Intraductal Injection til Lokaliseret Drug Delivery til Mouse mælkekirtlerne

Summary

En protokol for non-invasiv intraductal levering af vandige reagenser til muse brystkirtel beskrevet. Metoden udnytter lokaliseret injektion i brystvorterne af mælkekirtlerne rettet brystkirtler kanaler specifikt. Denne teknik kan tilpasses til en række forskellige forbindelser, herunder siRNA, kemoterapeutiske midler og små molekyler.

Abstract

Heri beskriver vi en protokol til at levere forskellige reagenser til muse brystkirtel via intraductal injektioner. Lokaliseret drug delivery og knock-down af gener indenfor brystepitel har været svært at opnå på grund af manglen på egnede målsøgningsmolekyler der er uafhængige af udviklingsstadier såsom graviditet og amning. Heri beskriver vi en teknik til lokaliseret levering af reagenser til mælkekirtlen på noget tidspunkt i voksenalderen via intraductal injektion i brystvorterne af mus. Injektionerne kan udføres på levende mus under anæstesi, og giver mulighed for en ikke-invasiv og lokaliserede drug delivery mælkekirtlen. Derudover kan injektioner gentages over flere måneder uden at beskadige brystvorten. Vital farvestoffer såsom Evans Blå er meget nyttigt at lære teknikken. Ved intraductal injektion af det blå farvestof, bliver hele duktalt træet synlige for øjet. Endvidere fluorescerende mærkede reagenser også mulighed forvisualisering og spredning i mælkekirtler. Denne teknik kan tilpasses til en række forskellige forbindelser, herunder siRNA, kemoterapeutiske midler og små molekyler.

Introduction

Musen brystkirtel er sammensat af en kompleks ductal-alveolære træ, der konvergerer ind i en central kanal på brystvorten. I mus såvel som mennesker, de fleste af brysttumorer oprindelse i de epitelceller, der beklæder mælkekanalerne. Nuværende tilgængelige behandlinger omfatter intravenøs kemoterapi, strålebehandling, og kirurgi. Lokaliseret intraductal behandlinger er blevet udforsket ^1-3 og giver betydelige fordele i form af reducerede toksicitet og bivirkninger. Fortsat en række udfordringer Men før disse kan anvendes mere bredt. Evnen til at udføre lignende procedurer i muse brystkirtel letter karakterisering af intraductal interventioner. Her præsenterer vi en ikke-invasiv metode til levering af reagenser direkte i musen brystkirtler kanalen.

Intraductal levering af kemoterapeutiske midler i begge brystkræftpatienter og musemodeller er tidligere blevet vist at være yderst effektiv uden tegn påsystemisk toksicitet eller langvarig histopatologiske forandringer ^3-6. Endvidere har tumorcelleinjektion og lentivirusvektor levering af onkogener tidligere blevet vist at være mulig via intraductal injektion ^7-10.

Ud over drug delivery, denne fremgangsmåde er nyttig til lokal undertrykkelse af mælkekirtler gener gennem intraductal injektion af siRNA. Injektion af små mængder af siRNA løsning er effektiv uden at ændre anatomi og fysiologi af mælkekirtlen. I vores laboratorium har vi for nyligt vist vellykket undertrykkelse af nøglemediator gener i transgene mus, som spontant udvikler brysttumorer resulterer i forebyggelse af tumorprogression (Brock et al. Upubliceret). Vi har været i stand til at gentage hver anden uge injektioner i samme brystvorter op til 7 gange i 2-ugers intervaller uden synlige vævsskader eller toksicitet.

Intraductal injektioner kan være timet i en voksen mus til at løse udvikopmentally-specifikke begivenheder relevante for mælkekirtlerne udvikling under graviditet, amning, og involution eller at målrette senere stadier i løbet af tumor udvikling og progression. Virgin hunner så unge som 8 uger er blevet injiceret non-invasivt i vores laboratorium.

Protocol

1.. Fremstilling af injektionsopløsning

1. Forbered 0,2% Evans blåt farvestof i phosphatbufret saltvand (PBS) eller en anden vandig opløsning af interesse. Denne vital farvestof er nyttig til at vurdere succes intraductal injektioner og anbefales som en visualisering hjælp, når de udvikler ekspertise inden for teknik.

