Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה

Published: July 15, 2013 doi: 10.3791/50678
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Davis, 3Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis

Summary

אנו מדווחים על טכניקות לסרטים באמצעות הדפסת סטנסיל וphotolithography, כמו גם שיטות לתאי תרבות על דפוסי microfabricated הדקים זהב nanoporous micropattern. בנוסף, אנו מתארים שיטות ניתוח תמונה למאפיינות מורפולוגיה של החומר ואת התאים בתרבית באמצעות אלקטרונים סורקים וטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

חומרי Nanostructured עם גדלי תכונה בעשרות ננומטרים הגבירו את הביצועים של מספר טכנולוגיות, כולל תאי דלק, biosensors, ציפויי מכשיר ביו, וכלים אספקת סמים. זהב Nanoporous (NP-Au), המיוצר על ידי תהליך הרכבה עצמית בקנה מידה ננו, הוא חומר חדש יחסית שמציג שטח גדול משטח יעיל, מוליכות חשמלית גבוהות, ופעילות קטליטית. מאפיינים אלו הפכו את NP-Au חומר אטרקטיבי לקהילה מדעית. רוב המחקרים על NP-Au להעסיק דגימות מאקרו בקנה מידה ולהתמקד במדע בסיסי של החומר והיישומים קטליטיים וחיישן שלה. דגימות מאקרו בקנה המידה להגביל את הפוטנציאל של NP-Au במערכות מיניאטורי, כולל התקנים ביו. על מנת לטפל בבעיות אלה, אנחנו בהתחלה לתאר בשתי שיטות שונות לסרטים דקים micropattern NP-Au על מצעים נוקשים. השיטה הראשונה מעסיקה מסכות סטנסיל ידני המיוצרים ליצירת דפוסי NP-Au מילימטר בקנה מידה, whilדואר השיטה השנייה משתמשת photolithography המראה לדפוסים תת מילימטר בקנה מידת דפוס. ככל שהסרטים הדקים NP-Au מתקבלים על ידי תהליך גמגום בתצהיר, שהם בקנה אחד עם טכניקות microfabrication קונבנציונליות, ובכך המתאימים לשילוב קליל למיקרוסיסטמס. מערכות אלה כוללות פלטפורמות biosensor חשמליים-מיעון שנהנים מאזור הגבוה יעיל פני השטח, מוליכות חשמליות, ומשטח bioconjugation מבוסס זהב תיאול. אנו מתארים תרבית תאים, immunostaining, וטכניקות עיבוד תמונה לכמת האינטראקציה של NP-Au עם תאי יונקים, וזה פרמטר חשוב לביצועים מסוימים biosensors. אנו צופים כי בטכניקות מאוירות כאן יסייעו שילוב של NP-Au בפלטפורמות באורך סולמות שונים וביישומים רבים, כוללים חיישנים ביולוגיים, מערכות אחסון אנרגיה, וזרזים.

