Summary
Vetweefsel (AT) is een site van intense immuun cel activatie en interactie. Vrijwel alle cellen van het immuunsysteem aanwezig zijn in AT en hun verhoudingen worden veranderd door obesitas. Goede isolatie, kwantificering en karakterisering van AT immuuncelpopulaties zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van hun rol in immunometabolic ziekte.
Abstract
De ontdekking van verhoogde macrofaag infiltratie in het vetweefsel (AT) zwaarlijvige knaagdieren en mensen heeft geleid tot een intensivering van belang immuuncel bijdrage aan de lokale en systemische insulineresistentie. Isolatie en kwantificering van verschillende immuuncelpopulaties in magere en zwaarlijvige AT is nu een algemeen gebruikte techniek immunometabolism laboratoria Nog uiterste voorzichtigheid geboden zowel in stromale vasculaire cel isolatie en in de flowcytometrie-analyse, zodat de verkregen gegevens betrouwbaar en interpreteerbaar . In deze video laten we zien hoe je gehakt, verteren, en isoleren van de immuun cel-verrijkte stromale vasculaire fractie. Vervolgens laten we zien hoe antilichaam label macrofagen en T-lymfocyten en hoe goed gate op hen in flowcytometrie experimenten. Vertegenwoordiger flowcytometrie percelen van vetarm gevoede mager en vetrijke gevoede zwaarlijvige muizen worden verstrekt. Een essentieel element van deze analyse is het gebruik van antilichamen die welniet fluoresceren in kanalen waar AT macrofagen van nature autofluorescent, alsmede het gebruik van de juiste compensatie controles.
Introduction
Historisch gezien, heeft het vetweefsel (AT) is bekeken als een inerte orgaan van lipide opslag, die uit en krimpt in reactie op de energiebalans. We begrijpen nu dat AT staat voor een dynamische endocrien orgaan dat actief scheidt een aantal hormonen, die rechtstreeks van invloed eetgedrag en systemische glucose-homeostase. Bovendien, de afgelopen tien jaar is er een toenemende appreciatie voor vele populaties van immuuncellen die in de AT stromale vasculaire fractie (SVF), en hun bijdrage aan AT homeostase.
De mogelijkheid om het scheiden AT adipocyten en SVF met een collagenase digestie gevolgd door differentiële centrifugatie werd eerst beschreven door Rodbell in 1964 1. Collagenase II wordt het meest gebruikt voor adipocyten en SVF scheiding vanwege onderhoud van adipocyten insulinereceptoren 1. Vroeg op, enzymatische fractionering van AT werd voornamelijk gebruikt om adipo studerenCyte metabolisme en preadipocytes isoleren. Meer recent is deze techniek, in combinatie met de ruime beschikbaarheid van flowcytometers en de steeds toenemende aantal commercieel beschikbare fluorofoor-geconjugeerde antilichamen, vergemakkelijkt de karakterisering van AT immuuncellen.
Hoewel de aanwezigheid van immuuncellen in ontstoken AT eerder beschreven 2, de rudimentaire papers door Weisberg et al.. en Xu et al.. gepubliceerd in 2003 waren de eerste om de accumulatie van AT macrofagen (ATM) in obesitas, waarbij inflammatoire cytokines uitscheiden en correleren met AT-specifieke en systemische insulineresistentie 3,4 documenteren. Deze waarnemingen diende als basis van een nieuw gebied van onderzoek onlangs bedacht, "immunometabolism," 5 en werden opgevolgd door studies wat impliceert diverse immuuncelpopulaties, waaronder dendritische cellen 6, mestcellen 7, T-cellen 8 -10, B-cellen 11, NKT cellen 12, 13 eosinofielen en neutrofielen 14,15 in de ontwikkeling van obesitas geassocieerd insulineresistentie.
