Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Published: November 26, 2013 doi: 10.3791/50733
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

Summary

Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming van kleine moleculen, protocollen voor het gebruik van DT voor de MALDI beeldvorming van endogene lipiden op de oppervlak van het weefsel secties door positieve-ion MALDI-MS op een ultrahoge resolutie quadrupool-FTICR instrument worden hier gegeven.

Abstract

Massaspectrometrie imaging (MSI) bepaalt de ruimtelijke lokalisatie en verspreidingspatroon van verbindingen op het oppervlak van een weefselsectie, meestal via MALDI (matrix-assisted laser desorptie / ionisatie) gebaseerde analytische technieken. Nieuwe matrices voor kleine moleculen MSI, die de analyse van laag molecuulgewicht (MW) verbindingen verbeteren nodig. Deze matrices moeten verhoogde analyt signalen te bieden, terwijl het verminderen van MALDI achtergrond signalen. Bovendien, het gebruik van ultrahoge resolutie instrumenten, zoals Fourier transform ion cyclotron resonantie (FTICR) massaspectrometers, heeft de mogelijkheid om analyt signalen lossen van matrix signalen, en dit kan deels veel problemen in verband met de achtergrond afkomstig van de MALDI overwinnen matrix. De verlaging van de intensiteiten van de metastabiele matrix clusters door FTICR MS kan ook helpen om een ​​deel van de storingen in verband met matrix pieken op andere instrumenten te overwinnen. Hoge-resolutieinstrumenten zoals de FTICR massaspectrometers zijn voordelig omdat ze het verspreidingspatroon van veel stoffen tegelijk kan produceren, terwijl het toch het vertrouwen in de chemische identificaties. Dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) is eerder gerapporteerd als een MALDI matrix voor weefsel beeldvorming. In dit werk, een protocol voor het gebruik van DT voor MALDI beeldvorming van endogene lipiden uit de oppervlakken van weefsel van zoogdieren secties, door positieve-ion MALDI-MS, op een ultrahoge resolutie hybride quadrupool FTICR instrument is verstrekt.

Introduction

Massaspectrometrie imaging (MSI) is een analytische techniek die de ruimtelijke lokalisatie en verspreidingspatroon van verbindingen op het oppervlak van een weefselsectie 1,2. Matrix-assisted laser desorptie / ionisatie (MALDI) MSI voor de analyse van peptiden en eiwitten is gebruikt voor meer dan een decennium en zijn er grote verbeteringen in methoden voor monstervoorbereiding, detectie gevoeligheid, ruimtelijke resolutie, reproduceerbaarheid en dataverwerking 3,4 geweest. Door informatie uit histologisch gekleurde coupes en MSI experimenten pathologen kunnen de verdelingen van specifieke verbindingen correleren met pathofysiologisch interessante eigenschappen 5.

Het distributiepatroon van kleine moleculen, waaronder exogene drugs 6,7 en hun metabolieten 8-10 zijn ook ondervraagd door MALDI-MS weefsel beeldvorming 11. Lipiden zijn misschien wel de meest bestudeerde class van verbindingen met MALDI beeldvorming, zowel in de MS-12-17 en MS / MS 18 modes. Het gebruik van MALDI MSI kleine molecule beeldvorming beperkt door verscheidene factoren: 1) MALDI matrices zelf kleine moleculen (meestal m / z <500), die voorkomende ion signalen te genereren. Deze overvloedige signalen kunnen de ionisatie van kleine moleculen te analyseren onderdrukken en interfereren met hun detectie 19,20. Oplosmiddelvrije matrix coating 21, sublimatie matrix 22 en matrix vooraf bekleed MALDI MS 23 onder meer ontwikkeld om MSI kleine moleculen verbeteren.

Nieuwe matrices die de analyse van lage-MW verbindingen kunnen verbeteren, zijn van groot belang in klein-molecule MSI. Deze matrices moeten verhoogde analyt signalen met een verminderde matrix signalen. In de positieve-ion modus, 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) en α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (CHCA) zijn twee veelgebruikte MALDI MS matrices voor MSI 24 22,25. 9-aminoacridine is gebruikt voor MSI protische analyten in de positieve ion modus 26 en nucleotiden en fosfolipiden in de negatieve ion modus 26-29. 2-Mercaptobenzothiazole is gevonden efficiënte MALDI detectie van lipiden 30 geven, en is gebruikt voor de beeldvorming van muizenhersenen gangliosiden 31. De ultrahoge resolutie van Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) massaspectrometers enigszins kan verlichten dit probleem op te lossen analyt signalen van matrix signalen 32. Een ander voordeel van het gebruik van FTICR-MS is dat de intensiteiten van de metastabiele matrix clusters verlaginged 33, waardoor ook deze storingen 27.

Het gebruik van dithranol (DT, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-on) als een MALDI matrix weefselweergave eerder gemeld 34. In deze huidige werk is een gedetailleerd protocol waarin het gebruik van DT voor de MSI van endogene lipiden op de oppervlakken van runderlens weefselsecties, in de positieve ion modus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tissue Snijden