Introduction

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור זהב Nanoporous

  1. מצעים נקיים בפתרון Piranha
    1. הוסף 25 מ"ל מי חמצן (30%) לחומצה גופרתית 100 מ"ל (96%) בצלחת גיבוש ומחמם את התערובת עד 65 מעלות צלזיוס על פלטה חמה. התראה: הנוזלים הם מאכל מאוד ויש לטפל בזהירות. הפתרון בילה לא צריך להיות מאוחסן במכל אטום, כפי שהוא עלול להתפוצץ.
    2. מקום 1 אינץ על ידי שקופיות מיקרוסקופ 3 אינץ לתוך התערובת באמצעות מלקחיים עמידי חומצה ולנקות אותם במשך 10 דקות. השתמש בסירת immunostaining פורצלן לתצווה ניקוי-coverslips קטנה. פנק coverslips קטנה עם אוויר בפלזמה 10 וואט למשך 30 שניות לפני הטבילה לתוך התמיסה.
    3. יש לשטוף את הדגימות ניקו במנות התגבשות תחת מים זורמים deionized (DI) במשך 3 דקות. דגימות מכה יבשות עם אקדח חנקן מעל נטולות סיבי מגבות.
  2. הכן את מסכת סטנסיל (שיטה 1: השתמש באפשרות זו ליצירת דפוסי מילימטר בקנה מידה)
    1. 250 גיליונות סיליקון אלסטומר מיקרומטר בעובי אגרוף עם אגרופים ביופסיה ו / או לחתוך את אזורים עם אזמל על משטח פלסטיק חצי קשה. נקה את גיליונות אלסטומר מעובד ב70% isopropanol ויבשים עם אקדח חנקן.
    2. הנח את הגיליון חבט במגבת נטולת מוך חדר נקי וליישר את coverslips Piranha-ניקה מעל סטנסיל עם משטח המדגם מול סטנסיל.
  3. photoresist המראת הדפוס (שיטה 2: השתמש באפשרות זו ליצירת דפוסים תת מילימטר בקנה מידה)
    1. הנח Piranha-ניקו שקופיות מיקרוסקופ על ספינינג צ'אק ולפוצץ את כל חלקיקים עם אקדח של חנקן. לוותר על 1.5 מ"ל של אמרגן הידבקות (hexamethyldisilazane) על גבי שקופית הזכוכית באמצעות פיפטה פלסטיק. מורחים את האמרגן ידי ספינינג את השקופית ברציפות ב 500 סל"ד במשך 5 שניות ו-1,500 סל"ד במשך 30 שניות. אופים את השקופית על פלטה חמה על 115 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות ולתת לו להתקרר למשך 5 דקות.
    2. לוותר על 4 מ"ל של photoresist לשקופית הזכוכית (ב 3 אינץy-1 סנטימטר). מורחים photoresist על ידי ספינינג השקופית עם אותו הפרוטוקול כלאמרגן ההידבקות. לאפות photoresist על פלטה חמה על 115 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות ולתת לו להתקרר במשך 10 דקות.
    3. לחשוף את שקופית photoresist המצופה עם אור האולטרה סגול (העצמה: 22 mW / 2 ס"מ) דרך שקיפות מסכה במשך 15 שניות. לאפות photoresist על פלטה חמה על 115 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות ולחכות 45 דקות. ממיסים את photoresist נחשף במפתח לפחות 3.5 דקות. לשטוף ביסודיות עם מים די. בדוק את הדפוסים שפותחו תחת מיקרוסקופ אופטי.
  4. מתכות מבשר הפקדה להפקת סרטים דקים NP-Au
    1. טען את הדגימות למכונה המקרטעת שעצמאית יכול להפקיד זהב, כסף, וכרום. גמגום-לנקות את הדגימות עבור 90 שניות ב 50 וואט מתחת לגיל 25 אווירת עיבוד ארגון mTorr לפני תחילת תצהיר מתכת.
    2. גמגום כרום עבור 10 דקות ב 300 וואט מתחת לגיל 10 mTorr ארגון. גמגום זהב עבור 90 שניות ב 400 W האו"םדר 10 mTorr ארגון. שיתוף גמגום זהב וכסף עבור 10 דקות בכסף ב 200 וואט וכוח Au ב 100 וו כבה זהב גמגום מקור כ -10 שניות לפני כיבוי כסף גמגום מקור.
  5. השג micropatterns המתכת המבשר
    1. Sonicate דגימות photoresist מצופים ב~ 180 מ"ל של חשפנית photoresist במשך 10 מחזורים של 20 שניות וsonication להשהות 2 דקות בין המחזורים. יש לשטוף את הדגימות עם מים די ולייבש עם אקדח חנקן. בדוק את דפוסי המתכת תחת מיקרוסקופ.
    2. קולפים את הסטנסיל אלסטומר מדגימות שאינן מצופים photoresist באמצעות שתי פינצטה כדי לחשוף את המתכת שהופקדה.
  6. Dealloy מתכת מבשר וnanostructure שינוי דרך טיפול תרמי
    1. מלא כוס זכוכית 200 מ"ל עם 170 מ"ל של חומצה חנקתית (70%) ולשמור על טמפרטורת הפתרון על 55 מעלות צלזיוס על פלטה חמה. זהירות: החומצה חנקתית היא מאכל מאוד ויש לטפל בציוד מגן מתאים. פנק coverslips קטנה עם אוויר בפלזמה 10 וואט למשך 30 שניות לפני הטבילה בחומצה חנקתית. מקום 1 אינץ על ידי שקופיות מיקרוסקופ 3 אינץ לתוך הכוס באמצעות מלקחיים חומצה עמידים וdealloy במשך 15 דקות. השתמש בסירת immunostaining פורצלן לתצווה dealloying-coverslips קטנה.
    2. יש לשטוף את דגימות dealloyed על ידי השיקוע שלהם ברציפות בשתי כוסות מלאות במים די טריים שלוש פעמים. לאחסן דגימות במי DI ולהחליף את המים עם מים די טריים בכל יום במשך שבוע לפחות. דגימות מכה יבשות עם אקדח חנקן על מגבות ונטולות מוך לפני השימוש.
    3. טען דגימות על גבי פרוסות סיליקון נקיות בציוד לעיבוד תרמי מהיר. כוון את הטמפרטורה לבין 200 ° C ו -450 ° C ושיעור הרמפה עד 10 מעלות צלזיוס / שנייה. לחשוף את הדגימות לטמפרטורה שנקבעה למשך 10 דקות תחת חנקן הסביבה. בואו קאמרי מגניב (<100 ° C) ולהסיר את הדגימות. לחלופין, מניח את הדגימות לאט על הפלטה החמה לtreatm תרמיתאף אוזן גרון.