Den nødvendige mængde vil afhænge af antallet og placeringen af ​​kirtler, der skal injiceres. Alle 10 mælkekirtler hunmus kan injiceres, men på grund af den mindre størrelse kirtel er kirtel par 1 og 5 indsprøjtes typisk med 10 ml af opløsningen. Alle andre brystkirtler par injiceres med 20 ul. Disse mængder er tilstrækkelig til at fylde hele duktalt træet.

2. Præoperativ forberedelse

1. Optag kropsvægt hver mus. Som med alle prækliniske undersøgelser, bør animalske vægte blive overvåget regelmæssigt (to gange om ugen eller mere) for at vurdere potentielle toksicitet.
2. Bedøve mOuse hjælp af en isofluran kammer og anvende eye smøremiddel. Under proceduren mus vil fortsat blive bedøvet ved hjælp af inhalation koncentration 2-4% isofluran i oxygen via en næse kegle. Overvåge forsigtigt musen for ændringer i respirationsfrekvens, justere niveauet for isofluran i overensstemmelse hermed.
3. Injicer meloxicam (5-10 mg / kg) subkutant forud for proceduren som analgesi.
4. Påfør en over-the-counter hårfjerning creme til brystvorten området. Vent 5 minutter og forsigtigt fjerne løse hår med en bomulds-spids applikator med en cirkulær bevægelse. Tag cremen med fugtige papirservietter fugtet med varmt vand. Barbering kan ikke anbefales på grund af risikoen for at beskadige brystvorterne.
5. Fastgør musen under Stereoskopet ved forsigtigt at tape ned ekstremiteterne.
6. Clean injektionssteder med alkoholkompresser.

3. Intraductal injektion

1. Find passende brystvorter til at blive injiceret under Stereoskopet. Brug fine mikro-dissekere tweeZers at fjerne eventuelle døde hud, der dækker brystvorten åbning.
2. Load 10-20 ul injektion opløsning i en 50 ul sprøjte med en 33 G metal hub nål påsat. Undertiden efter injektion, kan små mængder (1 gl eller derunder) sive ud af sutten efter trækker nålen ud. Derfor anbefales det, at injicere 11 eller 21 pi henholdsvis at redegøre for det potentielle tab.
3. Hold brystvorten forsigtigt med de fine pincet og løft det lidt for at placere den til injektion. Det er ikke nødvendigt at skære brystvorten.
4. Injicer opløsningen langsomt for at minimere potentielle skade ved hurtigt at flytte væske inden for de duktale lumen. Injektionen bør hastigheden på cirka 40 ul / min.

4.. Postoperativ pleje

1. Overhold injektionsstedet. Der bør ikke være nogen tegn på traumer til brystvorten region eller omgivende væv. Hævelse i området omkring brystvorten sandsynligvis indikerer en yverfedt pad injektion rather end en vellykket intraductal injektion.
2. Fjern dyret fra næsekeglen og flytte til et separat bur til nyttiggørelse. Placer bur under en varmelampe for at forhindre hypotermi og hjælpe i bedring. Mus er opstaldet enkeltvis, og vil blive fulgt nøje, indtil de genvinder bevidstheden og mobilitet.

5.. Analyse af mælkekirtelvævet

1. Ved afslutningen af undersøgelsen, mus aflivet ved cervikal dislokation efter CO _{2-komprimeret} gas i en isolation kammer. Mælkekirtler er udskåret og kan anvendes til hele mount fremstilling ^11, histologi eller RNA og protein isolation.

Representative Results

Brystvorterne kan nemt lokaliseres ved hjælp af et stereomikroskop, når håret er fjernet i området omkring det (figur 1A). At beherske den injektionsteknik, anbefales det at injicere Evans blåt farvestof og overvåge integriteten af overdelen (figur 1B og C). Denne fremgangsmåde giver også mulighed for bestemmelse af passende mængder, der skal injiceres i hver kirtel som man visuelt kan vurdere, om farvestoffet når hele gangsystemet (figur 1C og 2A). Et billede af den injicerede Evans blue billede kan derefter sammenlignes for hele monteret brystkirtel, hvor hele duktalt træet er farvet med Carmine alun farvestof (figur 2B).

