Kvantificering af den Respiratory burstrespons som en indikator for medfødte immunforsvar Sundhed i zebrafisk
Summary
Svaret medfødte immunforsvar beskytter organismer mod patogen infektion. En kritisk komponent af medfødte immunreaktion, fagocytten respirationsbølge genererer reaktive oxygenarter, der dræber invaderende mikroorganismer. Vi beskriver en respiratorisk burst analyse, der kvantificerer reaktive ilt arter produceret når medfødt immunrespons er kemisk induceret.
Abstract
Fagocytten respirationsbølge er en del af svaret på patogeninfektion medfødte immunsystem og indebærer fremstilling af reaktive oxygenarter (ROS). ROS er giftige og kan fungere til at dræbe fagocyteret mikroorganismer. In vivo kvantificering af fagocyt-afledte ROS giver oplysninger om en organismes evne til at montere en reaktion robust medfødte immunreaktion. Her beskriver vi en protokol til at kvantificere og sammenligne ROS i hele zebrafisk embryoner ved kemisk induktion af fagocytten respiratorisk burst. Denne metode gør brug af en ikke-fluorescerende forbindelse, der bliver fluorescerende ved oxidation af ROS. Individuelle zebrafisk embryoer pipetteres i brøndene på en mikroplade og inkuberet i dette fluorogent substrat med eller uden en kemisk inducer af den respiratorisk burst. Fluorescens i hver brønd kvantificeres ved ønskede tidspunkter ved hjælp af en mikropladelæser. Fluorescensaflæsninger justeres for at eliminere baggrundsfluorescens og derefter compared anvendelse af en uparret t-test. Denne metode giver mulighed for sammenligning af respiratorisk burst potentiale zebrafisk embryoner på forskellige udviklingsstadier, og som reaktion på eksperimentelle manipulationer såsom protein knockdown, overekspression eller behandling med farmakologiske midler. Denne metode kan også anvendes til at overvåge respirationsbølge respons i hele dissekeret nyrer eller cellepræparater fra nyrerne af voksne zebrafisk og nogle andre fiskearter. Vi mener, at den relative enkelhed og tilpasningsevne denne protokol skal supplere de eksisterende protokoller og vil være af interesse for forskere, der søger at bedre at forstå medfødt immunrespons.
Introduction
Immunsystemet består af to grene: medfødte og adaptive immunitet. Medfødte immunitet er evolutionært ældre end adaptiv immunitet. Hvirvelløse er i øjeblikket menes at have kun medfødte immunitet, mens hvirveldyr besidder både medfødte og adaptive grene. Mens adaptiv immunitet giver specifik og langvarig immunitet over for visse patogener, medfødte immunitet er en umiddelbar reaktion på invaderende bakterier, vira og svampe. Et afgørende aspekt af det medfødte immunforsvar omfatter frigivelse af cytokiner og kemokiner, hvilket resulterer i inflammation og rekruttering af fagocytter (f.eks makrofager, neutrofile) at opsluge og ødelægge udenlandske angribere.
Succesfulde medfødte immunrespons indebærer: (1) anerkendelse af invaderende mikroorganismer, (2) induktion af de relevante signalleringskaskader (fx frigivelse af cytokiner og kemokiner), (3) en ordentlig udvikling / passende antal fagocytceller, (4) Migration af fagocytter til sites med infektion, (5) engulfment af patogener, og (6) destruktion af opslugte mikroorganismer. En mangel på en hvilken som helst af disse trin kan føre til værten at blive overvældet af, og at bukke under for infektionen. Et svar robust medfødte immunforsvar er afgørende for sundheden for organismer, fordi det er den første linje i forsvaret mod patogener i alle planter og dyr. I hvirveldyr, er det også forstærker den immunrespons 1 adaptive. Derfor er det afgørende, at vi er i stand til at vurdere alle aspekter af medfødt immunrespons for bedre at kunne forstå det og optimere dens funktion.
Mange modelorganismer bruges til at undersøge medfødte immunitet, der spænder fra Arabadopsis til C. elegans til Drosophila til mus til dyrkede humane celler. En fordel ved at bruge zebrafisk (Danio rerio) modelsystem til at studere medfødte immunitet er, at zebrafisk er et hvirveldyr, med både medfødte og adaptive imFællesskab, men udviklingen af medfødte og adaptive immunitet er tidsmæssigt adskilt. Zebrafisk stole udelukkende på medfødte immunitet til beskyttelse mod infektion, indtil adaptiv immunitet bliver fuldt funktionel, hvilket sker omkring 4-6 uger efter befrugtningen 2. Ud over værktøjer til genetisk manipulation, optisk klarhed og hurtig, ekstern udvikling, medfødte immunitet som princippet form for forsvar i zebrafisk embryoner giver en forenklet model til at studere kompleksiteten i den medfødte immunrespons in vivo.