2. תרבית תאים

  1. הכן את דגימות NP-Au לתרבית תאים
    1. דגימות מקום NP-Au בצלחות קלקר ולטפל עם אוויר בפלזמה 10 וואט למשך 30 שניות ולהעביר את הדגימות לצלחות תרבית רקמת 24 באר.
    2. הוסף 500 תקשורת התרבות שלמה μl (בינוני נשר שינוי Dulbecco של 10% בסרום שור העובר ו1% פניצילין סטרפטומיצין /) זה טוב. החנות בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד זריעת התאים (<1 שעות).
  2. לשמור, מעבר, וזרע תאים
    1. שמור על תאים של עניין (במקרה זה fibroblasts 3T3-NIH או האסטרוציטים עכבריים) ב T75 צלוחיות עם תקשורת והתרבות ומעבר כאשר תאים הם 70% ומחוברות.
    2. לpassaging התאים, להסיר מדיה מהבקבוק, לשטוף פעמיים עם פוספט 10 מ"ל נאגר מלוח (PBS), להוסיף 2 מ"ל של 1x טריפסין / EDTA ו לדגור עד שהתאים לניתק (~ 5 דקות). הוסף 3 מ"ל ותקשורת טריצנטריפוגות ב -1,200 סל"ד במשך 3 דקות. לשאוב supernatant ולהשעות את גלולה ב2 מ"ל תקשורת.
    3. הסר את המדיה בילתה מהבארות ואת תאי הזרע על coverslips הזכוכית בצפיפות של 25,000 תאים / 2 ס"מ עם נפח סופי של 1 מ"ל. לנער את צלחת התרבות קדימה אחורה וימין שמאל כדי להבטיח ציפוי אחיד של תאים על פני הדגימות. דגירה התאים עד לניתוח תוך בדיקה יומית.

