PBS, 5 ml Triton X-100 (0,5% endelig), 2 ml 0,5 M EDTA pH 8 (1 mM endelig), 1 g BSA (0,1% endelig) 5 ml 10% natrium-azide opløsning (0,05% endelig). pH til 7,2 med HCI, hvorefter der tilsættes dobbelt destilleret vand til 1 L, skal opbevares ved 4 ° C.
2. Forbered Block ved rekonstituering æsel serum med dobbelt destilleret vand, derefter tilsætning af 5 ml serum til 45 ml antistofbuffer (endelig 10% serum).
3. Forbered primære og sekundære antistofopløsninger ved at fortynde antistof i antistofbuffer plus 1% BSA. Anbefalede fortynding 1:50-1:2,000 for primære antistoffer og 1:1,000-1:5,000 for sekundære antistoffer (Cy3or OG488 konjugerede æsel antistoffer mod arter, der anvendes til at hæve primære antistof).
4. Forbered DAPI lager ved at blande 2,5 mg / ml i dobbelt destilleret vand, butik i 8 gl portioner nedfrosset ved -30 ° C. ADVARSEL: DAPI er et giftigt DNA-bindende farvestof, bære handsker mens vejning og dispensering i portioner.
5. Forbered 10 ml Mounting Medium ved blanding af 200 mg n-propylgallat, 0,3 ml 1 M Tris, pH 9, 2,7 ml dobbelt destilleret vand i et 15 ml konisk rør. Opvarm til 65 ° C i omkring 10 min, indtil opløst.Tilføj 7 ml glycerol og en 8 pi portion af DAPI og vortex godt. Alikvot medium i 1,5 ml rør, wrap i folie og opbevares i mørke ved 4 ° C (både luft og lys forringe mediet - hvis det bliver mere gul, kasseres i Biohazard affald). ADVARSEL: n-propylgallat er en reaktiv antioxidant bære handsker mens vejer.
6. Overfør dias til en farvning krukke med Blok til 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C (natten foretrække for hård fix). Undgå at ryste for at undgå at miste orme.
7. Overførsel glider farvning krukke med primær antistof eller placere dias flade i en befugtet fad og top hver med 100-500 ul primære antistof. Inkuber slides natten over ved 4 ° C uden omrystning.
8. Efter den primære antistof inkubation, overførsel glider farvning krukke med PBS.
9. Filter Block gennem tragt foret med filtrerpapir og opbevar ved 4 ° C, hvis sterilfiltreret hver 1-2 uger, kan Block genbruges til 1 eller flere måneder. Ligeledes filtrere og gemprimære antistof ved 4 ° C til genanvendelse (i op til 10 eller flere runder af farvning).
10. Skyl objektglassene tre gange (~ 20 min hver) i antistof-buffer.
11. Anbring objektglassene i sekundært antistof i en lystæt farvning beholder og inkuberes 4 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
12. Overførsel slides til farvning krukke med PBS. Filter og gemme sekundært antistof ved 4 ° C til genbrug (i op til 10 eller flere runder af farvning).
13. Skyl objektglassene tre gange (~ 20 min hver) i antistof-buffer.
14. Overførsel glider til PBS og efterlade i PBS (minutter til natten over ved 4 ° C), indtil den er klar til at montere.
15. Arbejd hurtigt på de enkelte dias, så orme på forsiden af ​​dias forblive våd. Fjern en dias fra PBS, tørre bagsiden af ​​slæden med en fnugfri tørre, og læg dem på køkkenrulle.
16. Place ~ 20 ul montering medium i løbet af orme, så der er omtrent lige store dele mellemstore og PBS på rutsjebane og tilt slide forsigtigt for at blande de to løsninger. CautION: Montering medium er giftigt.
17. Tilt slide så matteret kant er lavere og løsning samler nær frosting, og derefter placere den ene kant af 24 x 60 mm dækglas på løsningen.
18. Sænk forsigtigt dækglasset for at minimere luftbobler (som øger blegning og forstyrrer visning). Dannes der bobler, løfte kanten af dækglasset langsomt, så relower det uden at glide dækglasset på tværs af orme.
19. Tørre forsigtigt kanten af ​​dias uden at flytte dækglasset, ved at komprimere kanterne med en fnugfri klud. Den relativt tørre kant af dias skal være synlig hele vejen rundt i kanten af ​​dækglasset
20. Forsegl dækglasset med 2-3 lag neglelak. Slides kan placeres i en flad diasholder under tilberedning og opbevaring for at beskytte mod lys. Når slæden er godt forseglet og tørt, rent dækglasset og bagsiden af ​​dias.
21. Godt forseglet slides kan holdes i mørke i dage ved 4 ° C eller uger ved -20 ° C. Over længere perioder, DAPI stalingen af DNA, og de ​​fleste grønne farvestoffer (fx 488 nm excitation) fade. Ompakning dækglasset med mere neglelak efter behov, fx efter at bruge olie nedsænkning linse.

