Summary
פרוטוקול למשלוח intraductal לא פולשנית של חומרים כימיים מימיים לבלוטת החלב בעכבר מתואר. השיטה מנצלת הזרקה מקומית לפטמות של בלוטות החלב מיקוד צינוריות החלב באופן ספציפי. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות ומולקולות קטנות.
Abstract
במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול, כדי לספק חומרים כימיים שונים לבלוטת החלב בעכבר באמצעות זריקות intraductal. משלוח סמים מקומי ולדפוק למטה של גנים באפיתל החלב כבר קשה להשיג בשל חוסר מיקוד המולקולות מתאימות שאינן תלויים בשלבי התפתחות, כמו הריון והנקה. בזאת, אנו מתארים טכניקה למסירה מקומית של חומרים כימיים לבלוטת החלב בכל שלב בבגרות באמצעות הזרקת intraductal לפטמות של עכברים. ניתן לבצע הזריקות בעכברים חיים, תחת הרדמה, ולאפשר אספקת סמים לא פולשנית ומקומית לבלוטת החלב. יתר על כן, ניתן לחזור על הזריקות במשך כמה חודשים מבלי לפגוע בפטמה. צבעים חיוניים כגון אוונס הכחול מועילים מאוד ללמוד את הטכניקה. על זריקת intraductal של הצבע הכחול, עץ ductal כל הופך לגלוי לעין. יתר על כן, חומרים כימיים שכותרתו fluorescently גם לאפשרהדמיה והפצה בתוך בלוטת החלב. טכניקה זו ניתנת להתאמה למגוון רחב של תרכובות כולל siRNA, תרופות כימותרפיות, ומולקולות קטנות.
Introduction
בלוטת החלב בעכבר מורכבת מעץ ductal-מכתשיים מורכבים המתכנס לתוך צינור מרכזי בפטמה. בעכברים, כמו גם בני אדם, רוב הגידולים בשד מקורם בתאי האפיתל המצפים את צינוריות החלב. טיפולים זמינים הנוכחיים כוללים כימותרפיה לוריד, קרינה, וניתוח. טיפולי intraductal מקומיים נחקרו 1-3 ומציעים יתרונות משמעותיים במונחים של השפעות רעילות וצד מופחתים. עם זאת, כמה אתגרים להישאר לפני אלה יכולים להיות מיושמים באופן נרחב יותר. היכולת לבצע הליכים דומים בבלוטת החלב בעכבר מאפשרת האפיון של התערבויות intraductal. כאן אנו מציגים שיטה לא פולשנית למשלוח של חומרים כימיים ישירות לתוך צינור החלב העכבר.
משלוח intraductal של תרופות כימותרפיות בשתי חולות סרטן השד ומודלי עכבר יש בעבר הוכח כיעיל ביותר ללא עדותרעילות מערכתית או histopathological לטווח ארוך משתנה 3-6. יתר על כן, הזרקה של תאי גידול ואספקת וקטור lentiviral של אונקוגנים הוכחו בעבר להיות ריאלי באמצעות הזרקת intraductal 7-10.
בנוסף למשלוח סמים, הליך זה הוא שימושי להשתקה מקומית של גנים בלוטת החלב באמצעות הזרקת intraductal של siRNA. הזרקה של כמויות קטנות של פתרון siRNA היא יעילה מבלי לשנות את האנטומיה ופיזיולוגיה של בלוטת החלב. במעבדה שלנו יש לנו לאחרונה הראו השתקה מוצלחת של גנים מתווך מרכזיים בעכברים הטרנסגניים כי באופן ספונטני לפתח גידולי החלב וכתוצאה מכך מניעת התקדמות גידול (ברוק ואח'., לא פורסם). אנחנו כבר מסוגלים לחזור על זריקות דו שבועיות לאותו פטמות עד 7 פעמים במרווחים של 2 שבועות ללא נזק לרקמות גלויות או רעיל.
יכולות להיות מתוזמן זריקות intraductal בעכבר בוגר כדי לטפל בdevelאירועי opmentally ספציפיים רלוונטיים להתפתחות בלוטת החלב במהלך הריון, הנקה, ופוף או למקד שלבים מאוחר יותר במהלך התפתחות גידול והתקדמות. נקבות בתולה צעירות כמו 8 שבועות של גיל כבר הזריקו הלא פולשני במעבדה שלנו.
Protocol
1. הכנת פתרון הזרקה
- הכן 0.2% צבע כחול אוונס בופר פוספט (PBS) או תמיסה מימית אחרת של עניין. צבע חיוני זה שימושי להערכת ההצלחה של זריקות intraductal והוא מומלץ כסיוע להדמיה בעת פיתוח מומחיות בטכניקה.
הנפח הנדרש יהיה תלוי במספר והמיקום של הבלוטות להיות מוזרק. כל 10 בלוטות החלב של נקבות עכברים ניתן להזריק אך בשל גודל הבלוטה הקטן יותר, זוגות בלוטת 1 ו -5 מוזרקים בדרך כלל עם 10 μl של פתרון. כל זוגות החלב אחרים מוזרקים עם 20 μl. כרכים אלה יש בם כדי למלא את עץ ductal כולו.
2. הכנה לפני ניתוח
- רשום את משקל הגוף של כל עכבר. כמו בכל המחקרים פרה, צריכים להיות במעקב משקולות בעלי החיים באופן קבוע (שבוע או יותר פעמיים) כדי להעריך את הרעילות פוטנציאלית.
- הרדימי מ 'האוז באמצעות תא isoflurane וליישם חומר סיכה העין. במהלך הליך עכברים ימשיכו להיות מורדמים באמצעות ריכוז 2-4% בשאיפה של isoflurane בחמצן באמצעות חרטומו. לפקח בזהירות את העכבר לשינויים בקצב נשימה, התאמת רמת isoflurane בהתאם.
- הזרק meloxicam (5-10 מ"ג / קילוגרם) תת עורי לפני ההליך כמו שיכוך כאבים.
- החל קרם להסרת שיער מעל לדלפק לאזור הפטמה. חכה 5 דקות ולהסיר בעדינות את שיער פזור עם המוליך כותנה קצה בתנועות מעגליות. הסר את הקרם באמצעות מגבות נייר לחות הרטובות עם מים חמים. גילוח אינו מומלץ בשל הסיכון לפגיעה בפטמות.
- אבטח את העכבר תחת stereoscope בעדינות על ידי מקליט את הגפיים.
- אתרי הזרקה נקיים עם מטליות אלכוהול.
3. הזרקת intraductal
- אתר פטמות מתאימות להיות מוזרקים תחת stereoscope. השתמש קנס מיקרו ביתור תינניותZers כדי להסיר כל עור מת שמכסה את הפתח הפטמה.
- טען 10-20 μl של פתרון הזרקה לתוך מזרק 50 μl עם מחט רכזת מתכת 33 G המודבק. לפעמים, לאחר הזרקה, כמויות קטנות (μl 1 או פחות) יכולות לדלוף החוצה של הפטמה על תלישת המחט. לכן, מומלץ להזריק 11 או 21 μl בהתאמה כדי להסביר את ההפסד הפוטנציאלי.
- להחזיק את הפטמה בעדינות עם פינצטה העדינה ולהרים אותו מעט כדי למקם אותו להזרקה. אין צורך לחתוך את הפטמה.
- להזריק את הפתרון לאט כדי למזער את הנזק אפשרי שנגרם על ידי נע במהירות נוזל בתוך לומן ductal. שיעור ההזרקה יש לשמור על כ 40 μl / min.
4. טיפול לאחר ניתוח
- שים לב באתר ההזרקה. לא צריך להיות שום סימנים של טראומה לאזור הפטמה או רקמות שמסביב. נפיחות באזור המקיף את הפטמה סבירה מצביעה Rathe הזרקת כרית שומן החלבr מאשר הזרקה intraductal מוצלחת.
- הסר את בעלי החיים מהחרטום ולעבור לכלוב נפרד להתאוששות. מניחים את הכלוב תחת מנורת חום כדי למנוע היפותרמיה ולסייע בהתאוששות. עכברים הם שוכנו ביחידים ויהיו תחת פיקוח הדוק עד שהם יחזרו להכרה וניידות.
5. ניתוח של רקמות בלוטת החלב
- עם השלמת המחקר, עכברים מורדמים על ידי נקע בצוואר הרחם הבא 2 CO גז דחוס בתא בידוד. בלוטות החלב הם נכרת ועשויות לשמש להכנת הר שלמה 11, היסטולוגיה, או RNA ובידוד חלבון.
Representative Results
הפטמות יכולות להיות מקומיות בקלות באמצעות סטראו פעם שיער הוסר באזור המקיף אותו (איור 1 א). כדי לשלוט בטכניקת ההזרקה, מומלץ להזריק צבע כחול אוונס ולפקח על התקינות של הבלוטה (איורים 1B ו-C). גישה זו מאפשרת גם לקביעת כמויות המתאימות להיות מוזרק לתוך כל בלוטה כאחד מבחינה ויזואלית יכול להעריך אם הצבע מגיע למערכת כולה ductal (1C דמויות ו2A). תמונה של התמונה הכחולה אוונס מוזרק לאחר מכן ניתן להשוות לרכוב כל בלוטת החלב, שבו עץ ductal כולו מוכתם בצבע אלום קרמיין (איור 2).