3. תא וניתוח חומר

  1. כתם תאים לדמיין שלד תא וגרעינים
    1. הסר תקשורת בילתה מבארות ולשטוף תאים פעמיים עם PBS. תקן תאי paraformaldehyde 4% ב-PBS למשך 15 דקות.
    2. הכן את הפתרון מכתים של 300 ננומטר אלקסה פלואוריד 488 phalloidin בPBS עם 1% אלבומין בסרום שור.
    3. שטוף תאים פעמיים עם PBS, וpermeabilize ב500 μl 0.1% טריטון X-100 ב PBS למשך 5 דקות.
    4. שטוף תאים פעמיים עם PBS ולהעביר אותם לניקוי בארות. כתם 50 - הפתרון מכתים μl 200 על הדגימות ולאחסן בחושך במשך 20 דקות.
    5. שטוף תאים עם PBS ונגד כתם עם 3 ננומטר של DAPI בPBS במשך 5 דקות.
    6. שטוף תאים עם PBS, ולטבול במי deionized לפני ההרכבה בשקופיות עם כיסוי זכוכית תקשורת הרכבה וחותם עם לק ברור.
  2. לרכוש תמונות של דגימות NP-Au בתרביות תאים על משטחי NP-Au
    1. משטחי התמונה NP-Au עם סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם הגדלה X 50,000 באנרגית אלקטרון ק 10 באמצעות גלאי אלקטרונים משניים.
    2. צלם תמונות סלולריים מרוכבים בנקודות שונות על את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה 10X עם קוביות המסנן המתאימות.
  3. תמונות תהליך כדי לקבוע מורפולוגיה נקבובית ותא
    1. פתיחת תמונות ב ImageJ ומחולק לערוצים נפרדים במידת צורך. להמיר את התמונות ל8 סיביות, לחסר רקע, וחלקם על ידי filteri חציוןng. התאם סף באופן ידני או על ידי מובנה thresholding אלגוריתמים כדי להדגיש את הנקבוביות (חללים) וגופי תא / גרעינים.
    2. השתמש בפקודת פרשת מים כדי להפריד נקבוביות או תאים ממוזגים. להגדיר את פרמטרי ניתוח חלקיקים ולבצע את הפקודה כדי לחלץ מספר החלקיקים, באזור הממוצע, וכן כיסוי אחוזים על ידי חלקיקים. השתמש בתמונות סלולריים DAPI מוכתמים לספירת תאים ותמונות תא phalloidin מוכתמת לכימות כיסוי תא אחוזים.
    3. לשנות את קבצי מאקרו שנכללו לבצע ניתוח אצווה של תמונות מרובות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מתאר את הצעדים פרוצדורליים הגדולים, כולל יצירת הדפוסים NP-Au, תאי culturing, כימות nanostructure, ואפיון מורפולוגיות סלולריים. סטנסיל אלסטומר שמוצג באיור 2 א (עליון) משמש ליצירת דפוסי NP-Au המוצגים בתמונות שמתחת. איור 2b הוא תצלום של סירת הפורצלן לדגימות עיבוד אצווה. איור 2 ג מציג את שינוי הצבע של דפוסי המתכת הופקדו לפני ואחרי dealloying. הגימור הכסוף (לפני dealloying) בשל תוכן מסגסוגת כסף העשיר. על dealloying, הסרט רוכש גוון כתום חום בעליל. איור 2 ממחיש את התכונות העדינות המיוצרות על ידי דפוסי photolithographic של המתכת. ניתן להשיג מורפולוגיות נקבוביות שונות על ידי טיפול תרמי של NP-Au 9 סרטים, כפי שמוצגים באיור 3. תמונת החתך (איור יור 3) מגלה שאין בסרטי dealloyed אחיד דרך עובי הסרט. את תמונות SEM יכולות להיות מקוטעות (thresholded) לדימויים בינאריים (איור 3 שורה תחתונה) לקביעת הגודל ואחוזי הכיסוי על ידי חללים (קוד 1). תמונת הקרינה נציג של תאי astrocyte העכבריים חסיד תרבית על פני השטח NP-Au מוצגת באיור 4. הערוצים הבודדים של התמונה ניתן לפצל ומפולח כדי להפיק תמונות בינאריות לניתוח אינטראקציה תא חומר. תמונות cytoskeleton מפולחות יכולות לשמש לכימות אזור תא ופני שטח כיסוי (קוד 2), ואילו את תמונות גרעין התא מפולחות שימושיות לספירת תאים (קוד 3). איור 5 הוא סיכום חזותי של כשלים נפוצים בייצור של מבני NP-Au , כולל הידבקות עניה סרט, היעדר נקבוביות, וטיפול תרמי מוגזם.

together.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1. איור סכמטי של מדרגות העיבוד המרכזיות.-ניקו חומצת מצעים הם רעולי פנים או עם מסכת סטנסיל בחיתוך ידני או שכבת photoresist photolithographically בדוגמת. מטרות הזהב וכסף במקביל גמגמו ליצור סגסוגת זהב כסף עשירה, שבו המסכות להעביר את הדפוסים על גבי מצעי הזכוכית. דפוסי סגסוגת הם dealloyed בחומצה חנקתית כדי ליצור זהב nanoporous (NP-Au) תבניות. תאים בתרבית של עניין על הדגימות והם צילמו עם הקרינה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לחלץ התכונות ביולוגיות ומורפולוגי שני. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

בעמודים = "תמיד"> איור 2
איור 2. תמונות אופטיות () סטנסיל סיליקון (למעלה) המשמש לסגסוגת זהב, כסף מבשר דפוסים, אשר מייצרת מגוון NP-Au (תחתון);. (ב) לסירת פורצלן דגימות עיבוד אצווה: (ג) בצבע אופייני לגמגמו AuAg סגסוגת (למעלה) וסרט dealloyed (תחתון), וכן (ד) תבניות NP-Au בעל רזולוציה גבוהה יותר המיוצרים על ידי מיסוך photolithographic בתצהיר כסף זהב.

איור 3
איור 3. תמונות SEM NP-Au (בשורה העליונה) ותמונות מפולחות מתאימות (שורה תחתונה) המשמשות לגודל חלל ממוצע חילוץכיסוי חלל אחוזים ND. תמונת SEM (ימנית עליון) של מדגם NP-Au ביקע מציגה מבנה נקבובית הומוגנית דרך עובי הסרט. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4
איור 4. F-אקטין תמונת הגרעין (כחול) מוכתמת תא, שהוא מפולח לחלץ כיסוי תא אחוזים מהערוץ הירוק וספירת תאים מהכחולים משולב (ירוק) ו.

איור 5
איור 5. תמונות של תקלות אופייניות. (א) delaminationבמהלך dealloying בשל שכבת דבק מספקת של כרום, (ב) עדר נקבוביות לאחר dealloying בשל תכולת כסף מספיק בסגסוגת; ו( ג) השריפה של NP-Au מלא סרט בשל טמפרטורת טיפול תרמית להיות גבוהה מדי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מדגימים שתי טכניקות שונות לסרטי NP-Au micropattern להרחבת שימוש בסרטים האלה במיקרוסיסטמס ומחקרים ביולוגיים. זהב גמגום ציפוי וכסף הוא שיטה תכליתית ליצור דפוסי NP-Au, כמקרטע תואם את תהליכי microfabrication קונבנציונליים וסגסוגת בהרכב והעובי ניתן לשלוט בקלות על ידי שינוי סמכויות האקדח המקרטעות הבודדות (למטרות זהב וכסף) ו זמן תצהיר בהתאמה. סרט NP-Au טיפוסי עוביים נע בין 200 ננומטר ל 2 מיקרומטר. שיטת השבלונה (שיטת 1, איור 2 א) באמצעות ביופסית אגרופים ואזמל מאפשרת ליצירת דפוסי מילימטר בקנה מידה לעקוף את הצורך בphotolithography. ניתן לייצר תבניות מורכבות יותר על ידי חיתוך לייזר לתכנות. סטנסיל סיליקון אלסטומר התואם עצמי שומר על גבי משטחי זכוכית, ובכך למנוע תצהיר מתכת מתחת למסכה ורזולוציה דפוס הולכת וגוברת. עם זאת, F קטן יותרeatures (<1 מ"מ) הם בדרך כלל קשה לייצר בשיטה זו, כעובי של הסטנסיל מונע אחיד תצהיר מתכת דרך הפתחים במסכה. יישומים הדורשים רזולוציה גבוהה יותר תכונה ניתן להשיג עם דפוסי photolithographic (שיטה 2, איור 2). ניתן להשיג את מסכות השקיפות להעביר את דפוסים באמצעות photolithography ממספר חברות (למשל פלט סיטי, Bandon, אור) וחלופות חסכוני מסכות כרום זכוכית כאשר גדלים תכונה הרצויה מינימום הם יותר מ ~ 20 מיקרומטר. תצהיר המתכת על גבי סטנסיל התואם לעתים מוביל לניתוק של הסטנסיל מהמצע בשל דור מתח לא אחיד. אנחנו בדרך כלל לצמצם בעיה זו על ידי הבטחת סטנסיל למצע הבסיסי באמצעות קלטת פוליאימיד בקצוות.