  1. Flash-vries de specimens probleem, eenmaal geoogst, met behulp van vloeibare stikstof, versturen ze op droog ijs (of de scheepvaart nodig is), en bewaar ze bij -80 ° C tot weefsel snijden. (Als commerciële monsters worden gebruikt, zodat de monsters worden op deze manier bereid.)
  2. Snijd organen bij een beheersbare omvang van de MALDI doelgroep passen. Snij ongewenste delen van het orgel. Voor deze studie hier beschreven, zouden runder kalf lenzen decapsulated met behulp van een eerder beschreven procedure 35 voor weefsel snijden.
  3. Verwijder gehele organen uit de -80 ° C vriezer en zet ze op een cryogene weefsel snijden podium. Om een ​​rund kalf objectief vast te stellen, plaatst u een of twee druppels water op het weefsel snijden fase van een cryostaat. Plaats snel de lens in het water voordat het stolt. Alternatief kan optimale snijtemperatuur (OCT) verbindingen ook worden gebruikt om een ​​weefsel vast op het uitsnijden. Als oktober verbindingen gebruikt, een minimal bedrag van oktober moet worden toegepast en de zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de cut weefselcoupes niet wordt verontreinigd met oktober verbindingen die kunnen interfereren met ionisatie en detectie van de analyten 5,36,37.
  4. Laat de temperatuur in de cryostaat equilibreren tot -18 ° C. Koudere of warmere temperaturen worden gebruikt voor zachtere en hardere weefsels, respectievelijk. Snijd vervolgens het weefsel equatoriaal in 20 micrometer dikke plakken. Gebruik 10-15 urn dikke plakken meeste weefsels, maar vanwege de kwetsbaarheid van runderen lensdoek werden 20 urn dikke plakjes gebruikt. Voor runderen lens weefsel, verwijder de eerste coupes en alleen gebruik maken van schijfjes die dicht bij of op het equatoriale vlak zijn.
  5. Als een oculaire lens weefsel wordt afgebeeld, gebruikt 1,5 pl mierenzuur (98% zuiverheid, LC-MS graad) op het oppervlak van een indiumtinoxide (ITO) bekleed glasplaatje voorbevochtigd.
  6. Breng zorgvuldig de weefselsecties aan het oppervlak van de ITO-coated glas microscopisch preparaat in de cryostaat. Het weefsel sectie zal snel ontdooien en zal stevig aangebracht op de dia oppervlak geworden. Meestal kan meerdere weefselcoupes op eenzelfde ITO-gecoate slide op deze wijze gemonteerd.
  7. Lyofiliseren de glijbaan voor 15 min voordat MALDI matrix toepassing.
  8. Voor matrix testen, los de individuele matrices in geschikte oplosmiddelen. Handmatig spot 1 pi van elke matrix oplossing op de weefselsectie. Bovendien, ter plaatse een klein-molecule kalibratie op het weefsel voor de verificatie van MALDI gevoeligheid.
  9. Voeg drie lesuren merken aan de ITO gecoat glas dia door te schrijven op het geleidende oppervlak van de ITO gecoat glas dia met een correctie-vloeistof pen. Neem een ​​optisch beeld van het weefsel dia met behulp van een flatbed scanner en sla het op in een geschikt formaat, zoals tiff of jpg.

2. Matrix Coating

2.1. Geautomatiseerde Matrix Coating

  1. Apply matrix oplossingen die acetonitril of gemengde acetonitril / water bevatten oplosmiddelen automatisch aan de oppervlakken van de weefselsecties met een Bruker ImagePrep of soortgelijke elektronische matrix spuit.
  2. Bedek de randen van het vooroppervlak van de ITO-gecoate glasplaatje met tape zodat de matrix niet laag de randen van de schuif. Dit zorgt ervoor dat de leer merktekens op het tegenoverliggende oppervlak kan worden gebruikt voor weefsel dia uitlijning. Bedek de randen van de dia met matrix als ze worden gebruikt als contactpunten voor de elektrische geleidbaarheid van de ITO-gecoate dia behouden.
  3. Coat het glaasje door twintig cycli van matrix coating (2-sec spray, 30-sec incubatie en 60-seconden droogtijd voor elke cyclus).

2.2. Handmatig Matrix Coating

  1. Als organische oplosmiddelen (bijv. chloroform en ethylacetaat) die onverenigbaar zijn met de productie-materialen van de elektronische matrix spuit zijn zijn requirood, gebruik dan een pneumatisch-assisted airbrush spuit om de matrix te passen. Voeg de voorbereide matrix oplossing voor het oplosmiddel reservoir van de airbrush pistool en breng een zachte stroming van onder druk stikstofgas prime de spray.
  2. Bedek de randen van het vooroppervlak van de ITO-beklede glasplaatjes met tape zodat de matrix niet laag de randen van de schuif. Dit zorgt ervoor dat de leer merktekens op het tegenoverliggende oppervlak kan worden gebruikt voor weefsel dia uitlijning. Bedek de randen van de dia met matrix als ze worden gebruikt als contactpunten voor de elektrische geleidbaarheid van de ITO-gecoate dia behouden.
  3. Na stabiele en fijne nevels zijn waargenomen, handmatig spuiten de matrix, zodat deze volledig bedekt de sectie weefsel. Breng de minimale hoeveelheid matrix oplossing die nodig is om nauwelijks nat het oppervlak tijdens elke cyclus om mogelijke analyt delocalisatie voorkomen. In het algemeen gebruiken ongeveer 10 cycli van matrix spray om vacht een sectie weefsel, het aantal cycli isafhankelijk van het weefseltype en matrixsamenstelling.

3. MALDI MS

  1. Bereid een massa ijkoplossing door verdunning van de "ES Tuning Mix" standaardoplossing met een factor 1:200 in 60:40 isopropanol: water (dat 0,1% mierenzuur in het uiteindelijke mengsel).
  2. Introduceer 2 pl / min van de verdunde "ES Tuning Mix" oplossing in de dual-mode elektrosprayionisatie (ESI) / MALDI ionenbron op de FTICR massaspectrometer, uit de ESI kant.
  3. Bedien de FTICR instrument in de positieve-ion ESI modus, met breedband detectie en een data-acquisitie grootte van 1024 kb / sec. Typische ESI parameters zijn capillaire elektrospray spanning, 3900 V; spuiten schild spanning 3600 V; vernevelaar gas (N 2) stroom, 2 L / min; droog gas (N 2) stromen en de temperatuur, 4 L / min en 200 ° C; skimmer 1 spanning, 15 V; time of flight (TOF), 0.009 sec, bij een botsing gas (Ar) stroom, 0,4 l / s; bron ion accumulatie tijd, 0.1 sec;en botsing cel ion accumulatie tijd, 0.2 sec. Stem de FTICR bedrijfsparameters om de analytische gevoeligheid via massabereik van m / z 200 tot 1.400 maximaliseren, met behoud goede tijd-domein free-inductieverval (FID) signalen. Typisch, de ICR operatie parameters zijn sidekick spanning, 8 V; sidekick offset spanning, 8 V; excitatie amplificatie van 10; excitatie puls tijd, 0,01-,015 sec; voorzijde val plaat spanning, 1,5 V; terug val plaat spanning, 1,6 V en analyzer ingang spanning, -4 V. Nadat is vastgesteld een reeks FTICR operatie parameters, het verwerven van de ESI massa spectra en het ijken van het instrument met de referentie-massa van de standaard verbindingen in de "ES Tuning Mix" oplossing.
  4. Afstemmen het instrument MALDI werking los verschillende 1 ui porties van een gemengde terfenadine en reserpine standaardoplossing in de matrix oplossing bij een concentratie van 1 uM elk en spot deze oplossingen direct op een van de tissue secties (dwz een test weefsel sectie) die op een ITO-gecoate glijbaan heeft gemonteerd. Plaats de ITO-gecoate glijbaan in een weefsel dia adapter (bijvoorbeeld een speciale MALDI doel) en laad de adapter uit het MALDI kant in de dubbele ESI / MALDI ionenbron. Optimaliseer de juiste MALDI bedrijfsparameters voor het laservermogen en het aantal laserschoten voor MALDI signaal accumulatie per massa scan, enz. Typerende MALDI bedrijfsparameters zijn: laserschoten, 50, en een MALDI plaat spanning van 300 V.
  5. Na tuning, het kalibreren, en het optimaliseren van het instrument voor MALDI-MSI experimenten, lijnt de fysieke locatie van een sectie weefsel af te beelden met zijn opgenomen optisch beeld binnen de imaging software. Gebruik de drie "correctie-vloeistof" merken, die eerder was gezet aan de andere kant van de ITO-gecoate glijvlak (stap 1.9), voor deze aanpassing met behulp van een drie-punts triangulatie methode.
  6. Voer een gelijktijdige ESI en MALDI werking zodat elke massaspectrum bevat de referentiemassa toppen van de "ES Tuning Mix" oplossing voor post-acquisitie interne massa kalibratie. Dit zal resulteren in de meest nauwkeurige massameting bij MALDI MS. Om dit te doen, eerst de ESI signaal verzwakken door het verlagen van de capillaire spanning totdat de MALDI signalen domineren de spectra terwijl de ESI kalibrant signalen zijn nog steeds hoog genoeg voor interne massa kalibratie.
  7. Next, het opzetten van een geautomatiseerd rastervelden methode voor laser bestraling. Definieer het weefsel regio's af te beelden en stel de juiste laser raster stapgrootte. Merk op dat kleinere raster stapgroottes bieden een hogere resolutie weefsel beelden, maar vereisen een aanzienlijk langere massaspectrale acquisitie tijd en meer opslagruimte voor gegevens. Het nummer van het beeld pixels is afhankelijk van de laser raster stapgrootte op te zetten en het weefsel grootte. Voor een typische runderen lens die een 1 cm 2 weefsel grootte heeft, is het een weefsel gewoonlijk uit ca.

4. Data Analysis

  1. Kalibreer de MALDI spectra met behulp van interne kalibratie voor de eerste vergelijking en pieken voor MS / MS selecteren. De-isotoop en selecteer de monoisotoop pieken zoals eerder beschreven, met behulp van een aangepaste VBA script 38.
  2. Exporteer de resulterende monoisotoop piek lijsten en voer de gemeten m / z-waarden in de Metlin 39 en / of de HMDB 40 metabolome databases voor massa matching met de bibliotheek inzendingen. Beschouw de (M + H) +, (M + Na) + en (M + K) + ionen in de database zoeken, met een toegelaten massa van ± 1 ppm.
  3. Genereer MALDI afbeeldingen voor alle van de lipide entiteiten waargenomen over de hele sectie weefsel met behulp van IMAGe-analysesoftware, met een massa filter breedte van 1 ppm op de top.
  4. Zodra beelden zijn gegenereerd voor alle m / z waarden die overeenkomen met databasegegevens, het genereren van afbeeldingen voor alle andere pieken en om te zoeken naar unieke distributie patronen die later kan worden onderzocht.

5. Bevestiging van de identiteit van de Imaged Lipids

  1. Bevestigen de identiteit van de hoge overvloed lipiden, die karakteristiek fragment ionen die kunnen worden gedetecteerd met behulp van de FTICR instrument (bijv. 184,073 voor fosfolipiden), door MALDI-MS/MS hebben. Voer MALDI-MS/MS behulp botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) direct op het weefsel.
  2. Voor de lipide soorten die niet direct kan worden bevestigd door MALDI-MS/MS Gebruik een UPLC gekoppeld met een Q-TOF massaspectrometer 34.
    1. Handmatig ontleden aliquots met ~ 10 mg weefsel uit het gebied waar het van belang zijnde species is gelokaliseerd. Plaats deze weefsel monsters in 2ml centrifuge buizen.
    2. Meng elk weefsel monster in 250 ul van water, met behulp van een mixer molen met twee 5 mm RVS metalen ballen.
    3. Voeg 1 ml chloroform-methanol-oplossing (1:3, v / v) en vortex de buizen. Vervolgens centrifuge buizen met een microcentrifuge bij 12.000 xg gedurende 10 minuten.
    4. Verzamel de bovenstaande vloeistof en droog ze in een roterende snelheid vacuüm concentrator.
    5. Los de residuen in 100 ul 30:70 isopropanol: water. Injecteer een 10-pi aliquot op de kolom UPLC voor kleurscheiding met gradiëntelutie.
    6. Gebruik de chromatografische voorwaarden voor on-line lipide LC-MS/MS, die al eerder zijn gepubliceerd 34.
    7. Genereer geëxtraheerd ionenstroom (XIC) chromatogrammen met de theoretische m / z-waarden, met een venster van ± 50 ppm in de theoretische massa.
    8. Als authentieke verbindingen voor die lipiden zijn, overeenkomen met de retentietijd authentieke verbindingen met die van de overeenkomstigekomstige XIC pieken van de weefselmonsters. Wanneer de verbindingen zijn hetzelfde, moet de retentietijden en de MS / MS spectra passen.
  3. Als een authentieke verbinding niet beschikbaar is, gebruik dan de fragmentatie patroon van de gedetecteerde lipide een standaard MS / MS-spectrum van een metabolome databank zoals Metlin of HMDB passen. Gebruik de novo massaspectrum interpretatie een mogelijke structuur voor de lipide bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Weefselmonsters die coupes en dooi gemonteerd op de ITO gecoat glas dia's moeten intact zijn, zonder zichtbare scheuren. Voor veel weefsels, directe weefsel dooi montage op een ITO gecoat glas dia is aanvaardbaar. Voor sommige specifieke weefsels zoals runderen lens, wordt uitgebreid scheuren van het weefsel vaak gezien als directe dooi montage wordt gebruikt (figuur 1a). Voorcoating van de ITO glasplaatje met ethanol of mierenzuur (figuur 1b) helpt om de integriteit van de weefselsecties in weefsel montage handhaven.