Der er udviklet flere protokoller til at vurdere forskellige facetter af det medfødte immunrespons i zebrafisk embryoner. Microarrays og RNAseq har valideret, at de cytokinprofiler fremkaldt af reaktionen zebrafisk medfødte immunsystem er på samme måde som mennesker, og har også foreslået inddragelse af uventede gener i medfødte immunitet 3,4. Gennemsigtigheden af zebrafisk embryoner og fluorescerende, transgenic stammer af patogener og zebrafisk mulighed for visualisering af dynamiske host-patogen interaktioner in vivo i realtid. Transgene zebrafisk embryoner udtrykker GFP under kontrol af neutrofil-specifik myeloperoxidase promotor 5,6 eller makrofag-specifikke MPEG1 promotor 7 har gjort det muligt at visualisere og kvantificere fagocyt migration til lokaliteter af lokaliserede infektioner 8 samt visualisere fagocytose og destruktion af fluorescensmærket patogener 8,9. Zebrafisk embryoner er også modtagelig for generation af high-throughput assays og kemiske skærme. Følgelig er for nylig blevet udviklet high-throughput metoder til transkriptom analyse efter infektion 10 og fagocytisk migration til lokaliteter af kemisk induceret skade 11.
Af de teknikker, der er anført ovenfor, kvantitativt ingen vurdere den afsluttende fase af ødelæggelse patogen af fagocytter. Denne sidste etapeindebærer en respiratorisk burst (dvs. produktion af ROS og andre giftige stoffer), som dræber opslugt patogener. Enzymet NADPH-oxidase er en væsentlig kilde af ROS i fagocyterende celler. Samling af underenhederne af NADPH-oxidase enzym resulterer i overførsel af elektroner til oxygen, genererer superoxidanioner. Gennem efterfølgende enzymatiske reaktioner, kan superoxid derefter omdannes til hydrogenperoxid og chlorundersyrling (figur 1A). Det er den respiratoriske burst af fagocytter der dræber patogener og dermed kvantificering af den respiratoriske burst potentiale zebrafisk embryoner er tegn på generelle medfødte immunforsvar. Vi udviklede en fluorescens-baserede assay at kvantificere det respiratoriske burst i grupper af individuelle zebrafisk embryoner 12. Dette assay udnytter ikke-fluorescerende, reducerede form af en kommercielt tilgængelig, celle-permeable farvestof. Dette farvestof, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA), omdannes til de fluorescerendecent forbindelse, 2 ', 7'-dichlorfluorescein (DCF), ved oxidation. De forskellige ROS genereret af fagocytten respirationsbølge kan oxidere H2DCFDA og generere fluorescens 24. Fremkomsten af fluorescens kan anvendes til at kvantificere og sammenligne respirationsbølge reaktion mellem grupper af zebrafisk. Proteinkinase C agonist phorbolmyristatacetat (PMA) anvendes til kemisk inducere NADPH-oxidase til fremstilling af ROS og dermed øge fluorescensaflæsninger (Figur 1B). Heri giver vi en detaljeret protokol af en modificeret og optimeret version af denne zebrafisk embryo respirationsbølge assay. Dette assay kan bruges til at sammenligne den respiratoriske burst mellem grupper af individuelle zebrafisk embryoner over tid og / eller som reaktion på eksperimentelle manipulationer (fx morpholino-medieret protein knockdown). Brugen af denne metode, sammen med andre zebrafisk medfødte immunitet analyser, vil give et mere fuldstændigt billede af den komplekse og kritiskemedfødt immunrespons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den primære funktion af fagocytter er at opdage, opsluge og ødelægge patogener. Evnen af fagocytter til frembringelse af en passende respiratorisk burst er kritisk for denne funktion. Således kvantificering af respirationsbølge respons er en metode til at tillade sammenligning af almindelige medfødte immunsystem sundhed og funktion mellem grupper af individer og / eller som reaktion på eksperimentelle manipulationer. Her beskriver vi en protokol til at fremkalde, kvantificere og sammenligne det respiratoris…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende tidligere og nuværende medlemmer af Kim laboratorium, Mark Nilan for zebrafisk pleje og vedligeholdelse, Dr. Robert Wheeler for nyttige diskussioner og udveksling af data, og NIH tilskud 3RO1GM087308-02S1 og 1P20RR024475-01A2 og Maine Landbrugs-og Forest Experiment Station (publikation nummer 3303) til finansiering.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