כאשר דגימות קטנות יותר, כגון coverslips העגול (קוטר 12 מ"מ) משמשות בדרך כלל במחקרים שלנו, שמוצגת בסירות פורצלן (למשל נקי, dealloy) דגימות קטנות מרובות. העיבוד אצווה של דגימות מגביר את האחידות של nanostructure מיוצרת על פני מדגמים שונים. דגימות קטנות נוטות לצוף בעת טבילה בPiranha או dealloying פתרונות, כפי שהם הופכים להידרופובי כאשר הם מאוחסנים באוויר. לפני דגימות כל צעד דורש להיות שקועה בנוזל, פלזמה טיפול בהם (10 וואט למשך 30 שניות) הופכת את משטח הזכוכית הידרופילי ומסייע להפחית את הנושא הצף. הבעיה הנפוצה ביותר בהפקת NP-Au סרטים היא delamination במהלך שלב dealloying. זו מיוחסת בדרך כלל להצטברות מתח מתיחה בשל הצטמקות עוצמת קול במהלך dealloying 21. על מנת למנוע delamination, חשוב שתהיה לי הידבקות חזקה בין סרט NP-Au והמצע. זו מושגת על ידי כרום מספיק עבה (~ 150 ננומטר) וגרם בינייםשכבה ישנה (~ 200 ננומטר). סרטים שהופקדו אמורים להופיע אור לאפור כהה כאשר במבט מהצד האחורי של מצע שקוף. הסרט קילף מוצג באיור 5 א הוא דוגמה טובה לאופן שבו הישבן של הסרט לא צריך להיראות כמו - גימור הזהב עולה כי שכבת הכרום אינה עבה דיו על מנת להבטיח הדבקה חזקה. סיבה נוספת לdelamination היא מדגם שטח לא נקי, ולכן זה חיוני למשטחי Piranha-נקיים שקדמו לתצהיר מתכת. בנוסף, חשוב לוודא כי הוא photoresist מלא פותח לפני הפקדת הסרט, כמו כל photoresist שיורי מונע הידבקות החזקה של מתכת שהופקדה על גבי משטח הזכוכית.

טיפול תרמי של NP-Au סרטים הוא שיטה נוחה לשליטה לשינוי מורפולוגיה נקבובית (איור 3). בעוד מכשיר חישול תרמית מהיר רצוי לטיפול תרמי, תנורים וכיריים גם לייצר תוצאות מתקבלות על הדעת. Tהוא מנת תרמית והטמפרטורה צריכים להיות במעקב צמוד, כמו טמפרטורות גבוהות (> 500 מעלות צלזיוס) עלולות להוביל להשלמת השריפה של NP-Au והיעלמותו של נקבוביות (איור 5 ג'). תוכן כסף מספיק בסגסוגת הופקדה (כסף פחות מ -60%, ב.%) גם מונע היווצרות נקבוביות (איור 5).