Zowel de keuze van de matrix en de keuze van oplosmiddel zijn belangrijke factoren die de kwaliteit van de MALDI spectra. Als er een geschikte MALDI MS spectrum wordt verkregen van de sectie weefsel, het massaspectrum is meestal dicht met lipide signalen in de massa detectiebereik (Figuur 2a). Een matrix en een oplosmiddel moet worden gekozen dat zij polariteitenont-size: 14.399999618530273px; line-height:. 28PX; "> gelijk aan de analyten, omdat de MALDI proces vereist een vaste-fase oplossing van de stof in de matrix kristallen algemeen de beste analyt signaal intensiteiten komen uit het gebruik MALDI matrices oplosbaarheden gelijk aan die van de gewenste analyten 41,42. Figuur 2a toont een voorbeeld van een spectrum verkregen met een efficiënte matrix oplosmiddel (70% ACN met 0,01% TFA), en figuur 2b een slechte keuze van matrix en oplosmiddel (70% MeOH met 0,01% TFA) voor dithranol.

Een van de voordelen van een dual-mode electrospray ionisatie (ESI) / MALDI ionenbron is dat het toevoegen van ESI kalibratieoplossing signalen tegelijkertijd verwerven MALDI spectra zonder te interfereren met het ablatieproces. Deze ESI kalibrant signalen zorgen voor interne massa kalibratie hoge nauwkeurigheid massa te voorzien van massa fout van <0,5 ppm 38. Aangezien deESI signaal van de standaard "ES Tuning Mix" oplossing kan een orde van grootte groter dan de MALDI signalen van de analyten uit het weefsel, moeten de ESI-afgeleide kalibrant signalen worden verzwakt. Kalibrant signalen moeten zichtbaar en voldoende intensiteit voor de kalibratie van de spectra zijn, maar mag niet de spectra domineren.

Nadat de ingestelde massaspectra van een MALDI-MSI experiment is verkregen, kan het beeld voor elk van de gedetecteerde ionen worden gegenereerd, waarbij elke pixel vertegenwoordigt een laserbestraling plek van het oppervlak van een weefselsectie. Combineren alle afzonderlijke pixels met verschillende ionenintensiteiten in de weefselsectie van een MALDI MSI experiment geeft de ionisatie van doelanalyten in het weefsel 1. Dit kan op zijn beurt, informatie over de relatieve concentraties van de analyten in verschillende delen van de weefselsectie (figuur 3b). Zorg moet worden genomen bij de verwerking van degegevens aangezien vele factoren beïnvloeden wat gezien en hoe de gegevens worden geïnterpreteerd. In de meeste experimenten, worden de gegevens genormaliseerd naar het totale ionenstroom (TIC) in elk spectrum. Zonder deze normalisatie kunnen de gebieden met een betere analyt-matrix co-kristallisatie (bijvoorbeeld zogenaamde "hot spots") sterkere signalen voor de analyten veroorzaken en zou de gegevens scheef door informatie die niet goed correleren met de werkelijke relatieve concentraties de analyten (figuren 3c-3d).

Prepareren van weefsels kan ook drastisch veranderen het beeld dat wordt gegenereerd. Als het monster "te nat" (dwz te veel oplosmiddel werd gebruikt), dan is de analyten zullen delokaliseren op het weefsel en een groot deel van de ruimtelijke informatie verloren zal gaan (Figuur 3f). Werkwijze gegevensverwerving is ook belangrijk in het uiteindelijke beeld verkregen. Zoals MALDI experimenten op onbehandeld weefsel secties zijn inherent "dirty & #34, kan de gevoeligheid van het apparaat de tijd afnemen. Voor korte experimenten deze daling niet duidelijk kunnen zijn, maar het kan een probleem zijn voor langere experimenten of bijzonder vuile monsters. Als de gegevens lineair verkregen over het monster kan dit leiden tot een locatiespecifieke vertekening specifieke gebieden van de weefselsectie worden geanalyseerd na de gevoeligheid van het apparaat afgenomen. Daarom behulp van willekeurige plekken voor alle data acquisities aanbevolen. Hoewel deze methode kost meer tijd, het helpt om deze bias in de gegevens te verwijderen of te minimaliseren.

Zoals in onze vorige artikel 34, vergeleken met CHCA en DHB, DT kon de detectie van extra lipide deeltjes, terwijl de lipiden gedetecteerd met CHCA en DBH nog steeds worden gedetecteerd.

Figuur 1 >
Figuur 1. Weefsel montage en snijden. Vergelijkende optische beelden van twee runder kalf lens weefselcoupes (20 urn dik), zonder mierenzuur prewetting (a), en met mierenzuur prewetting (b), gemonteerd op de ITO-beklede objectglaasjes.

Figuur 2
Figuur 2. . Mass Spectra MALDI MS spectra verkregen rechtstreeks vanaf een weefselsectie: a) een ideale dichtbevolkte massaspectrum met lipide signalen (70% ACN met 0,01% TFA), b) een massaspectrum gegenereerd uit een weefselsectie bekleed met een slechte keuze van oplosmiddel (70% MeOH met 0,01% TFA). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

tent "fo: keep-together.within-page =" altijd "> Figuur 3
Figuur 3. MALDI MSI beelden Vertegenwoordiger MALDI MSI beelden: a) een rund lenstissue sectie, b) een MSI beeld van dezelfde sectie weefsel; c) een afbeelding MSI toont een achtergrond ion, d) een nonnormalized ion kaart van dezelfde ion e). een rund lens weefsel sectie, en f) een ion kaart waarop een gedeeltelijk gedelokaliseerde analyt vanwege overbevochtiging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De belangrijkste overwegingen voor een succesvolle MALDI MSI zijn: 1) de voorbereiding weefsel, 2) matrix keuze; 3) matrix toepassing, en 4) interpretatie van gegevens en analyse. Als het monster en de matrix passende wijze bereid, wordt het MS data acquisitie geautomatiseerd. De gegevensanalyse van dergelijke experimenten is vrij arbeidsintensief.

Geschikte weefsels voorbereiding is cruciaal voor een succesvolle MALDI MSI experimenten. De bron van het weefsel en de behandeling kan een grote invloed op de uiteindelijke analyse hebben. De monsters moeten onmiddellijk knipperen ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C, en ze moeten niet worden opgeslagen gedurende langere tijd, zoals sommige metabolieten onstabiel zijn zelfs bij -80 ° C.

Voor veel zoogdierweefsels, hebben 10-15 micrometer dik weefselplakken aanbevolen voor MALDI MSI. In deze experimenten werden runder kalf lenzen equatoriaal gesneden in 20 urn dikke weefsel sluizen volgende lens decapsulation met behulp van een eerder beschreven procedure 35. De dikkere runder kalf lens weefselsecties werden gebruikt omdat het moeilijk bleek om de integriteit van een sectie lensdoek zowel tijdens snijden van weefsel en weefsel tijdens de montage te behouden. De lens is een sferisch symmetrisch weefsel langs de equatoriale vlak, dus alleen plakken die dicht bij, of op waren, het equatoriale vlak werden verzameld.

Vanwege de moeilijkheid in het handhaven van de integriteit weefsel tijdens snijden van weefsel en bevestigingsmiddelen, prewetting met een oplosmiddel zoals ethanol (voor eiwitten en peptiden 35) of mierenzuur (lipiden) worden gebruikt. Voorts zij opgemerkt dat voor eiwitten en peptiden beeldvorming, de monsters vaak gewassen met een organisch oplosmiddel om kleine moleculen zoals lipiden LGO voor de montage verwijderen, maar zou een wasstap alleen met oplosmiddelen die niet ontbinden analyten, en moet worden vermeden voor small molecuul analyse.

De keuze van de matrix is ​​ook cruciaal voor MALDI experimenten, maar kan op weefselmatrix resultaten niet hetzelfde als matrix prestaties met een gezuiverd standaard. Bijvoorbeeld, bij minimale laservermogen, DT gegenereerd overvloedige DT-gerelateerde achtergrond signalen van het weefsel vrij matrix vlekken en deze signalen werden de DT oligomeren en hun overeenkomstige natrium en kalium adducten toegewezen, maar op weefsel, veel van deze signalen zijn niet waargenomen, wat aangeeft dat het testen van verschillende matrices van de specfieke keuze belang kunnen zijn bij het selecteren van de juiste matrix voor een bepaalde MALDI MSI analyse. DT wordt nauwelijks gebruikt voor lipide analyse vanwege de gerapporteerde hoge achtergrond gegenereerd door de matrix, maar in vergelijking met DHB en CHCA voor het in weefsel profilering van lipiden door MALDI-FTICR MS DT geproduceerd gunstige resultaten. Dus deze matrix kan een potentieel bruikbare matrix voor MALDI weefsel beeldvorming met behulp van dit instrument

Efficiënte co-kristallisatie van de matrix en de analyt is een voorwaarde voor zeer gevoelige MALDI-MS analyse. Dus de vaste fase oplosbaarheid van een analyt in de matrix is belangrijk in het proces MALDI 41,42. MALDI matrices oplosbaarheden gelijk aan die van de gewenste analyten gemeld aan de analyt sterkste signaal intensiteit produceren. Omdat DT is een zwak organisch zuur, en een hydrofobe organische verbinding, gebaseerd op klassieke Bronsted-Lowry zuur-base neutralisatie theorie 43 en de theorie van de oplosbaarheid, wordt verwacht dat de ionisatie van positief geladen en minder polaire bevorderen verbindingen. In feite vonden we dat polaire lipiden domineerde de gedetecteerde verbindingen in de positieve ion modus als DT werd gebruikt als matrijs.

De oplosmiddelen gebruikt voor het bereiden van een matrix oplossing speelt een belangrijke rol in direct weefselanalyse door MALDI-MS. De pH is betrokken alsbelangrijke factor voor de effectiviteit van een matrix, en TFA is een veel voorkomende additief gebruikt CHCA en DHB. Echter, met DT, de toevoeging van een zuur of base modificerende had weinig effect op de resulterende gegevens. Vanwege de hydrofobiciteit van DT en de beperkte oplosbaarheid in polaire oplosmiddelen, is een lipofiel organisch oplosmiddel aanbevolen. Bij de analyse van lipiden, een mengsel van chloroform-methanol (2:1, v: v) met 1% mierenzuur, wat een typisch organisch oplosmiddel voor lipide extractie werd gebruikt. We gepostuleerd dat dit zorgt voor een betere co-kristallisatie van lipiden met DT. De lipofiele aard van het oplosmiddel kan ook voorkomen dat de solubilisatie van andere verbindingen zoals eiwitten en zouten, zoals in eerdere vloeistofextractie oppervlakteanalyse massaspectrometrie (LESA-MS) 44 experimenten. Dit zou leiden tot betere kristallisatie van de matrix en lipiden met minder verontreinigingen. Het oplosmiddel systeem dat wordt geselecteerd voor analyse moet de oplosbaarheid van de matrix en de desi maximaliserenrode analyten (lipiden), terwijl het minimaliseren van de oplosbaarheid van ongewenste verontreinigingen (zouten en eiwitten / peptiden).

De bekleding van de matrix op het oppervlak van het weefsel moet zo uniform mogelijk. Om de ruimtelijke resolutie van het beeld maximaliseren, moet de kristalgrootte zo klein mogelijk 45 zijn. Met behulp van een elektronische matrix sproeier, kan de matrix uniform en reproduceerbaar worden bekleed met een kleine kristalgrootte. Dit is de geprefereerde methode in ons laboratorium. Het is veel liever handmatig aanbrengen als het puntgrootte, homogeniteit en reproduceerbaarheid vermindert. Veel van de oplosmiddelen die bruikbaar zijn voor MSI kleine moleculen zijn niet mogelijk met de vervaardiging van de geautomatiseerde matrix veldspuit materialen. Hoewel nog niet in ons laboratorium uitgevoerd, is sublimatie gebaseerd matrix toepassing aanbevolen voor lipide analyse 22. Deze methode zorgt voor een betere (dwz gereduceerd) puntgrootte, homogeniteit, en reproductievebaarheid en dit zou waarschijnlijk de voorkeurswerkwijze wanneer de geselecteerde matrix vriendelijk deze methode.

Voor bekleding van matrices bevattende oplosmiddelen onverenigbaar met de geautomatiseerde matrix spuitmachine (zoals chloroform), een alternatieve matrix coating is een air brush pistool. Voor deze matrix oplossingen, gebruikten we een pneumatisch bijgestaan ​​airbrush spuit. Hoewel het gebruik van de airbrush pistool geen ideale werkwijze kan het de enige methode die kan worden gebruikt voor oplosmiddelen en matrices die met de andere methoden, en-training en ervaring, kan zeer gelijkmatige matrix coating genereren. Bij het handmatig aanbrengen van de matrix oplossing, mag alleen de minimale hoeveelheid vloeistof worden toegepast tijdens elke cyclus nauwelijks nat het oppervlak van het weefsel. Teveel vloeistof zou kunnen delokaliseren analyten te wijten aan de organische oplosmiddelen. Er zijn reproduceerbaarheid problemen met handmatige toepassing en ervaring in het coaten van de dia met deze methode iis essentieel voor succes. Vanwege de manuele aard van de airbrush pistool matrix aanvraag moet ervoor worden gezorgd dat een gelijkmatige bekleding wordt gemaakt, een inhomogene bekleding kan leiden tot scheve gegevens, die representatief is voor de matrix coating en niet de analyt lokalisatie.

Bij het ​​uitvoeren van MALDI MSI experimenten, wordt initiële identificatie van de gedetecteerde analyten meestal gebaseerd op metabolome zoeken in databanken van de gemeten accurate massa die meestal alleen beschikbaar wanneer een hoge resolutie instrument wordt gebruikt 38. De dubbele ESI / MALDI ionenbron op Apex-Qe 12-Tesla hybride quadrupool-FTICR massaspectrometer maakt de toevoeging van ESI-gegenereerde signalen voor gebruik als interne massa kalibrant pieken elke MALDI-massaspectrum, onverminderd het MALDI desorptie / ionisatie-proces. Het gebruik van interne massa calibratie is cruciaal voor de hoogmis meetnauwkeurigheid in MALDI-FTICR. Externe kalibratie kan niet volledig rekening houden met deruimtelading effecten binnen de ICR cel 46-48. De afstemming en kalibratie van de FTICR is cruciaal voor succes. Bij dit type instrument een parameter genaamd de "Time of Flight" (TOF), de tijd die een ion om van de botsing cel naar de analysator (ICR cel) is een van de belangrijkste gebruiker gedefinieerde instellingen die de gevoeligheid van een FTICR instrument beïnvloeden. Binnen een bepaald massabereik (dwz m / z 200-1,400), een lagere TOF bevordert detectie van lagere m / z ionen en een hogere TOF bevordert detectie van een hoger m / z ionen. Zo hoge gevoeligheid detectie van lage en hoge m / z ionen in het detectiebereik massabereik, een TOF waarde van 9 msec wenselijk.

Voor een praktijkexperiment, moet een afweging worden gemaakt tussen redelijke data-acquisitie omvang, massa resolutie, en de tijd besteed aan het verwerven van MS beeldgegevens. Voor een FTICR MS experiment, de grootte van de verkregen gegevensbestand en de massa resolutiOp zijn afhankelijk van de data acquisitie grootte van het vrije inductieverval (FID) signaal. Een hogere data acquisitie grootte zal resulteren in een grotere massa resolutie en een grotere data bestand. Echter, een hogere data-acquisitie omvang zorgt ook voor een tragere MS scansnelheid. Als een trade-off, is het aanbevolen dat een data-acquisitie grootte van 1024 kb / sec worden gebruikt op de FTICR. Een lagere data-acquisitie grootte en een bijbehorende lagere massa resolutie niet toestaan ​​dat de scheiding van sommige isobare ion soorten.

De laser raster stapgrootte moet worden gekozen dat het klein genoeg om een ​​goede pixelresolutie voor MS beelden van de analyten geven, maar kan een zeer klein raster stapgrootte maken de gegevensbestanden onbeheersbare overweegt een MS imaging gegevensbestand bestaat uit duizenden MALDI massaspectra. Gezien de relatief grote omvang van runderen lenzen, ca.. 1,2 -1,5 cm in diameter, gebruikten we een raster stapgrootte van 250 urn. Met behulp van een 1024 kb / sec data acquisition grootte en een 250 micrometer raster stapgrootte, onze steekproef dataset was ongeveer 60 Gb. Tijdens de data-acquisitie, moet een steekproefsgewijze analyse worden gebruikt, omdat dit voorkomt dat locatiegebaseerde vertekening als gevolg van geleidelijke signaal verzwakking, maar steekproefsgewijze vergt aanzienlijk meer tijd om de gegevens te verkrijgen.

Omdat de MALDI MSI datasets verworven op onze FTICR MS instrument ook accurate massa gegevens kan de uitgepakte m / z worden gezocht tegen metabolome databases zoals Metlin en / of HMDB. Met behulp van een ± 1 ppm venster de eerste opdrachten van veel ion signalen naar metabolieten zijn van hoge vertrouwen. Echter, omdat veel soorten hebben dezelfde chemische formule, de bevestiging van de ID moet vaak worden gedaan met behulp van andere middelen. Dus, MS / MS-experimenten, en vergelijking van de MS / MS-spectra met eerder gepubliceerde gegevens moeten worden uitgevoerd voor een zelfverzekerde identificatie. MALDI-MS/MS spectra kan soms direct worden verkregen op de FTICR instrument, maar voor many lipide moleculen, hun abundanties en / of ionisatie efficiëntie onvoldoende zijn voor het verkrijgen van bruikbare MS / MS data, en verrijking en zuivering voorafgaand aan LC-MS/MS zijn vereist. In deze analyses, de waargenomen polaire lipiden fosfolipiden waren en waren als PC, PE's, SMs PSS, PG, PA en ceramide fosfaten (CerPs) toegekend; andere lipide moleculen geïdentificeerd onder sterol lipiden, acylcarnitinen en glyceriden. Gezien de eigenschappen van het oplosmiddel en matrix, dit is te verwachten. De MS / MS spectra van pc bevatten prominente piek bij m / z 184,073, die is toegeschreven aan de PC polaire kopgroep, fosfocholine, evenals extra structureel belangrijke informatie die eenduidige identificatie van de moleculen kan geven. Bovendien, deze methode veel sterol lipiden worden gedetecteerd, maar de meeste niet eenduidig ​​toegewezen unieke identiteit, zelfs met MS / MS-gegevens. Sterke kalium adducten algemeen overheersen de spectra, maar geprotoneerde en sodiated adducten kunnen ook worden gedetecteerd.

Omdat de MALDI MS proces is alleen in staat om de relatieve overvloed informatie op basis van de lokale ionisatie efficiëntie binnen elke pixel te voorzien, moet erop worden gelet bij het ​​interpreteren van MALDI MSI gegevens zonder stabiele isotoop gelabelde interne standaarden 49. Verder is het voor het vertrouwen in de resultaten van lokalisatie, de bevestiging van enige distributie patronen opgespoord moet worden gedaan met behulp van alternatieve methoden. Het uitvoeren van LC-MS/MS op ontleed weefselmonsters ter bevestiging wordt aanbevolen.

Gebaseerd op de gemeten nauwkeurige massa in het lage massabereik chemische formules kunnen worden gegenereerd voor een gegeven m / z, binnen 1 ppm massa fout en een onbeperkt aantal C, H, O en N en maximaal 2 S 2 P vaak slechts een elementaire samenstelling mogelijk. Deze m / z ook zoeken tegen HMDB en Metlin databases, die potentiële kandidaat verbindingen kunnen opleveren. Helaas,op de FTICR MS de lage-massa cut-off is ca. 130 Da, die het moeilijk maken om direct uit te voeren MS / MS. Aldus wordt bevestigd met een ander systeem vaak nodig.

Q-TOF LC-MS/MS experimenten worden vaak uitgevoerd op weefselmonsters die handmatig zijn ontleed van specifieke gebieden van de weefsels van belang. Met behulp van de beschreven vetextractiemethode, kan XICs worden gegenereerd voor de doelgroep verbindingen en MS / MS kunnen worden verworven ter bevestiging. Ofwel vergelijking met een authentieke standaard of de novo structurele opheldering nodig is voordat er een zelfverzekerde chemische opdracht kan zijn.

Dithranol is gebruikt om lipide distributie patroonherkenning bij runderen kalf lens en getest op rattenlever, hart en nierweefsel 34. MALDI MSI kan worden gebruikt voor de diagnose van menselijke ziektetoestanden en wordt al gebruikt voor pathologische analyse 50. Met de ontwikkeling van meer robuuste en snelle technologies voor MALDI MSI, de ruimtelijke lokalisatie van specifieke verbindingen kunnen nuttige informatie voor een patholoog zijn. Zodra een analyt routinematig kunnen worden afgebeeld met een MALDI MSI-gebaseerde werkwijze kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden. In feite kan weefselweergave worden uitgevoerd in een ziekenhuis, een instrument naast de operatiekamer, waar, zoals reeds aangetoond 51, kan het worden gebruikt om de randen van tumoren nauwkeurig te bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Genome Canada en Genome British Columbia erkennen voor platform financiering en ondersteuning. We danken ook Dr Carol E. Parker voor kritische beoordeling van het manuscript en bewerken van hulp. CHL dankt ook de British Columbia Proteomics Netwerk voor ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Liver Pel-Freez Biologicals 56023-2
Bovine Calf Lens Pel-Freez Biologicals 57114-2 Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT) Sigma-Aldrich 10608 MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) Sigma-Aldrich 70990 MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) Sigma-Aldrich 85707 MALDI Matrix
Reserpine Sigma-Aldrich 83580
Terfenadine Sigma-Aldrich T9652
Formic Acid Sigma-Aldrich 14265
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 14266
Ammonium Hydroxide Sigma-Aldrich 320145
Trifluoroacetic Acid (TFA) Sigma-Aldrich 302031
Water Sigma-Aldrich 39253
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967
Ethyl Acetate Sigma-Aldrich 34972
Isopropanol Sigma-Aldrich 34965
Chloroform Sigma-Aldrich 366927
Acetone Sigma-Aldrich 34850
Ethanol Commercial Alcohols 95%
ES Tuning Mix Agilent Technologies G2431A
ITO Coated Glass Slides Hudson Surface Technology PSI1207000 Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen Bic WOSQP11
Airbrush Sprayer Iwata Eclipse HP-CS
ImagePrep Bruker 249500-LS
MALDI adapter Bruker 235380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaurand, P., Stoeckli, M., Caprioli, R. M. Direct Profiling of Proteins in Biological Tissue Sections by MALDI Mass Spectrometry. Anal. Chem. 71, 5263-5270 (1999).
  2. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples. Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  3. Amstalden van Hove, E. R., Smith, D. F., Heeren, R. M. A. A concise review of mass spectrometry imaging. J. Chromatogr. A. 1217, 3946-3954 (2010).
  4. Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of Tissue Specimens by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry in Biological and Clinical Research. Chem. Rev. Feb 11, (2013).
  5. Walch, A., Rauser, S., Deininger, S. -O., Höfler, H. MALDI imaging mass spectrometry for direct tissue analysis: a new frontier for molecular histology. Histochem. Cell Biol. 130, 421-434 (2008).
  6. Hsieh, Y., et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry for direct measurement of clozapine in rat brain tissue. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 965-972 (2006).
  7. Trim, P. J., et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization-ion mobility separation-mass spectrometry imaging of vinblastine in whole body tissue sections. Anal. Chem. 80, 8628-8634 (2008).
  8. Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct molecular analysis of whole-body animal tissue sections by imaging MALDI mass spectrometry. Anal. Chem. 78, 6448-6456 (2006).
  9. Atkinson, S. J., Loadman, P. M., Sutton, C., Patterson, L. H., Clench, M. R. Examination of the distribution of the bioreductive drug AQ4N and its active metabolite AQ4 in solid tumours by imaging matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 1271-1276 (2007).
  10. Drexler, D. M., et al. Utility of imaging mass spectrometry (IMS) by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) on an ion trap mass spectrometer in the analysis of drugs and metabolites in biological tissues. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 55, 279-288 (2007).
  11. Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J. Proteomics. 75, 4999-5013 (2012).
  12. Sugiura, Y., Setou, M. Imaging Mass Spectrometry for Visualization of Drug and Endogenous Metabolite Distribution: Toward In Situ Pharmacometabolomes. J. Neuroimmune Pharmacol. 5, 31-43 (2009).
  13. Garrett, T. J., Yost, R. A. Analysis of intact tissue by intermediate-pressure MALDI on a linear ion trap mass spectrometer. Anal. Chem. 78, 2465-2469 (2006).
  14. Woods, A. S., Jackson, S. N. Brain tissue lipidomics: direct probing using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. AAPS J. 8, 391-395 (2006).
  15. Cha, S., Yeung, E. S. Colloidal graphite-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and MSn of small molecules. 1. Imaging of cerebrosides directly from rat brain tissue. Anal. Chem. 79, 2373-2385 (2007).
  16. Burnum, K. E., et al. Spatial and temporal alterations of phospholipids determined by mass spectrometry during mouse embryo implantation. J. Lipid Res. 50, 2290-2298 (2009).
  17. Veloso, A., et al. Anatomical distribution of lipids in human brain cortex by imaging mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 329-338 (2011).
  18. Tanaka, H., et al. Distribution of phospholipid molecular species in autogenous access grafts for hemodialysis analyzed using imaging mass spectrometry. Anal. Bioanalyt. Chem. 400, 1873-1880 (2011).
  19. Lou, X., van Dongen, J. L., Vekemans, J. A., Meijer, E. W. Matrix suppression and analyte suppression effects of quaternary ammonium salts in matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry: an investigation of suppression mechanism. Rapid Comm. Mass Spectrom. 23, 3077-3082 (2009).
  20. Knochenmuss, R., Karbach, V., Wiesli, U., Breuker, K., Zenobi, R. The matrix suppression effect in matrix-assisted laser desorption/ionization: application to negative ions and further characteristics. Rapid Commun. Mass Spectrom. 12, 529-534 (1998).
  21. Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
  22. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a Method of Matrix Application for Mass Spectrometric Imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 1646-1652 (2007).
  23. Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
  24. Fuchs, B., Süss, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Prog. Lipid Res. 49, 450-475 (2010).
  25. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
  26. Vermillion-Salsbury, R. L., Hercules, D. M. 9-Aminoacridine as a matrix for negative mode matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, 1575-1581 (2002).
  27. Hu, C., et al. Analytical strategies in lipidomics and applications in disease biomarker discovery. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, 2836-2846 (2009).
  28. Miura, D., et al. Ultrahighly sensitive in situ metabolomic imaging for visualizing spatiotemporal metabolic behaviors. Anal. Chem. 82, 9789-9796 (2010).
  29. Cerruti, C. D., Benabdellah, F., Laprevote, O., Touboul, D., Brunelle, A. MALDI Imaging and Structural Analysis of Rat Brain Lipid Negative Ions with 9-Aminoacridine Matrix. Anal. Chem. 84, 2164-2171 (2012).
  30. Astigarraga, E., et al. Profiling and Imaging of Lipids on Brain and Liver Tissue by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Using 2-Mercaptobenzothiazole as a Matrix. Anal. Chem. 80, 9105-9114 (2008).
  31. Whitehead, S. N., et al. Imaging mass spectrometry detection of gangliosides species in the mouse brain following transient focal cerebral ischemia and long-term recovery. PloS one. 6, e20808 (2011).
  32. Cornett, D. S., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. MALDI-FTICR imaging mass spectrometry of drugs and metabolites in tissue. Anal. Chem. 80, 5648-5653 (2008).
  33. Deininger, S. O., et al. Normalization in MALDI-TOF imaging datasets of proteins: practical considerations. Anal. Bioanalyt. Chem. 401, 167-181 (2011).
  34. Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a MALDI matrix for tissue imaging of lipids by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 8391-8398 (2012).
  35. Han, J., Schey, K. L. MALDI Tissue Imaging of Ocular Lens α-Crystallin. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2990-2996 (2006).
  36. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).
  37. Chen, Y., et al. Imaging MALDI mass spectrometry of sphingolipids using an oscillating capillary nebulizer matrix application system. Meth. Mol. Biology. 656, 131-146 (2010).
  38. Han, J., et al. Towards high throughput metabolomics using ultrahigh field Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics. 4, 128-140 (2008).
  39. Smith, C. A., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).
  40. Wishart, D. S., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37, D603-D610 (2009).
  41. Hoteling, A. J., Erb, W. J., Tyson, R. J., Owens, K. G. Exploring the importance of the relative solubility of matrix and analyte in MALDI sample preparation using HPLC. Anal. Chem. 76, 5157-5164 (2004).
  42. Hoteling, A. J., Mourey, T. H., Owens, K. G. Importance of solubility in the sample preparation of poly(ethylene terephthalate. for MALDI TOFMS. Anal. Chem. 77, 750-756 (2005).
  43. Shroff, R., Rulísek, L., Doubsky, J., Svatos, A. Acid-base-driven matrix-assisted mass spectrometry for targeted metabolomics. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 10092-10096 (2009).
  44. Eikel, D., et al. Liquid extraction surface analysis mass spectrometry (LESA-MS) as a novel profiling tool for drug distribution and metabolism analysis: the terfenadine example. Rapid Comm. Mass Spectrom. 25, 3587-3596 (2011).
  45. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Appl. Surf. Sci. 127 - 129, 226-234 (1998).
  46. O'Connor, P. B., Costello, C. E. Internal Calibration on Adjacent Samples (InCAS) with Fourier Transform Mass Spectrometry. Anal. Chem. 72, 5881-5885 (2000).
  47. Jing, L., Amster, I. J. An improved calibration method for the matrix-assisted laser desorption/ionization-Fourier transform ion cyclotron resononance analysis of 15N-metabolically- labeled proteome digests using a mass difference approach. Eur. J. Mass Spectrom. 18, 269-277 (2012).
  48. Zhang, L. -K., Rempel, D., Pramanik, B. N., Gross, M. L. Accurate mass measurements by Fourier transform mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 24, 286-309 (2005).
  49. Clemis, E. J., et al. Quantitation of spatially-localized proteins in tissue samples using MALDI-MRM imaging. Anal. Chem. 84, 3514-3522 (2012).
  50. Schwamborn, K., Caprioli, R. M. Molecular imaging by mass spectrometry--looking beyond classical histology. Nat. Rev. Cancer. 10, 639-646 (2010).
  51. Oppenheimer, S. R., Mi, D., Sanders, M. E., Caprioli, R. M. Molecular analysis of tumor margins by MALDI mass spectrometry in renal carcinoma. J. Proteome Res. 9, 2182-2190 (2010).

Tags

Basis Protocol oog moleculaire beeldvorming chemie techniek analytisch massaspectrometrie matrix-assisted laser desorptie / ionisatie (MALDI) tandem massaspectrometrie lipide tissue imaging runder lens dithranol matrix FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)
Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H.… More

Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer. J. Vis. Exp. (81), e50733, doi:10.3791/50733 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter