Summary
私たちは、ステンシル印刷やフォトリソグラフィーと同様、微細パターン上に培養細胞へのメソッドを経由して微細パターンナノポーラス金薄膜の技術について報告する。また、材料及び走査型電子顕微鏡、蛍光技術を用いて培養細胞の形態を特徴づける画像解析方法が記載されている。
Abstract
数十ナノメートルのフィーチャサイズを有するナノ構造材料は、燃料電池、バイオセンサー、生体医用器具用コーティング、および薬物送達ツールを含むいくつかの技術の性能を強化している。ナノスケールの自己組織化プロセスによって生成されたナノ多孔質金（NP-Auが）、大きな実効表面積、高い導電率、および触媒活性を示す比較的新しい材料である。これらのプロパティは、NP-Auのを科学界に魅力材料を作った。 NP-Auの上のほとんどの研究は、材料の基礎科学とその触媒とセンサアプリケーションにマクロスケール標本やフォーカスを採用しています。マクロスケール標本は生物医学デバイスを含む小型化システムにおけるNP-auの可能性を制限する。これらの問題に対処するために、我々は、最初に剛性基板上に微細パターンNP-Auの薄膜を2つの異なる方法が記載されている。最初の方法は、ミリスケールNP-Auのパターンを作成するための薬用手動生産ステンシルマスクを採用していますeは、第二の方法は、パターンのサブミリスケールパターンにリフトオフフォトリソグラフィーを使用しています。 NP-Auの薄膜をスパッタ堆積プロセスによって得られ、それらはマイクロへの容易な統合することにより適した従来の微細加工技術と互換性がある。これらのシステムは高い有効表面積の恩恵、電気伝導性、そして金 - チオール系表面バイオコンジュゲーションその電気的にアドレス可能なバイオセンサーのプラットフォームが含まれています。我々は、いくつかのバイオセンサーのための重要な性能パラメータである哺乳動物細胞でNP-Auからの対話を定量化するために、細胞培養、免疫染色し、画像処理技術を説明する。ここでは、図示の技法は、様々な長さスケールでのプラットフォームやバイオセンサー、エネルギー貯蔵システム、および触媒を含む多数の用途においてNP-Auを統合を支援することを期待している。
Introduction
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Protocol
1。ナノポーラス金の作製
- ピラニア溶液中のクリーン基板
- 混合物をホットプレート上で65℃に結晶化皿および熱た100mlの硫酸（96％）を25ミリリットルの過酸化水素（30％）を追加します。注意：液体は極めて腐食性であり、慎重に取り扱わなければならない。それが爆発する可能性があるので使用済み溶液を、密封容器に保存されているべきではありません。
- 混合耐酸性ピンセットを用いて、10分間のためにそれらをきれいに3インチ顕微鏡スライドによって場所の1インチ。小さなカバースリップをバッチ洗浄のために磁器の免疫染色のボートを使用します。溶液中に浸漬する前に30秒のために10 Wの空気プラズマの小さなカバースリップを扱う。
- 3分間脱イオン（DI）流水結晶皿にきれいにサンプルを洗浄します。糸くずの出ないタオルの上に窒素銃ブロー乾燥試料。
- （：ミリスケールのパターンを作成するためにこれを使用方法1）ステンシルマスクを準備
- パンチ生検パンチと250μmの厚さのシリコーンエラストマーシートおよび/または半硬質プラスチック表面上にメスで地域を切開。窒素銃でイソプロパノール、乾燥70％で処理されたエラストマーシートを清掃してください。
- リントフリークリーンルームタオルの上にパンチングシートを置き、ステンシルが直面している試料表面とステンシルオーバーピラニア洗浄をカバースリップを合わせます。
- パターンリフトオフレジスト（方法2：サブミリスケールのパターンを作成するために使用します）
- チャックを回転にピラニア洗浄を顕微鏡スライドを置き、窒素銃で任意の粒子を吹き飛ばす。プラスチックピペットを用いてスライドガラス上に接着促進剤（ヘキサメチルジシラザン）1.5mlを分注する。 5秒、30秒のために1,500 rpmで500rpmで連続的にスライドを回転することによりプロモーターを広める。 7分間115℃のホットプレート上でスライドを焼いて5分間冷ます。
- スライドガラス上にフォトレジスト4mlのディスペンス（3インチByは1インチ）。接着促進剤の場合と同じプロトコルを使用してスライドを回転させてレジストを広げた。 1.5分間115℃のホットプレート上にフォトレジストを焼くと10分間冷ます。
- 15秒のために透明マスクを介して：UV光でフォトレジストでコーティングされたスライド（22 MW / cm 2と強度）を公開します。 1.5分間、115℃のホットプレート上にフォトレジストを焼いて45分間待ちます。少なくとも3.5分間現像液に露光されたフォトレジストを溶解する。 DI水で十分に洗い流してください。光学顕微鏡下で開発されたパターンを点検します。
- NP-Auの薄膜を製造するための前駆体の金属を堆積させる
- 独立して、金、銀、クロムを預けることができるスパッタ装置にサンプルをロードします。金属蒸着を開始する前に、25トルアルゴン処理雰囲気下、50 Wで90秒間のサンプルをスパッタクリーン。
- 10トルアルゴン下300 Wで10分間クロームスパッタ。 400 W国連で90秒間金をスパッタファンデ10トルアルゴン。 100 W.で200 WおよびAuパワーで銀と10分間、金と銀は、金、銀をオフにする前にソース約10秒スパッタ源をスパッタ切り共同スパッタ。
- 前駆金属微細パターンを得る
- 20秒の超音波処理を10サイクルとサイクルの間に2分間の休止のためのフォトレジストストリッパーの〜180ミリリットルでフォトレジストでコーティングされたサンプルを超音波処理。 DI水でサンプルをすすぎ、窒素銃で乾燥させます。顕微鏡下で金属パターンを検査します。
- 堆積した金属を明らかにするために2つのピンセットを使用して非フォトレジスト被覆された試料からの剥離性エラストマーステンシル。
- 熱処理経由Dealloy前駆金属および変更ナノ構造
- 硝酸（70％）170 mlのを200mlガラスビーカーを記入し、ホットプレート上で55℃に液温を維持する。注意：硝酸は非常に腐食性であり、適切な保護具を処理する必要があります。 硝酸に浸漬する前に30秒のために10 Wの空気プラズマの小さなカバースリップを扱う。耐酸性ピンセットを用いてビーカーに置き、3インチ顕微鏡スライド1インチおよび15分のためにそれらをdealloy。バッチ脱合金小さなカバースリップ用磁器免疫染色のボートを使用してください。
- 順次新鮮なDI水で三回充填2ビーカーにそれらを浸漬することによりdealloyedサンプルをリンス。少なくとも1週間DI水のサンプルを保存し、毎日新鮮なDI水で水を交換してください。使用前に糸くずの出ないタオルの上に窒素銃ブロー乾燥試料。
- 急速加熱処理装置におけるクリーンシリコンウェハー上にサンプルをロードする。 200°Cと450°Cとランプ速度との間に温度を調節10℃/秒。窒素雰囲気下で10分間所定の温度にサンプルを公開します。チャンバーは冷ます（<100℃）、サンプルを削除します。また、徐々に熱treatm用ホットプレート上のサンプルを配置ENT。
2。細胞培養
- 細胞培養用NP-Auのサンプルを準備します
- ポリスチレンディッシュ内の場所NP-Auのサンプルを、30秒間10 Wで空気プラズマで処理し、24ウェル組織培養プレートにサンプルを移す。
- 各ウェルに500μlの完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを有する）を追加する。 37℃加湿インキュベーターに保管℃、細胞（<1時間）播種まで5％CO 2。
- 維持するため、通路や種子細胞
- 培地、細胞が70％コンフルエントである経過とともにT75フラスコ中で目的の細胞（この場合は3T3-NIH線維芽細胞又はマウスアストロサイト）を維持する。
- 細胞を継代については、緩衝生理食塩水（PBS）を10mlのリン酸で二回洗い、フラスコからメディアを取り出し、細胞デタッチ（〜5分）まで、1×トリプシン/ EDTAとインキュベート2 mlを加える。 3ミリリットル新鮮な培地を追加し、3分間1,200 rpmで遠心。上清を吸引除去し、2 mlの培地中でペレットを中断します。
- 1ミリリットルの最終容量で25,000細胞/ cm 2の密度でカバーガラス上に井戸や種子細胞から過ごしたメディアを取り出します。サンプルの細胞の均一なコーティングを確保するために前進·バックと左右培養プレートを振る。毎日検査しながら分析まで細胞をインキュベート。
3。細胞と材料分析
- 細胞骨格と核を可視化するために細胞を染色
- 井戸から過ごしたメディアを取り出し、PBSで細胞を2回洗浄する。 15分間PBS中4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
- 1％ウシ血清アルブミンを含むPBSで300 nMのアレクサフルーア488ファロイジンの染色溶液を調製。
- PBSで細胞を2回洗浄し、5分間PBSでトリトンX-100を500μlの0.1％それらを透過性。
- PBSで細胞を2回洗浄し、井戸をきれいにするために、それらを転送します。しみ50 - サンプルと20分間、暗所で店舗へ200μlの染色液。
- PBSで5分間PBS中DAPIの3 Nmのカウンター染色で細胞を洗浄します。