Het doel van dit artikel is een gedetailleerde beschrijving van de collagenase digestie techniek om cellen van het AT SVF isoleren en karakteriseren geldautomaten en AT T cellen via flowcytometrie verschaffen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor muis AT, maar kunnen kijkers genieten van het lezen van een uitstekend artikel verstrekken van uitgebreide informatie over optimalisatie van deze techniek voor menselijke AT 16. De doelgroep van dit artikel bevat de onderzoekers met een beperkte ervaring in het werken met de muis AT en het uitvoeren van flowcytometrie. Een aantal praktische overwegingen voor het balanceren van cellulaire opbrengst en rentabiliteit, tijd en middelen worden verstrekt, alsmede een optimale flowcytometrie controles gepresenteerd voor het karakteriseren van AT immuuncelpopulaties. In aanvulling op ons protocol, lezers zijn referred een recent artikel van Jupiter Basu et al.. een goede bespreking van enkele van de technische aspecten van flowcytometrie passende controles en vergoedingen 17 omvatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagentia en benodigdheden
Voorafgaand aan de behandeling van dit experimenteel protocol, de voorbereiding van de volgende reagentia:
- 70% ethanol
- 1X PBS
- 1X DPBS (zonder Ca en Mg) aangevuld met 0,5% BSA
- FACS buffer: 1X DPBS (zonder Ca en Mg), 2 mM EDTA en 1% FCS
- ACK buffer: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, en 0,1 mM Na 2 EDTA in water
2. Oogst en bereiding van Vetweefsel
- Euthanaseren muizen volgens IACUC-goedgekeurde procedures van elke instelling.
- Goed nat de vacht met 70% ethanol.
- Maak een insnijding op het niveau van het zwaardvormig proces (onderste deel van het borstbeen) en open de borstholte om het hart bloot te leggen, zorg ervoor dat u geen grote bloedvaten te verbreken.
Opmerking: Op dit punt is het ook nuttig om zoveel als het membraan intact te latenmogelijk en een inkeping snijden van de rechterkant van de ribbenkast om bloed te laten en perfusaat te stromen van de borstholte.
- Klem de rechterboezem om bloed te laten en perfusaat om de bloedsomloop te ontsnappen.
Opmerking: Bij de behandeling van obese muizen, overtollige pericardiale AT moet mogelijk worden verwijderd om toegang tot het hart mogelijk te maken.
- Pak het hart met een tang en steek voorzichtig een naald in de linker ventrikel via de apex. Langzaam perfuseren de muis met 15 ml steriele PBS.
Opmerking: Verminder de snelheid van de perfusie als de longen beginnen te vullen en uit te breiden.
- Open de buikholte en verwijder de perigonadal vetkussentjes met zorg aan elke gonadale weefsels te voorkomen.
- Plaats vetkussentjes in een weeg boot op het ijs met 2 ml 1X DPBS (zonder Mg of Ca) aangevuld met 0,5% BSA, en gehakt de AT in fijne stukjes.
NB: Beperk de hoeveelheid AT per weeg boot naar 1,2 g. Indien het bedrag van AT dan 1,2 g, verdeel het gelijkmatig tussen twee wegen boten.
- Houd AT monsters op ijs en bereiden 3 ml collagenase analyseoplossing per AT steekproef bestaande uit 1X DPBS aangevuld met 0,5% BSA, 10 mM CaCl2, en 4 mg / ml collagenase, type II.
3. Collagenase Spijsvertering
- Overdragen AT tot 50 ml conische buizen door het gieten van het homogenaat en spoelen de wegen boot met 1 ml DPBS (0,5% BSA) en 3 ml collagenase II analyseoplossing.
- Incubeer AT homogenaat in een roterende schudinrichting (200 opm) bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
- Voeg 10 ml DPBS (0,5% BSA) om conische buizen en plaats op ijs.
- Vermaal gelijkmatig verdelen en vele malen met behulp van een 10 ml serologische pipet, en passeren celsuspensies door 100 urn filter in een nieuwe 50 ml conische buis.
- Centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 & deg; C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer SVF cel pellet in 3 ml ACK buffer te lyseren verontreinigende erytrocyten.
- Voeg 12 ml FACS buffer en centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer SVF cel pellet in FACS-buffer.
Opmerking: Gebruik de omvang van de celpellet als leidraad voor hoeveel FACS buffer resuspenderen inch Als de celpellet omvat de bodem van de 50 ml conische buis, gebruikt 0,5-1 ml FACS buffer; anders resuspendeer in 0.25-0.5 ml.
- Leg monsters op ijs en bereiden 1:10 verdunning aliquots van elk monster voor tellen van cellen door het mengen 40 pi FACS-buffer, 50 pi trypan blauwe oplossing (0,2%) en 10 pi celsuspensie.
- Telling levensvatbare cellen op basis van trypan blauw exclusie en verdunde celsuspensies tot een eindconcentratie van 5-10 x 10 6 cellen / ml.