כדי להקים תרביות תאי קיימא על משטחי מצופים הנ"ל NP-au, חשוב להשרות את הדגימות במי DI עם כמה החלפות מים כדי להסיר את שאריות החומצה חנקתית באופן מלא מהרשת נקבובית. למרות שזה לא היה נחוץ לטיפול במשטחים עם מטריקס (ECM) חלבונים תאיים מסוימים לפני זריעת התאים, הבחין כי טיפול פלזמה והשריית הדגימות בתרבית תאים בינוני לפני זריעת התאים לשפר בצורה דרסטית הידבקות תא ויכולת קיום. שיפור זה הוא ככל הנראה בשל ספיחה הלא ספציפית של חלבונים מההידבקות בסרום לספירהתקשורת ותרבות ll על פני שטח NP-Au. תנאי תרבית תאים הדורשים מדיום סרום ללא, ייתכן שיהיה צורך לטיפול מקדים לפני השטח NP-Au עם מולקולות ECM (למשל פיברונקטין).

לקביעה נקבובית / גודל חלל וכיסוי, כמו גם ספירת תאים וכיסוי תא, תמונות צריכים להיות מומרות לתמונות בשחור לבן בינאריים (ראה איורים 3 ו -4) - תהליך הידוע גם בפילוח. זה דורש בחירת ערך סף אפור כי הוא נוטה למשתמש משוא פנים. לכן, יש לדווח ערכים מוחלטים שנקבעו על ידי עיבוד תמונה בזהירות. רוב המחקרים דורשים השוואה של מורפולוגיות של תאים וnanostructure שונות, ולכן, כל עוד פרמטרי הניתוח (סף, חלון גודל חלקיקים למשל) נשמרים דגימות עקביות, ניתן להשיג מובהקות סטטיסטיות עם מספר קטן יחסית של דגימות. לפני פילוח תמונה, זה גם מועילכדי להחליק את התמונות ולחסר רקע שימוש בפקודות המוכללות בImageJ (או גרסה מיוחדת יותר, פיג'י). אנו להתאים את הפרמטרים במאקרו הכלול (קבצי קוד משלימה 1-3) למספר רב של תמונות בתהליך אצווה.

אנו צופים כי בטכניקות הפגינו כאן יסייעו לקהילה המדעית בשילוב NP-Au למיקרוסיסטמס, כולל מערכים מרובים אלקטרודה לאלקטרופיזיולוגיה, biosensors וערכות אחסון אנרגיה זעירה. בנוסף, אנו מאמינים כי שיטות עיבוד תמונת כמותיות תהיה בעל ערך עבור מגוון רחב של מחקרים על האינטראקציה של חומרים ותאים חסיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש מחברים שום אינטרס כלכלי סותר.

Acknowledgments

א 'וד' Kurtulus Dimlioglu נתמך על ידי אוניברסיטת קליפורניה מעבדה אגרות פרס תכנית מחקר 12-LR-237,197. פ Daggumati נתמך על ידי אוניברסיטת קליפורניה דיוויס השקעות מחקר בפרס המדעים והנדסה (עלייה). CA צ'פמן נתמך על ידי מחלקה לחינוך לתארים מתקדמים תחומי סיוע של מלגת צורך הלאומית. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית UC מעבדת מחקר עמלות, עליית דייוויס UC, וUC Davis המכללה אקדמי להנדסת סטארט כספים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold target Lesker EJTAUXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target Lesker EJTCRXX353A2 Adhesive layer
Silver target Lesker EJTAGXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat Thomas Scientific 8542E40 Used for processing small samples
Nitric acid Sigma-Aldrich 43873 Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid J.T Baker 7664-93-9 Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide J.T Baker 7722-84-1 Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches Ted Pella 150xx Available in several sizes
Silicone elastomer sheets Rogers Corporation HT 6240 Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191-100ML Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26 Shipley 38490 Positive photoresist developer
PRS 3000 J.T Baker JT6403-5 Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm) Ted Pella 26023 Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch) Ted Pella 26007 Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape VWR 82030-950 Used for securing elastomer
Transparency masks Output City Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G Used for activating glass surfaces
Sputtering machine Kurt J. Lesker LAB18 Used for depositing metals