Representative Results

Når orme er korrekt komprimerede, revnet, og let fast, kan næsten hele ormen være tilgængelig for antistof-farvning (se figur 2). Placeringen af ​​kerner som angivet ved DAPI-farvning viser, hvilke dele af ormen er intakte, når ormene udsættes for en hårdere fiksativ, såsom formaldehyd, kan morfologi ormen blive forvrænget (set fra unaturligt bølget udseende muskler i 3A-D). Et andet fælles problem er ujævn fiksering eller indtrængen af ​​bestemte væv. Et eksempel på dette er vist i figurerne 3E-H, hvor musklen kun farves i en del af ormen, trods det faktum, at tilstedeværelsen af andre farvning, herunder DNA-farvning viser, at mindst en del af kroppen var til stede ( dvs. ikke fjernet under fryse-krakning). Det resulterende mønster af delvis farvning let kan identificeres med praksis, således at hele DISTRIBUTIpå af farvning kan bestemmes, selv om en enkelt orm viser ujævn farvning.

Almindelige problemer med fryse-revner ved hjælp af en fiksering tilstand er illustreret i det endelige tal (Figur 4). Det mest almindelige problem er vridning af prøven som følge af relativ bevægelse af de to objektglas under kompression. Den omstændighed, at kroppen af ​​ormen er snoet lige posterior i svælget kan ses ved morfologi af de farvede væv. Dette billede viser også problemet med baggrundsfarvning grund af antistof klæber til poly-lysin belægning slide. Bemærk dog, at alle disse billeder blev indsamlet ved hjælp af dias foretaget i løbet af de første antistoffarvning forsøg på bachelorer i en celle biologi laboratorium kursus. Selv med praksis vil mange individuelle orme viser de problemer, der ses i fig. 4. Men på en enkelt dias, kan orme som dem, der ses i figur 2 og 3 være grundvolded og undersøgt.

Figur 1. Flow Disposition af procedurerne. Diagram angiver trin for at udføre den komplette fryse-revner procedure. Alternativer til varierede fikseringen forhold og antallet af orme er angivet.

Figur 2. Let faste, godt-farvede orme Lederne af to voksne hermafroditter fikseret med methanol-acetone og er mærket med flere antistoffer og farvestoffer:. A) Primært antistof til at chatte (cholinacetyltransferase) og Cy3-konjugeret sekundært antistof, B) DAPI (blå DNA) , C) Oregon Grøn 488-anti-GFP (grønt fluorescerende protein), D) viser overlay (med to cholinerge markører, Cy3-anti-chat og Cy5-anti-VAChT (vesikulær acetylcholin transporter) vist som rød). Denne transgene stamme (PS4657) udtrykker en oversættelse fusion mellem GFP og AJM-1, findes på svælg apikale vejkryds. Billederne er maksimal fremskrivninger af serie af konfokal billeder; Målestokken er 50 um.

Figur 3. Formaldehyd-associeret forvridninger. Formaldehyd faste voksne farvet med Cy3-phalloidin (binder filamentøse actin), DAPI (blå DNA), og Oregon Green 488-anti-GFP. AD) Fours billeder af kroppen lige posterior af vulva (længst til venstre) i samme rundorm, viser en unaturligt bølget morfologi grundet forvrængning ireduceret ved fiksering. A) Rød-phalloidin viser lidt uregelmæssig muskel morfologi. B) Kerner (blå) er jævnt fordelt over hele ormen. C) Grøn viser fordelingen af et CED-1 :: GFP fusionsprotein i plasmamembranen af gonade kappe celle, drevet af begræn-7-promotoren (stamme MD701). D) Viser overlejring af disse tre farvestoffer. EH) Mærkning kan variere med forskellige farvestoffer på samme nematoden. E) phalloidin (rød) etiketter kun en del af musklen på den ene side af ormen. F) Kerner (blå) er til stede i hele ormen (selv farves med ujævn intensitet). G) Den OG488-anti-GFP etiketter collagen-19 :: GFP i overhuden på en side af ormen, som mangler farvning af de mere centrale muskelvæv, hvilket indikerer, at musklen er til stede, men ikke farvning på en overflade. H) Viser overlejring af de tre farvestoffer. Billederne er maximal fremskrivninger af serie af konfokal billeder; skala barer er 50 um.

Figur 4.. Compression-associerede fordrejninger. Formaldehyd fast larve farves med A) Cy3-phalloidin (binder trådformede actin), B) DAPI (blå DNA), C) Oregon-Grøn 488-anti-GFP, D) overlay. Snoningen i kroppen lige posterior i svælget er tilsyneladende, da den grønne udskillelsesvej celle og ventrale nerve ledning tværs over resten af ​​kroppen. Høj baggrundsfarvning fremgår også med Cy3-phallodin. Denne stamme udtrykker et VHA-8 :: GFP fusionsprotein, ligger overvejende ekskretionsorganerne celle. Billederne er maksimal fremskrivninger af serie af konfokal billeder, der udvides til overfladen af ​​dias (der fører til høj baggrundsfarvning) Målestokken er 50 um.

Discussion

Fryse-krakning protokol er en af flere metoder til antistoffarvning i C. elegans. Det giver en forholdsvis enkel måde at plette orme, men kræver specifikke reagenser og praksis for optimale resultater. Kritiske trin (beskrevet i figur 1) omfatter: 1) præparatglaspræpareringsprotokol (se trin 1 og 2) manuel kompression af nematoder (se trin 2 og 3) hurtig fiksering (se trin 3). Først, for at maksimere vedhæftningen af ​​nematoder til dias, er det bedst at forberede dias med høj molekylvægt (lang polymer) polylysin, i stedet for at stole på kommercielt tilberedt dias. Kommercielle dias er belagt med polylysin at tillade celler til at overholde, mens fryse-krakning dias er designet til at holde sig til hårstrået i hele nematoder. For det andet, at proceduren for den korrekte komprimering af ormene mellem dias før frysning er kritisk. Det kræver konstant hænder og praksis at presse dias sammen ved hjælp af den korrekte mængdetryk, således at de enkelte orme kontakte begge slæder uden at ødelægge deres morfologi. Enten for meget eller for lidt komprimering fører til øget tab af orme under fiksering. Er behov for yderligere behandling for at flytte objektglassene på tøris kølet overflade til frysning uden at flytte objektglassene i forhold til hinanden. Enhver sådan bevægelse vil få orme til at rive eller sno. For det tredje, som med enhver fiksering teknik, de frosne orm bør placeres direkte i fiksativ før optøning. Ellers kan antigenet diffus, der giver vildledende oplysninger om subcellulære lokalisering. Hvis disse kritiske trin er alle gjort ordentligt, for de bedste resultater er det stadig nødvendigt at scanne flere farvede dias for at finde orme med det bedste morfologi.

Et uundgåeligt aspekt af denne teknik er, at ormene vil blive komprimeret i en dimension. Kompressionen er mest mærkbar i voksne, hvor den tilsyneladende diameter af rund krop i z-aksen kan være kun 1-4th, der ses i x-og y-akserne. Denne kompression tendens til at falde i mindre larver, og kan være ubetydelig i embryoner. På grund af den måde, de levende nematoder bevæger sig under præparatglaspræpareringsprotokol, de farvede orme er ofte på deres sider. Dette efterligner orienteringen af orme på agar retter med den laterale midterlinie liggende strækker sig ned i midten af det farvede ormen (se figur 2-4). Således kompressionen er generelt i den laterale dimension. Mens dette rent faktisk gør standard fluorescerende mikroskopi lettere (mere af prøven vil være i fokus på samme tid), betyder det, at 3-D rekonstruktioner ikke vil være nøjagtige.