4. Kleuring van celoppervlak antigenen
Opmerking: Als voorbeeld, bij de berekening van het percentage geldautomaten basis F4/80 en CD11b, de volgende compensatie en FMO controles moeten worden bereid:
- Ongekleurde (cellen)
- DAPI of propidiumjodide (PI) enkele vlek (cellen; niet levensvatbaarheid kleurstof toe totdat punt 5.1)
- F4/80 APC enkele vlek (cellen of compensatie kralen)
- CD11b FITC enkele vlek (cellen ofcompensatie kralen)
- FMO 1 (cellen): Rat IgG2a κ isotypecontrole APC + CD11b FITC + levensvatbaarheid kleurstof (toegevoegd in stap 5.1)
- FMO 2 (cellen): F4/80 APC + Rat IgG2b κ isotype controle FITC + levensvatbaarheid kleurstof (toegevoegd in stap 5.1)
- Voeg fluorofoor geconjugeerde primaire antilichamen en / of isotype controles aan de geschikte concentratie (zie tabel van reagentia en materialen).
- Bescherm tegen licht monsters en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg 2 ml FACS buffer en centrifugeer celsuspensie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Decanteer supernatant en resuspendeer SVF cel pellet in 2 ml FACS buffer.
- Centrifugeer celsuspensie 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en resuspendeer SVF celpellet in ≥ 400 ul FACS-buffer.
- Overdragen monsters tot 12 x 75 mm polystyreen ronde bodem buizen voorzien van een 35 um cel zeef buis tops.
- Beschermen tegen licht, en bewaar monsters bij 4 ° C tot FACS-analyse.
Opmerking: Voor optimale resultaten immeadiately cellen worden geanalyseerd, maar FACS analyse met dit protocol met succes uitgevoerd op gelabelde cellen opgeslagen in FACS buffer gedurende 1-2 uur bij 4 ° C. Als cellen moeten worden bevestigd aan opslagtijd verhogen, beschrijfbaar cellen met 2% paraformaldehyde bij 4 ° C worden vastgesteld voor 24 uur voorafgaand aan FACS-analyse. Antilichaam bedrijven suggereren dat gelabelde cellen kunnen worden bewaard gedurende een week, maar dit niet binnen het kader van deze procedure getest.
5. FACS analyse
- Voorafgaand aan FACS-analyse, voeg levensvatbaarheid kleurstof aan samples en adequate controles om te zorgen voor levende / dode discriminatie cel.
Opmerking: Tal levensvatbaarheid kleurstoffen zijn commercieel verkrijgbaar, maar DAPI en PI aanbevolen naargelang de excitatie / emissie profiles van het fluorofoor-geconjugeerde antilichamen gebruikt. DAPI en propidiumjodide toegevoegd aan elk monster bij een eindconcentratie van 0,2 mg / ml.
- Gebruik een ongekleurde negatieve controle monster, bij voorkeur cellen geïsoleerd uit hetzelfde weefsel als de experimentele monsters, om zijwaartse verstrooiing (SSC) en voorwaartse verstrooiing (FSC) aan te passen, zodat de cel populatie (s) van belang zijn op schaal.
Opmerking: Voor de analyse van AT SVF-cellen, is het aanbevolen dat SSC worden weergegeven in een log-schaal versus FSC in een lineaire schaal. Het gebruik van een log-schaal SSC is vooral belangrijk bij het analyseren geldautomaten, vaak zeer groot en korrelig.
- Teken een eerste lichtverstrooiing poort op basis van het type cel (s) wordt geanalyseerd, en pas de fotomultiplicatorbuis (PMT) winst, zodat de ongekleurde cellen zijn aan de linkerkant van een single-parameter histogram (ongeveer gecentreerd op 10 2) voor de juiste kanalen. </ Li>
Opmerking: Het wordt aanbevolen om lymfocyten en macrofagen (of andere myeloïde cellen) afzonderlijk geanalyseerd door verschillen in autofluorescentie.
- Gebruik enkele gebrandschilderde controles of antilichaam-capture compensatie kralen om multi-color compensatie uit te voeren.
Opmerking: het gebruik van de compensatie korrels wordt aanbevolen, maar moet verenigbaar elk antilichaam worden gewaarborgd. Bijvoorbeeld compensatie korrels kunnen geen kruisreactie met konijn antilichamen, waarbij geïsoleerde cellen van een passend enkele vlek zeggenschap verkrijgen.