- PBSで細胞を洗浄し、クリアなマニキュアで取り付けメディアやシールでガラスカバースライド上にマウントする前に脱イオン水に浸す。
- NP-Auの表面にNP-Auのサンプルと、細胞培養物の画像を取得する
- 画像NP-Auの二次電子検出器を使用して、10kVの電子エネルギーで50,000 Xの倍率で走査型電子顕微鏡（SEM）による表面。
- 適切なフィルタキューブで10倍の倍率で倒立蛍光顕微鏡を用いてサンプル上の異なる箇所で複合セル画像をキャプチャします。
- プロセスイメージは、毛穴や細胞形態を決定する
- ImageJのに該当する場合、個々のチャネルに分割オープン画像。 8ビットに画像を変換し、バックグラウンドを減算し、中央値filteriことによって、それらを滑らかにNG。手動または孔（ボイド）と細胞体/核を強調するためにアルゴリズムを閾値ビルトインによってしきい値を調整します。
- マージされた毛穴や細胞を分離するために流域コマンドを使用します。粒子解析パラメータを設定し、粒子による粒子、平均面積、およびパーセントカバレッジ数を抽出するためにコマンドを実行します。細胞計数およびパーセントセルカバレッジを定量化するためファロイジン染色細胞画像のDAPI染色細胞の画像を使用してください。
- 複数の画像を一括分析を実行するために含まれたマクロファイルを変更する。
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Representative Results
図1は 、培養細胞をNP-Auのパターンを作成するナノ構造を定量化し、細胞形態を特徴付ける含めて、主要な処理手順の概要を説明します。 図2aに示したエラストマーステンシル（上面）の下に画像に示すようにNP-Auのパターンを作成するために使用される。 図2bは、バッチ処理の試験片の磁器船の写真である。 図2cは、堆積された金属パターンの色変化を表示する前と後に脱合金。銀色仕上げ（脱合金の前）は銀の豊富な合金成分によるものです。脱合金の際、フィルムは目に見えて橙褐色の色合いを取得。 図2dは、金属のフォトリソグラフィパターニングによって生成された細かい機能を示しています。異なる孔形態は、 図3に示すようにNP-Auの膜9の熱処理により得ることができる。断面像（ 図URE 3）膜は、膜厚を介して均一にdealloyedあるかどうかを明らかにする。 SEM画像は、ボイド（ コード1）でサイズやパーセントのカバレッジを決定するためのバイナリイメージ（ 図3下段）に（しきい値処理）セグメント化することができます。 NP-Au表面上で培養されたマウス星状細胞接着の代表的な蛍光画像を図4に示されている。画像の各チャンネルは、細胞の材料との相互作用を分析するためのバイナリ画像を生成するために分割し、セグメント化することができる。セグメント化された細胞核の画像の細胞計数（ コード3）に有用であるがセグメント化された細胞骨格画像は、セル領域と表面被覆率（ コード2）を定量化するために使用することができる。 図5は、NP-Auの構造体の製造において一般的な障害を視覚的にまとめたものである、貧しいフィルム密着性、多孔性の欠如、および過度の熱の治療を含む。
図1。主要な処理ステップの概略図。酸洗浄した基板は、手動カットステンシルマスクまたはフォトリソグラフィ·パターン化されたフォトレジスト層がマスクされる。金と銀のターゲットを同時にマスクは、ガラス基板上にパターンを転写銀リッチな金合金を作成するためにスパッタされる。合金のパターンはナノポーラス金（NP-Au）のパターンを作成するために硝酸でdealloyedです。目的の細胞をサンプル上で培養され、それらは生物学的および形態学の両方の特徴を抽出するために、蛍光及び走査型電子顕微鏡で撮像する。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。光学像（）NP-Auのアレイ（下）を生成するパターニング前駆金-銀合金に使用されるシリコーンステンシル（上）、（b）はバッチ処理の試験片の磁器ボート;の（c）は、代表色はAuAgスパッタ合金（上）とdealloyedフィルム（下）、および金銀蒸着中にフォトリソグラフィマスキングによって生成（d）の高解像度NP-Auのパターン。
図3。 NP-AuのSEM画像（一番上の行）と抽出平均ボイドサイズのために使用され、対応するセグメント化された画像（下段）NDパーセントボイドカバレッジ劈開NP-Auのサンプルの。SEM像（右上）は、膜厚を通じて均質な細孔構造を表示します。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。 F-アクチン複合（緑）、青から緑のチャネルと細胞数から％のセルカバレッジを抽出するセグメント化されて核（青）で染色細胞画像、。