Som med enhver antistoffarvning, er det vigtigt at kontrollere specificiteten af ​​binding. I de fleste arter, dette gøres ved kontrol såsom affinitet nedbryder din antistof eller uden brug af primære. I C. elegans, mere specifikke midler til kontrol for specificitet er ofte tilgængelige. Nulmutanter for genet og proteinet af interesse tilvejebringeen fremragende kontrol for farvning specificitet. Bør fastsættes begge stammer under identiske betingelser før sammenligning, da farvningen er normalt fiksering afhængig. Hvis der ikke nulmutant er til rådighed, så det er relativt let i C. elegans at mindske protein niveauer med RNAi (RNA hæmning ¹²⁾ og kigge efter nedsat farvning i RNAi behandlede orme.

Polyklonale antistoffer ofte vise ikke-specifik farvning, selvom affinitetsoprenset med antigenet. Ofte lys fiksering ved hjælp af methanol og acetone (som fastsætter proteiner ved udfældning dem snarere end tværbinding dem) giver lavere uspecifik farvning end formaldehyd eller glutaraldehyd (som genererer flere variant epitoper på grund af varieret krydsbinding) ^1,11. Men i C. elegans uspecifik farvning er meget almindeligt under nogen fiksering tilstand, især i tarmen. Hvis din antigenet udtrykkes i tarmen, så denne ikke-specifik farvning kan maskere din specifikke staining. Hvis nulmutanter er tilgængelige for din protein, så orme fast med denne metode kan bruges til at affinitet nedbryder din serum. Da antigenicitet afhænger fikseringen betingelser, bør de orme, som du bruger til at nedbryder din antistoffet fremstilles på samme måde som de vildtype orme du farvning. Efter en runde af udtømning af ikke-specifik farvning, mutant og vildtype-orme kan farves parallelt med udtømt serum til en fremragende kontrol. Yderligere runde af udtynding mutanter kan gøres efter behov.

Denne teknik er meget nyttig til afprøvning af nye antistoffer til specifik farvning under en række betingelser. Disse kan være antistoffer frembragt mod C. elegans proteiner eller antistoffer frembragt mod konserverede proteiner fra andre arter. Selv om denne metode giver den bedste morfologi med let faste nematoder, er det relativt simpelt at prøve en række fikseringsmidler til at bestemme hvilke betingelser eventuelt give specifik resultatsek. I modsætning til andre metoder til hårde fiksering ved hjælp af formaldehyd eller glutaraldehyd, enzymatiske eller reducere behandlinger ikke er brug for prøveforberedelse. Da disse behandlinger kan nedsætte antigenicitet, dette øger evnen til at identificere specifikke antistoffer og deres optimale fikseringen forhold. Hvis hårde fixation forhold fungerer bedst, kan forsøgslederen derefter slå metoder udført på intakte orme at opnå en bedre morfologi (opsummeret i vores tidligere arbejde ^4). Hvis lys fiksering bevarer antigenicitet, så er denne teknik kan anvendes til al videre farvning for lysmikroskopi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
poly-L-lysine slide (ESCO brand)	Fisher	12-545-78	Sigma brand slides also suitable
poly-L-lysine hydrobromide	Sigma	P1524	IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical
single frosted edge slides	Fisher	48312-002	Other brands are suitable
sodium azide	Sigma	S2002-25G	TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution
coplin staining jar	VWR	47751-792	Other brands are suitable
5-slide mailer	Electron Microscopy Science	71549-01	One of many different brands of small slide holder, suitable for staining
Paraformaldehyde	VWR	MK262159	IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Glutaraldehyde solution, 25% in water	Sigma	G 5882	IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water.
Triton X-100	VWR	EM-9410	Other brands are suitable
Bovine Serum Albumin	Fisher	ICN820451	Other brands are suitable
Donkey Serum, lyophilized	Jackson Immunoresearch	017-000-121	Other brands are suitable
Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling	Jackson Immunoresearch	715-165-150	This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody).
n-propyl gallate	Fisher	ICN10274750	Other brands are suitable
DAPI, 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Sigma	D 9542	TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure
Whatman #1 15 cm diameter filters	Fisher	09805G
Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm	VWR	48393-252	#1 1/2 thickness is optically best
Microscope slide folder	VWR	48429-092	Other brands are suitable