- Stel experimentele poorten op basis van gemodificeerde FMO controles.
- Stel de flowcytometer het juiste aantal gebeurtenissen gebaseerd op de prevalentie van de bevolking plaats verzamelt en registreert experimentele data.
- Export FCS gegevensbestanden voor offline analyse. Er zijn tal van programma's beschikbaar voor flow cytometry data-analyse. Wij raden Cytobank, een web-based platform waarmee investigatores opslaan en analyseren van gegevens en het genereren van afbeeldingen vanaf elke computer met toegang tot internet 18. Daarnaast Cytobank biedt de mogelijkheid om gegevens publiek toegankelijk te maken of toegang tot medewerkers te beperken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Collagenase digestie van AT gevolgd door differentiële centrifugering werd gebruikt om de SVF isoleren van epididymale vetkussentjes van mannelijke C57BL/6J muizen een laag vetgehalte (10% kcal vet) of hoog vetgehalte (60% kcal vet) dieet (LFD en HFD respectievelijk) gedurende 16 weken. Cellen van de SVF werden vervolgens gemerkt met fluorofoor geconjugeerde primaire antilichamen het percentage levensvatbare geldautomaten (figuur 1) en AT T-cellen (figuur 2) via FACS analyse kwantificeren. Initiële gating, waaronder lichtverstrooiing, discriminatie doublet, en levensvatbaarheid poorten zijn afgebeeld in de figuren 1A en 2A. Er zij op gewezen dat de eerste lichtverspreiding poort in figuur 2A is beperkt tot de lymfocyt populatie om te voorkomen waaronder autofluorescent myeloïde cellen. Een voorbeeld van het gebruik van gemodificeerde FMO controlemiddelen om experimentele poorten instellen wordt afgebeeld in figuur 1B. In dit voorbeeld is de F4/80 (linkerkolom) en CD11b (rechterkant) antilichamen zijn vervangen door een passende isotype controles vertegenwoordigen autofluorescentie en aspecifieke binding. Kwadrant poorten worden dan aangetrokken om te identificeren levensvatbare geldautomaten (F4/80 + CD11b +). Gating voor CD4 + en CD8 + AT T-cellen is getoond in figuur 2B. Levensvatbare AT lymfocyten zijn eerste gated voor TcR (linkerkolom). Vervolgens TcR + AT T cellen gated voor CD4 en CD8 (rechterkant).
Figuur 1. Vetweefsel macrofagen. De SVF werd geïsoleerd uit de epididymis AT van mannelijke C57BL/6J-muizen gevoed met een laag vetgehalte of een hoog vet dieet voor 16 weken met behulp van de collagenase digest-protocol. Vervolgens werden de cellen gekleurd voor SVF F4/80 en CD11b en FACS-analyse werd uitgevoerd met een flow cytometer geldautomaten identificeren. (A) Eerste lichtverstrooiing en levensvatbaarheid poorten. (B) Modified FMO beheert opnemen isotype antilichamen voor F4/80 en CD11b werden gebruikt om te lijnen kwadrant poorten. (C) vergelijking van het aandeel van F4/80 + CD11b + geldautomaten van de AT van laag vetgehalte en hoog vet gevoede muizen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Vetweefsel T-cellen. De SVF werd geïsoleerd uit de epididymis vetweefsel van mannelijke C57BL/6J-muizen gevoed met een laag vetgehalte of een hoog vet dieet voor 16 weken met tHij collagenase digest-protocol. Vervolgens werden de cellen gekleurd voor SVF TcR, CD4 en CD8a en FACS-analyse werd uitgevoerd met een flow cytometer te karakteriseren AT T cellen. (A) Eerste lichtverstrooiing en levensvatbaarheid poorten. (BC) Vergelijking van het percentage TcR + T-cellen (linker kolom) en CD4 + en CD8 + T-cellen (rechterkant) van de AT van (B) laag vetgehalte en (C) hoog vet gevoede muizen. hier bekijk grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toenemende interesse in de functie van het immuunsysteem in de metabole gevolgen van obesitas heeft geleid tot het wijdverbreide gebruik van flowcytometrie om immune cellen van de AT karakteriseren. Hoewel het exacte protocol zal variëren tussen laboratoria op basis van hun eigen ervaring en beschikbare apparatuur, de kritische stappen omvatten collagenase spijsvertering, differentiële centrifugatie, en celoppervlakantigeen etikettering. Het doel van dit artikel is om een gedetailleerd protocol en praktische gids voor de isolatie van de AT SVF te verstrekken aan onderzoekers met een beperkte ervaring in het werken met AT en / of het uitvoeren van flowcytometrie.
Zoals bij elke experimentele techniek zijn er talrijke variaties die al dan niet significant beïnvloeden het gewenste resultaat. Gebaseerd op onze ervaring, het protocol gedetailleerde hierin vertegenwoordigt de meest efficiënte afweging tussen tijd, middelen, cellulaire opbrengst, en levensvatbaarheid van de cellen. Zo hebben wij gevonden dat het verhogen van deduur van collagenase II digestie wel 60 min bij vergelijkbare concentraties van collagenase een verwaarloosbaar effect op de cellulaire opbrengst, dus gebruiken we een 20 minuten ontsluiting om de blootstellingsduur collagenase verminderen. Collagenase II is de meest gebruikte collagenase vetweefsel ontsluitingen. Een beschrijving van alle verschillende collagenasen en hun belangrijkste toepassingen zijn te vinden op de website van Sigma's. Typische cellulaire opbrengsten uit de bovenstaande protocol zijn 2-3 x 10 6 en 4-5 x 10 6 cellen / g AT van muizen gevoed een laag vetgehalte (10% kcal uit vet) en een hoog vetgehalte (60% kcal uit vet) dieet voor 16 weken respectievelijk. Naast verschillende collagenase digestie tijden, zijn er een aantal mogelijke wijzigingen in het huidige protocol afhankelijk van het experimentele model gebruikt, waaronder dieetbehandeling. Ten eerste, bij het oogsten van AT van muizen die een dieet verrijkt voor cholesterol of verzadigde vetzuren, vermijden om de monsters op ijs voorafgaand aan hakken, omdat de AT zal stollen en maakt hakken moeilijk. Ten tweede, ons protocol bevat een erytrocyten lysis stap (3.6), maar een succesvolle eerste perfusie vaak maakt deze stap overbodig. Ten derde, zorg moet worden genomen om meer dan 10 mM van de collagenase analyseoplossing (5 mM eindconcentratie) niet toevoegen CaCl2; meer calcium concentraties kan de vorming van een calciumfosfaat precipitaat. Als deze neerslag vormt na de eerste centrifugatiestap (3.5), voeg twee wasstappen met 20 ml FACS-buffer (bevattende EDTA) voordat erytrocyt lysis stap om het neerslag te verwijderen. Ten vierde, adviseren wij dat de onderzoekers gebruiken minstens een hele perigonadal vet pad wanneer het isoleren van de SVF. Wij maken deze aanbeveling niet vanwege beperkingen in cellulaire opbrengst, maar omdat diverse celpopulaties weer verschillende regionale verdelingen 19. Zo kunnen de resultaten een vertekend beeld geven wanneer slechts een gedeelte van de perigonadal vet pad is onsed aan immuuncellen die in de AT isoleren. Als de hele dikke pad is groter dan 1,2 gram, verdeel het vetweefsel lengterichting van de rostrale tot caudale uiteinden. Als gehalveerd zou aldus elke helft een vertegenwoordiger populatie van cellen en moet in het algemeen minder dan 1,2 gram. In het geval dat nog meer dan 1,2 gram, aanbevolen uitvoeren collagenase vertering van 1,2 gram segmenten in afzonderlijke buisjes en vervolgens combineren van al het SVF cellen voor flowcytometrie. Bovendien, voor magere muizen, kan het nodig zijn vetkussentjes combineren van 2 of 3 muizen SVF voldoende cellen te verkrijgen voor de stroom cytometrische analyse. De behoefte aan extra muizen moet rekening houden bij het ontwerpen van experimenten. Tot slot, een andere manier om de gegevens weer te geven is het aantal cellen per gram weefsel. Als celdichtheid gewenst is, moet het AT worden gewogen voordat gehakt en de spijsvertering.
Met betrekking tot het karakteriseren AT SVF cellen via flowcytometrie tweepunten moeten worden benadrukt. Eerst moeten alle fluorofoor geconjugeerde primaire antilichamen worden gevalideerd voor gebruik met AT SVF-cellen en behoren getitreerd. Hoewel we aangetoond compensatie met kralen, hadden we eerder getitreerd deze antilichamen met AT SVF. Wanneer het karakteriseren van de macrofagen, raden wij tegen het gebruik van tandem kleurstoffen (bijv. PE-Cy7), zoals we hebben gemengde resultaten met betrekking tot niet-specifieke binding van de geldautomaten bij het gebruik van antilichamen geconjugeerd aan deze kleurstoffen gehad. Daarnaast moet fluoroforen zoals PE en FITC alleen na zorgvuldige titratie zoals hierboven beschreven. Een lijst van specifieke antilichamen we gebruikt te karakteriseren AT SVF-cellen samen met de aanbevolen concentraties worden gevonden in de in Tabel 1. Ten tweede, omdat de geldautomaten vertonen sterke autofluorescentie en een aantal antistoffen weer een laag niveau van de niet-specifieke binding wanneer gebruikt bij een hoge concentratie, adviseren wij het gebruik van gemodificeerde FMO controlemiddelen om experimentele poorten instellen.FMO controles worden gegenereerd door kleuring een reeks controlemonsters met maar een van de antilichamen gebruikt voor het merken experimentele monsters 20. We hebben de FMO controles gemodificeerd ons protocol voor een van de antilichamen te vervangen door een geschikte fluorofoor geconjugeerd isotype controle plaats van simpelweg verwijderen. In de praktijk kan het aanvaardbaar FMO controles af te zien op antilichamen die uitzonderlijke scheiding tussen positieve en negatieve bevolkingen. Naast deze controles, zal je merken dat voorafgaand aan gating op de antilichamen, we preselectie voor de lymfocyt en macrofaag populatie op basis van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing. Hierdoor wordt de detectie van autofluorescente macrofagen elimineren wanneer de analyse lymfocyt populaties met fluoroforen zoals FITC en tandem kleurstoffen.
Hoewel gedetailleerde protocollen vallen buiten het bestek van dit artikel, de isolatie techniek beschreven dient als een belangrijke eerste stap voor tal van technieken die gericht zijn op tekensterizing immuuncellen die in het AT. Zo kunnen de bovengenoemde isolatie en kleuring protocol worden gebruikt sorteren van specifieke populaties waaruit mRNA kan worden geïsoleerd om genexpressie te analyseren vergemakkelijken. Bovendien kunnen eenvoudige aanpassingen aan het protocol worden om ex vivo behandeling van geldautomaten mogelijk. Dergelijke modificaties zijn onder meer het gebruik van steriele technieken om de SVF, die vervolgens tweemaal worden gewassen en opnieuw gesuspendeerd in een geschikt celkweekmedium te verkrijgen. In plaats van het toevoegen van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen tegen celoppervlak antigenen vlek, kan SVF worden toegevoegd met niet behandelde weefselkweekplaten te verrijken voor geldautomaten via plastic hechting (hoewel dit niet kan worden beweerd dat een zuivere populatie fibroblasten en preadipocyten kunnen hechten worden ). Dit wordt bereikt door het kweken van de SVF gedurende 2-4 uur bij 37 ° C gevolgd door twee wasstappen om niet-hechtende cellen te verwijderen. Geldautomaten kan dan dienovereenkomstig worden behandeld en geoogst met behulp van een EDTA-gebaseerde mobiele dissociatie zoOplossing voor flowcytometrie of gelyseerd in Trizol of RIPA buffer voor de isolatie van RNA of eiwit. Ongeacht de downstream toepassing, de collagenase digest techniek voor het isoleren van adipocyten en SVF cellen eerst beschreven door Rodbell in 1964 1 blijft een waardevol instrument voor de karakterisering van AT immuuncellen en hun bijdrage aan de metabole gevolgen van obesitas zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
JSO wordt ondersteund door een NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), wordt AK ondersteund door een Postdoctoraal Fellowship van de American Diabetes Association (7-10-MI-05), en AHH wordt ondersteund door een American Heart Association Established Investigator Award (12EIA8270000). Flow cytometrie experimenten werden uitgevoerd in de VMC flowcytometrie gedeelde bronnen. De VMC flowcytometrie gedeelde middelen wordt ondersteund door de Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E.
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