図5。典型的な失敗の画像。（a）は剥離クロムの不十分な接着層に起因する脱合金中に、合金中の銀の含有量が不十分のために脱合金後に多孔性の（b）の有無と、高すぎる熱処理温度によるNP-Au膜の（c）の完全な焼結。
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Discussion
私たちは、マイクロシステムと生物学的研究におけるこれらのフィルムの使用を拡大するため微細NP-Auの膜には、2つの異なる技術を実証する。スパッタコーティング、金と銀は、スパッタリング、従来の微細加工プロセスと合金組成と厚さを簡単に個々のスパッタ銃のパワーを変化させることにより制御（金と銀の目標のために）とすることができますとの互換性があるように、NP-Auのパターンを作成するための汎用性の高い方法であり、それぞれ堆積時間。典型的なNP-Au膜は200nmから2μmの範囲の厚さ。生検パンチとメスを使ってステンシル法（方法1、 図2a）は 、フォトリソグラフィのための必要性を回避するミリメートルスケールパターンを作成することができます。より複雑なパターンがプログラム可能なレーザーカッターにより製造することができる。ガラス表面上に準拠したシリコーンエラストマーステンシル自己付着し、それによってマスク及び増大パターン解像度の下に金属堆積を防止する。しかし、小さいFステンシルの厚さは、マスクの開口部を通して均一な金属堆積を防止するような特長（<1 mm）は、典型的には、この方法で製造することが困難である。高機能の解像度を必要とするアプリケーションは、フォトリソグラフィパターニング（方法2、 図2D）で達成することができます。フォトリソグラフィーを経由してパターンを転写するための透明マスクはいくつかの企業（ 例えば出力都市、バンドン、OR）から得られ、最小所望の特徴サイズは〜20ミクロン以上であるクロムガラスマスクに経済的な選択肢であることができます。準拠ステンシル上に金属堆積は、時には不均一な応力発生による基板からステンシルの剥離につながる。我々は一般的にエッジにポリイミドテープを使用して下にある基板にステンシルを確保することにより、この問題を軽減する。
ときにこのような一般的に我々の研究で使用され、円形のカバーガラス（12ミリ径）に示すように、磁器ボートなどの小型のサンプル、
NP-Auの膜の熱処理気孔形態（ 図3）を変更するための便利かつ制御方法である。急速熱アニール楽器は熱処理のために望ましいが、炉やホットプレートも許容可能な結果を生成します。 T彼の熱線量と温度が高温（> 500℃）として、慎重に監視する必要がありますは、NP-Au及び多孔性の消失（ 図5c）の焼結を完了する可能性があります。堆積合金（60％未満の銀、。％時）における不十分なの銀の含有量も、気孔形成（ 図5b）を防ぐことができます。
上記NP-Auをコーティングされた表面上の生存細胞培養を確立するためには、完全に多孔ネットワークから硝酸残渣を除去するためにいくつかの水の変更をDI水中に試料を浸漬することが重要である。それは、細胞を播種する前に、特定の細胞外マトリックス（ECM）タンパク質との表面を処理する必要はなかったが、我々は、プラズマ処理を観察し、細胞を播種する前に、細胞培養培地のサンプルを浸漬すると、大幅に細胞接着および生存率を向上させる。この改善は、セリウムの血清中で最も可能性が高い接着タンパク質の非特異的吸着によるものであるNP-Au表面上にLL培地。無血清培地を必要とする細胞培養条件のために、それは前処理NP-Au表面ECM分子（ 例えばフィブロネクチン）とすることが必要であってもよい。
細孔/空隙サイズ及び範囲、並びに細胞数とセルのカバレッジを決定するために、画像が白黒二値画像（ 図3および図4を参照）に変換する必要-プロセスは、 セグメンテーションとして知られている。これは、ユーザーバイアスの傾向があるしきいグレー値を選ぶ必要があります。したがって、画像処理によって決定絶対値は注意して報告すべきである。ほとんどの研究は、細胞およびナノ構造の異なる形態の比較を必要とし、分析パラメータ（ 例えば閾値、粒径ウィンドウ）をサンプル全体の一貫性が保たれている限り、したがって、統計的有意性は、サンプルの比較的少数で達成することができる。画像分割の前に、また、有用であること画像を滑らかにし、ImageJのでビルトインコマンド（またはそれ以上の特殊なバージョン、フィジー）を使用して、バックグラウンドを減算する。私たちは、バッチ処理複数の画像に含まれるマクロ（ 補足コードファイル1-3）のパラメータを調整します。
我々はここで実証技術は電気生理学、バイオセンサー、およびミニチュアエネルギー貯蔵スキームの複数の電極アレイを含むマイクロシステム、にNP-Auの統合に科学コミュニティを支援することを期待しています。また、半定量的な画像処理方法は、材料および接着細胞の相互作用の研究の広い範囲の価値があると考えている。
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Disclosures
著者は全く相反する経済的利害関係を持っていません。
Acknowledgments
O. KurtulusとD. Dimliogluは、カリフォルニア大学研究費研究プログラム賞12-LR-237197によってサポートされています。 P. Daggumatiはサイエンス＆エンジニアリング（RISE）賞カリフォルニア州デービス·リサーチ·インベストメンツ大学によってサポートされています。 CAチャップマンは、ナショナルニードフェローシップの教育大学院援助分野の部門によってサポートされています。この作業は、UCラボ料研究プログラム、UCデービスのRISE、工学スタートアップ資金のカリフォルニア大学デービス校の大学によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold target | Lesker | EJTAUXX403A2 | Precursor to alloy for producing np-Au |
| Chrome target | Lesker | EJTCRXX353A2 | Adhesive layer |
| Silver target | Lesker | EJTAGXX403A2 | Precursor to alloy for producing np-Au |
| Porcelain boat | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for processing small samples |
| Nitric acid | Sigma-Aldrich | 43873 | Used at 70% for dealloying |
| Sulfuric acid | J.T Baker | 7664-93-9 | Used at 96% for piranha cleaning |
| Hydrogen peroxide | J.T Baker | 7722-84-1 | Used at 30% for piranha cleaning |
| Biopsy punches | Ted Pella | 150xx | Available in several sizes |
| Silicone elastomer sheets | Rogers Corporation | HT 6240 | Available in several thicknesses |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191-100ML | Used as adhesion promoter for positive resist |
| Microposit MF CD26 | Shipley | 38490 | Positive photoresist developer |
| PRS 3000 | J.T Baker | JT6403-5 | Positive photoresist stripper |
| Circular glass coverslips (12 mm) | Ted Pella | 26023 | Used as substrate for metal patterns and cell culture |
| Glass slides (1 x 3 inch) | Ted Pella | 26007 | Used as substrate for metal patterns |
| Kapton polyimide tape | VWR | 82030-950 | Used for securing elastomer |
| Transparency masks | Output City | Used in photolithography http://www.outputcity.com/ | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Used for activating glass surfaces |
| Sputtering machine | Kurt J. Lesker | LAB18 | Used for depositing metals |
References
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