אנא שים לב כי חוסניו של שיטת הזרקה זה תלויים מאוד במפעיל. לדוגמא, ניקוב הצינור יגרום לזריקת כרית שומן החלב והזרקת הפתרון מהירה מדי עלולה לגרום נזק cel אפיתל ductalls ולעורר תגובה דלקתית. הזרקת intraductal מוצלחת מאפשרת משלוח הסמים המקומיים לבלוטת החלב ומפחיתה את תופעות הלוואי שאינם ספציפיות נצפו לעתים קרובות בדרך אחרת.
תמונה לדוגמה של בלוטה הוזרקה מתויגת fluorescently siRNA מיקוד cyclophilin (גנים שאינם חיוניים) מוצג באיור 3.
איור 1. בלוטת החלב מפשעתי מוזרקת דרך הפטמה עם צבע כחול אוונס. א) מראה של הפטמה לפני הזרקה ו-B) לאחר הזרקה עם 20 צבע כחול μl אוונס. אין נזק או נפיחות רקמות הוא ציין. C) עם הפתיחה בעור, הצבע מאפשר הדמיה של עץ ductal החלב כולו.
איור 2. כל הר הניתוח של אוונס הכחול בבלוטת jected. א) תמונה מייצגת של בלוטה גזור נכרתה מן החי והתפשטה על גבי זכוכית מייד לאחר הזרקה. ב ') מכתים הר שלם של אותו בלוטה עם צבע ארגמן לאחר שומן כבר פונתה. השוואה עם) מאשרת כי הפתרון המוזרק ממלא את עץ ductal החלב והבלוטה היא מבחינה אנטומית בשלמותה.
איור 3. תמונת משלוח intraductal של siRNA ניאון. נציג של דגימת רקמה טריות, נכרתה 48 postinjection שעה.
Discussion
עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט הם כלים רב ערך ללימוד תפקיד vivo של גנים בודדים בסרטן השד. עם זאת, זה יקר וכדי לייצר בעלי חיים אלה גוזלים זמן ומציאת הגן היא בדרך כלל בכל מקום שלעתים מונע אותנו מההכרה בהשפעות הספציפיות של גן, כי בבלוטת החלב. לכן, מציאה ממוקדת הייתי להקל על בעיות של תופעות לוואי שאינם ספציפיות ורעילות באיברים אחרים.
הזרקת intraductal של siRNA מוצגת כאן מאפשרת מציאה הגן המקומית בבלוטת החלב בעכבר. זוהי שיטה מהירה למשלוח תרופות ממוקדת ומקומי לבלוטת החלב אינו מוגבלת למשלוח siRNA. כגון משלוח סמים בלוטה ספציפית החלב ימנע תופעות לוואי נוקבות ורעיל לאיברים אחרים ומאפשר לחקר שינויים גנטיים בנקודות זמן ספציפיות במהלך התפתחות בלוטת החלב והיווצרות גידול סרטנית בשד. אין עדות לסיחלקיקי RNA בבלוטות שאינן מוזרקות, בכבד או באיברים אחרים המספקים ראיות נוספות לכך ששיטה זו מציגה דרך מועדפת למציאת גן מקומית בבלוטת החלב. יתר על כן, ניתן לחזור על זריקות intraductal שבועיות או דו שבועית במשך כמה חודשים, כדי לאפשר לניטור ארוך טווח של סוכנים טיפוליים.
טכניקה זו פותחת את האפשרות למנסה לאמוד את מסירת intraductal של חומרים כימיים שונים לצינוריות החלב בעכבר. התקדמות במשלוח מקומי במודלי עכבר מאופיינים היטב צריכה להאיץ את היישום של לא פולשנית, ממוקד אסטרטגיות טיפוליות בבני אדם.
Disclosures
יש הסופרים אין גילויים פיננסיים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות למייקל גולדברג להכנת פתרון siRNA התייצב והת'ר טובין לעזרתה עם בעלי החיים. מחקר זה מומן על ידי משרד ההגנה האמריקאי פרס ממציא W81XWH-08-1-0,659 לDEI. הכשרת דוקטורט של SK נתמכה על ידי קרן סוזן G קומן (KG101329). המחברים מבקשים להודות לקריסטין ג'ונסון להכנת סכמטי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | 2-4% | ||
| meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
| hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
| stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
| siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |
References
- Dooley, W. C., et al. Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer. J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).
- Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. Intraductal therapy for the prevention of breast cancer. Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).
- Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ. Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in mammary gland biology and breast cancer research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/ Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).
- Reddy, J. P., Li, Y. The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. , e2828 (2011).