Bemærk venligst, at robustheden af ​​denne injektion metode er meget afhængig af operatøren. For eksempel vil perforere kanalen resultere i en brystkirtel fedtpude injektion og injicere opløsningen for hurtigt kan beskadige duktale epitel CELls og provokere en inflammatorisk reaktion. Vellykket intraductal indsprøjtning muliggør lokaliseret drug delivery til mælkekirtlerne og reducerer uspecifikke bivirkninger ofte observeret andet.

Et eksempel billede af en kirtel injiceret med fluorescens-mærkede siRNA rettet cyclophilin (en ikke-essentielt gen) er vist i figur 3..

Figur 1. En lyskebrok brystkirtel indsprøjtes gennem niplen med Evans-blåt farvestof. A) Udseende af brystvorten før injektion og B) efter injektion med 20 pi Evans blåt farvestof. Der observeres ingen hævelse eller vævsskade. C) Efter åbning huden, farvestoffet tillader visualisering af hele brystkirtler duktalt træet.

Figur 2. Whole-mount analyse af Evans blåt iProjected kirtel. A) repræsentant billede af en dissekeret kirtel udskåret fra dyret, og spredt på et objektglas straks efter injektion. B) Whole mount farvning af samme kirtel med carmin farvestof efter fedt var blevet ryddet. Sammenligning med A) bekræfter, at den injicerede løsning fylder brystkirtler duktalt træet og kirtel er anatomisk intakt.

Figur 3. Intraductal levering af fluorescerende siRNA. Repræsentant billede af frisk vævsprøve, fjernet 48 timer efter injektion.

Discussion

Transgene og knockout-mus er uvurderlige værktøjer til at studere in vivo rolle enkelte gener i brystkræft. Men det er dyrt og tidskrævende at generere disse dyr og genet knockdown er normalt allestedsnærværende som undertiden udelukker os fra at anerkende de konkrete virkninger af denne gen på mælkekirtler. Derfor vil en målrettet knockdown lindre spørgsmål af ikke-specifikke bivirkninger og toksicitet i andre organer.

Den intraductal injektion af siRNA præsenteres her muliggør lokaliseret genet knockdown i muse brystkirtel. Det er en hurtig fremgangsmåde til en målrettet og lokaliserede drug delivery mælkekirtlen ikke begrænset til siRNA levering. Sådan en brystkirtel-specifik drug delivery undgår uspecifikke bivirkninger og toksicitet til andre organer og giver mulighed for undersøgelse af genændringer på bestemte tidspunkter i løbet af mælkekirtlen udvikling og brysttumor-dannelse. Der er ingen tegn på siRNA-partikler i ikke-injicerede kirtler, leveren eller andre organer med yderligere beviser for, at denne fremgangsmåde viser en foretrukken måde til lokaliseret gen knockdown i mælkekirtlen. Endvidere kan intraductal injektioner gentages ugentligt eller hver anden uge i løbet af flere måneder for at give mulighed for langsigtet overvågning af terapeutiske midler.

Denne teknik åbner mulighed for analyse af intraductal levering af forskellige reagenser muse mamma-kanalerne. Fremskridt i lokaliseret levering i velkarakteriserede musemodeller bør fremskynde anvendelsen af ​​non-invasive, målrettede terapeutiske strategier hos mennesker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane			2-4%
meloxicam			5-10 mg/ml
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129-10G	0.2% in PBS
hair removing cream	Veet		Choose sensitive option
stereoscope	Zeiss	Stemi DV4
micro-dissecting tweezers	Roboz	rs-4976	With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar
Hamilton syringe	Hamilton	7637-01
33-gauge needle	Hamilton	7803-05	point style 4, 12 degree bevel (standard)
siGLO cyclophilin B control siRNA	Dharmacon	D-001610-01-05