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arico, A. S., Bruce, P., Scrosati, B., Tarascon, J. M., Van Schalkwijk, W. Nanostructured materials for advanced energy conversion and storage devices. Nature Materials. 4, 366-377 (2005).
  2. Roy, S., Gao, Z. Nanostructure-based electrical biosensors. Nano Today. 4, 318-334 (2009).
  3. Chen, C. L., et al. DNA-decorated carbon-nanotube-based chemical sensors on complementary metal oxide semiconductor circuitry. Nanotechnology. 21, 095504 (2010).
  4. Lu, J., Rao, M. P., MacDonald, N. C., Khang, D., Webster, T. J. Improved endothelial cell adhesion and proliferation on patterned titanium surfaces with rationally designed, micrometer to nanometer features. Acta Biomaterialia. 4, 192-201 (2008).
  5. Wagner, V., Dullaart, A., Bock, A. K., Zweck, A. The emerging nanomedicine landscape. Nat. Biotechnol. 24, 1211-1218 (2006).
  6. Weissmüller, J., Newman, R., Jin, H., Hodge, A., Kysar, J. Theme Article - Nanoporous Metals by Alloy Corrosion: Formation and Mechanical Properties. Materials Research Society Bulletin. 34, 577-586 (2009).
  7. Erlebacher, J., Aziz, M., Karma, A., Dimitrov, N., Sieradzki, K. Evolution of nanoporosity in dealloying. Nature. 410, 450-453 (2001).
  8. Okman, O., Lee, D., Kysar, J. W. Fabrication of crack-free nanoporous gold blanket thin films by potentiostatic dealloying. Scripta Mater. 63, 1005-1008 (2010).
  9. Seker, E., Reed, M., Begley, M. Nanoporous Gold: Fabrication, Characterization, and Applications. Materials. 2, 2188-2215 (2009).
  10. Biener, J., et al. Size effects on the mechanical behavior of nanoporous Au. Nano Lett. 6, 2379-2382 (2006).
  11. Senior, N., Newman, R. Synthesis of tough nanoporous metals by controlled electrolytic dealloying. Nanotechnology. 17, 2311-2316 (2006).
  12. Zielasek, V., et al. Gold catalysts: Nanoporous gold foams. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 8241-8244 (2006).
  13. Wittstock, A., Biener, J., Bäumer, M. Nanoporous gold: a new material for catalytic and sensor applications. PCCP. 12, 12919-12930 (2010).
  14. Shulga, O., et al. Preparation and characterization of porous gold and its application as a platform for immobilization of acetylcholine esterase. Chem. Mater. 19, 3902 (2007).
  15. Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform. The Analyst. 133, 319-322 (2008).
  16. Seker, E., et al. The fabrication of low-impedance nanoporous gold multiple-electrode arrays for neural electrophysiology studies. Nanotechnology. 21, 125504 (2010).
  17. Seker, E., Berdichevsky, Y., Staley, K. J., Yarmush, M. L. Microfabrication-Compatible Nanoporous Gold Foams as Biomaterials for Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 1, 172-176 (2012).
  18. Okman, O., Kysar, J. W. Microfabrication of Nanoporous Gold. Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69 (2012).
  19. Lee, D., et al. Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale. Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).
  20. Seker, E., et al. The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures. Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).
  21. Parida, S., et al. Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying. Phys. Rev. Lett. 97, 35504-35506 (2006).

Tags

Bioengineering גיליון 77 ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית ביופיזיקה פיסיקה ננוטכנולוגיה ננו ביו טכנולוגיה מזעור זהב כתמים ותיוג טכניקות תרבית תאים מיקרוסקופיה מיקרוסקופ אלקטרונים הקרינה ננוטכנולוגיה סרטים דקים (תאוריה ותצהיר צמיחה) זהב Nanoporous תרבית תאים ניתוח תמונה microfabrication ננוטכנולוגיה immunochemistry כמותית מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מיקרוסקופ פלואורסצנטי הדפסת סטנסיל photolithography
Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daggumati, P., Kurtulus, O.,… More

Daggumati, P., Kurtulus, O., Chapman, C. A. R., Dimlioglu, D., Seker, E. Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies. J. Vis. Exp. (77), e50678, doi:10.3791/50678 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter