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Biology

एक फूरियर पर मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption / आयनीकरण इमेजिंग के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में Dithranol आयन साइक्लोट्रॉन गूंज मास स्पेक्ट्रोमीटर रूपांतरण

Published: November 26, 2013 doi: 10.3791/50733
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

Summary

Dithranol (डीटी, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-एक) पहले से छोटे अणुओं के ऊतक इमेजिंग के लिए एक MALDI मैट्रिक्स के रूप में बताया गया है, पर अंतर्जात लिपिड की MALDI इमेजिंग के लिए डीटी के इस्तेमाल के लिए प्रोटोकॉल एक ultrahigh संकल्प quadrupole-FTICR साधन पर सकारात्मक आयन MALDI एमएस द्वारा ऊतक वर्गों की सतह यहाँ प्रदान की जाती हैं.

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) मुख्य रूप से MALDI (मैट्रिक्स सहायता प्रदान की लेजर desorption / आयनीकरण) आधारित विश्लेषणात्मक तकनीकों का उपयोग करते हुए, एक ऊतक अनुभाग की सतह पर यौगिकों के स्थानिक स्थानीयकरण और वितरण पैटर्न को निर्धारित करता है. कम आणविक वजन (मेगावाट) यौगिकों का विश्लेषण सुधार कर सकते हैं जो छोटे अणु MSI के लिए नई matrices, जरूरत है. MALDI पृष्ठभूमि संकेतों की कटौती करते हुए इन matrices वृद्धि analyte संकेत प्रदान करना चाहिए. इसके अलावा, इस तरह के फूरियर के रूप में ultrahigh संकल्प उपकरणों का उपयोग आयन साइक्लोट्रॉन प्रतिध्वनि (FTICR) मास स्पेक्ट्रोमीटर, बदलना मैट्रिक्स संकेतों से analyte संकेतों को हल करने की क्षमता है, और यह आंशिक रूप से पृष्ठभूमि MALDI से होने के साथ जुड़े कई समस्याओं को दूर कर सकते हैं मैट्रिक्स. FTICR एमएस द्वारा metastable मैट्रिक्स समूहों की तीव्रता में कमी भी अन्य उपकरणों पर मैट्रिक्स चोटियों के साथ जुड़े हस्तक्षेप से कुछ दूर करने में मदद कर सकते हैं. उच्च संकल्पअभी भी रासायनिक पहचान में आत्मविश्वास प्रदान करते हुए वे एक साथ कई यौगिकों का वितरण पैटर्न का उत्पादन कर सकते हैं जैसे FTICR मास स्पेक्ट्रोमीटर के रूप में उपकरणों फायदेमंद हैं. Dithranol (डीटी, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-एक) पहले से ऊतक इमेजिंग के लिए एक MALDI मैट्रिक्स के रूप में सूचित कर दिया गया है. इस काम में, सकारात्मक आयन MALDI एमएस द्वारा स्तनधारी ऊतक वर्गों की सतहों से अंतर्जात लिपिड की MALDI इमेजिंग, के लिए डीटी के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल, एक ultrahigh संकल्प संकर quadrupole पर FTICR साधन उपलब्ध कराई गई है.

Introduction

मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) एक ऊतक अनुभाग 1,2 की सतह पर यौगिकों के स्थानिक स्थानीयकरण और वितरण पैटर्न को निर्धारित करने के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक है. पेप्टाइड्स और प्रोटीन के विश्लेषण के लिए मैट्रिक्स सहायता प्रदान की लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) MSI एक दशक से अधिक के लिए इस्तेमाल किया गया है और नमूना तैयार करने, संवेदनशीलता का पता लगाने, स्थानिक संकल्प, reproducibility और डाटा प्रोसेसिंग 3,4 के लिए तरीकों में काफी सुधार किया गया है. Histologically दाग वर्गों और MSI प्रयोगों से जानकारी के संयोजन से, पैथोलॉजिस्ट pathophysiologically दिलचस्प सुविधाओं के साथ 5 विशेष यौगिकों का वितरण सहसंबंधी करने में सक्षम हैं.

एक्सोजेनस दवाओं 6,7 और उनके मेटाबोलाइट्स 8-10 सहित छोटे अणुओं का वितरण पैटर्न भी MALDI एमएस ऊतक इमेजिंग 11 से पूछताछ की गई है. लिपिड शायद सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया सीएलए हैंएमएस 12-17 और एमएस / एमएस 18 मोड में दोनों MALDI इमेजिंग के साथ यौगिकों, एस.एस.. छोटे अणु इमेजिंग के लिए MALDI एमएसआई का उपयोग कई कारकों द्वारा सीमित किया गया है: 1) MALDI matrices खुद को प्रचुर मात्रा में आयन संकेतों को उत्पन्न जो छोटे अणुओं (आमतौर मी / z <500), कर रहे हैं. ये प्रचुर संकेतों छोटे अणु analytes की आयनीकरण को दबाने और उनकी पहचान 19,20 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. विलायक मुक्त मैट्रिक्स कोटिंग 21, मैट्रिक्स बनाने की क्रिया 22, और MALDI एमएस 23 precoated मैट्रिक्स, दूसरों के बीच में, छोटे अणुओं की MSI सुधार करने के लिए विकसित किया गया है.

कम मेगावाट यौगिकों के विश्लेषण में सुधार कर सकते हैं कि नई matrices छोटे अणु MSI में बहुत रुचि के हैं. इन matrices कमी आई मैट्रिक्स संकेतों के साथ वृद्धि हुई analyte संकेत प्रदान करना चाहिए. सकारात्मक आयन मोड में, 2,5-dihydroxybenzoic एसिड (DHB) और α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA) MSI 24 के लिए दो आमतौर पर इस्तेमाल किया MALDI एमएस matrices हैं 22,25 के संवेदनशील इमेजिंग के लिए इस मैट्रिक्स के उपयोग की अनुमति दी है लागू करने, बड़े क्रिस्टल प्रपत्र जाता है. 9 Aminoacridine सकारात्मक आयन मोड 26 में और नकारात्मक आयन मोड 26-29 में nucleotides और phospholipids के लिए प्रोटिक analytes की एमएसआई के लिए इस्तेमाल किया गया है. 2 Mercaptobenzothiazole लिपिड 30 के कुशल MALDI पता लगाने दे पाया गया है, और माउस मस्तिष्क के इमेजिंग 31 gangliosides के लिए इस्तेमाल किया गया है. फूरियर के ultrahigh संकल्प आयन साइक्लोट्रॉन प्रतिध्वनि (FTICR) को बदलने मास स्पेक्ट्रोमीटर कुछ हद तक मैट्रिक्स संकेतों 32 से analyte संकेतों को हल करके इस समस्या को कम कर सकते हैं. FTICR एमएस के उपयोग का एक और लाभ metastable मैट्रिक्स समूहों की तीव्रता reduc रहे हैंभी इन interferences 27 कम कर देता है जो एड 33,.

dithranol का उपयोग (डीटी, 1,8-dihydroxy-9 ,10-dihydroanthracen-9-एक) ऊतक इमेजिंग के लिए एक MALDI मैट्रिक्स पहले 34 सूचित किया गया है. इस काम में वर्तमान, एक विस्तृत प्रोटोकॉल सकारात्मक आयन मोड में, गोजातीय लेंस ऊतक वर्गों की सतहों पर अंतर्जात लिपिड MSI के लिए डीटी के उपयोग के लिए प्रदान की जाती है.

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Protocol

1. ऊतक सेक्शनिंग

  1. , तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हुए, एक बार काटा मुद्दे नमूनों, फ्लैश फ्रीज (शिपिंग आवश्यक है, तो) सूखी बर्फ पर उन्हें जहाज, और ऊतक सेक्शनिंग जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान. (वाणिज्यिक नमूनों का इस्तेमाल कर रहे हैं, नमूनों को इस तरह से तैयार हैं सुनिश्चित करें.)
  2. MALDI लक्ष्य फिट करने के लिए एक प्रबंधनीय आकार के अंगों काटें. अंग के किसी भी अवांछित भागों बंद ट्रिम. यहाँ वर्णित इस अध्ययन के लिए, गोजातीय बछड़ा लेंस ऊतक सेक्शनिंग से पहले एक पहले से वर्णित प्रक्रिया 35 का उपयोग Decapsulated गया.
  3. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पूरे अंगों निकालें और एक क्रायोजेनिक ऊतक काटने मंच पर उन्हें ठीक. एक गोजातीय बछड़ा लेंस ठीक करने के लिए, एक cryostat के ऊतक में कटौती के मंच पर पानी की एक या दो बूँदें जगह. यह solidifies से पहले जल्दी से पानी में लेंस जगह. वैकल्पिक रूप से, इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) यौगिकों भी काटने मंच पर एक ऊतक को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अक्टूबर यौगिकों का इस्तेमाल किया जाता है, तो एक छोटाअक्टूबर के मल राशि लागू किया जाना चाहिए और देखभाल कटौती ऊतक वर्गों आयनीकरण और analytes 5,36,37 का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो अक्टूबर यौगिकों के साथ दूषित नहीं होगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए.
  4. Cryostat के अंदर का तापमान -18 डिग्री सेल्सियस को संतुलित करने की अनुमति दें ठंडा या गर्म तापमान क्रमश: नरम या कठिन ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तब भूमध्य रेखा की दिशा में 20 माइक्रोन मोटी स्लाइस में ऊतक में कटौती. सबसे ऊतकों के लिए 10-15 माइक्रोन मोटी स्लाइस का प्रयोग करें, क्योंकि गोजातीय लेंस के ऊतकों के कमजोर प्रकृति का है, तथापि, 20 माइक्रोन मोटी स्लाइस इस्तेमाल किया गया. गोजातीय लेंस ऊतक के लिए, पहले ऊतक वर्गों त्यागने और केवल इक्वेटोरियल विमान के लिए या में बंद कर रहे हैं जो स्लाइस का उपयोग करें.
  5. एक आंख का लेंस ऊतक imaged है, तो एक ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) लेपित गिलास स्लाइड की सतह prewet को फार्मिक एसिड (पवित्रता में 98%, नियंत्रण रेखा एमएस ग्रेड) के 1.5 μl का उपयोग करें.
  6. ध्यान से आईटीओ सह की सतह के लिए ऊतक वर्गों स्थानांतरणcryostat अंदर पैदा कांच सूक्ष्म स्लाइड. ऊतक अनुभाग जल्दी गल जाएगा और स्लाइड सतह को कस कर चिपका हो जाएगा. आमतौर पर, कई ऊतक वर्गों को इस तरह से एक ही आईटीओ में लिपटे स्लाइड पर रखा जा सकता है.
  7. MALDI मैट्रिक्स आवेदन से पहले 15 मिनट के लिए स्लाइड Lyophilize.
  8. मैट्रिक्स परीक्षण के लिए, उपयुक्त विलायकों में व्यक्तिगत matrices भंग. मैन्युअल ऊतक खंड पर प्रत्येक मैट्रिक्स समाधान के 1 μl हाजिर. इसके अतिरिक्त, MALDI संवेदनशीलता के सत्यापन के लिए ऊतक पर एक छोटे अणु अंशांकन मानक हाजिर.
  9. एक सुधार द्रव कलम से आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड के nonconductive सतह पर लिख कर इतो लेपित गिलास स्लाइड के लिए तीन शिक्षण निशान जोड़ें. एक flatbed स्कैनर का उपयोग कर ऊतक स्लाइड की एक ऑप्टिकल छवि ले और यह ऐसी झगड़ा या JPG के रूप में एक उपयुक्त प्रारूप में बचाने के लिए.

2. मैट्रिक्स कोटिंग

2.1. स्वचालित मैट्रिक्स कोटिंग

  1. Apस्वचालित रूप से एक Bruker ImagePrep या इसी तरह इलेक्ट्रॉनिक मैट्रिक्स स्प्रेयर का उपयोग ऊतक वर्गों की सतहों के लिए विलायकों रूप acetonitrile या मिश्रित acetonitrile / पानी रोकने जो प्लाई मैट्रिक्स समाधान,.
  2. मैट्रिक्स कोट स्लाइड के किनारों नहीं करता तो यह है कि टेप के साथ आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड के सामने की सतह के किनारों को कवर. इस विपरीत सतह पर शिक्षण के निशान ऊतक स्लाइड संरेखण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे इतो में लिपटे स्लाइड की विद्युत चालकता बनाए रखने के लिए संपर्क बिंदुओं के रूप में उपयोग किया जाता है के रूप में मैट्रिक्स के साथ स्लाइड के किनारों को कवर नहीं है.
  3. कोट मैट्रिक्स कोटिंग (2 सेक स्प्रे, 30 सेकंड ऊष्मायन, और प्रत्येक चक्र के लिए 60 सेकंड समय सुखाने) के बीस चक्र का उपयोग करके कांच स्लाइड.

2.2. मैनुअल मैट्रिक्स कोटिंग

  1. इलेक्ट्रॉनिक मैट्रिक्स स्प्रेयर के निर्माण सामग्री के साथ असंगत हैं कि कार्बनिक विलायकों (जैसे क्लोरोफॉर्म और एथिल एसीटेट) requi रहे हैंलाल, मैट्रिक्स लागू करने के लिए एक pneumatically की मदद से airbrush स्प्रेयर का उपयोग करें. Airbrush बंदूक की विलायक जलाशय के लिए तैयार मैट्रिक्स समाधान जोड़ें और प्रधानमंत्री स्प्रे करने के लिए दबाव नाइट्रोजन गैस का एक कोमल प्रवाह लागू होते हैं.
  2. मैट्रिक्स कोट स्लाइड के किनारों नहीं करता तो यह है कि टेप के साथ आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड के सामने की सतह के किनारों को कवर. इस विपरीत सतह पर शिक्षण के निशान ऊतक स्लाइड संरेखण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वे इतो में लिपटे स्लाइड की विद्युत चालकता बनाए रखने के लिए संपर्क बिंदुओं के रूप में उपयोग किया जाता है के रूप में मैट्रिक्स के साथ स्लाइड के किनारों को कवर नहीं है.
  3. स्थिर और ठीक स्प्रे मनाया गया है के बाद, मैन्युअल मैट्रिक्स स्प्रे यह पूरी तरह से कोट ऊतक अनुभाग सकें. मुश्किल से संभव analyte delocalization को रोकने के लिए प्रत्येक चक्र के दौरान सतह गीला करने के लिए आवश्यक मैट्रिक्स समाधान की न्यूनतम राशि लागू करें. सामान्य में, कोट करने के लिए मैट्रिक्स स्प्रे के लगभग 10 चक्र एक ऊतक अनुभाग का उपयोग करें, चक्रों की संख्या हैऊतक प्रकार और मैट्रिक्स संरचना पर निर्भर.

3. MALDI एमएस

  1. पानी (अंतिम मिश्रण में 0.1% चींटी एसिड युक्त): 60:40 isopropanol में 1:200 का एक पहलू से "ते ट्यूनिंग मिक्स" मानक समाधान गिराए द्वारा एक जन अंशांकन समाधान तैयार करें.
  2. 2 μl / दोहरे मोड electrospray ionization (ईएसआई) ईएसआई की ओर से FTICR मास स्पेक्ट्रोमीटर पर / MALDI आयन स्रोत, में पतला "ते ट्यूनिंग मिक्स" समाधान के मिनट का परिचय.
  3. ब्रॉडबैंड का पता लगाने और 1024 केबी / सेक का एक डाटा अधिग्रहण के आकार के साथ, सकारात्मक आयन ईएसआई मोड में FTICR साधन कार्य करते हैं. ठेठ ईएसआई मापदंडों केशिका electrospray वोल्टेज, 3900 वी कर रहे हैं, ढाल वोल्टेज, 3600 वी स्प्रे, छिटकानेवाला गैस (एन 2) प्रवाह, 2 एल / मिनट, सूखी गैस (एन 2) प्रवाह और तापमान, 4 एल / मिनट और 200 डिग्री सेल्सियस; 1 वोल्टेज, 15 वी पौना; उड़ान (TOF) के समय, 0.009 सेकंड; टक्कर गैस (Ar) प्रवाह, 0.4 एल / एस; स्रोत आयन संचय समय, 0.1 सेकंड;और टक्कर सेल आयन संचय समय, 0.2 सेकंड. अच्छा समय डोमेन मुक्त प्रेरण क्षय (खूंटी) संकेतों को बनाए रखते हुए, एम / Z 200 से 1400 तक बड़े पैमाने पर सीमा पर विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता को अधिकतम करने के क्रम में ट्यून FTICR आपरेशन मानकों. आमतौर पर, आईसीआर आपरेशन मानकों दिली दोस्त वोल्टेज, 8 वी कर रहे हैं, ऑफसेट वोल्टेज, 8 वी दिली दोस्त, 10 की उत्तेजना प्रवर्धन, उत्तेजना पल्स समय, .01-0.015 सेकंड; सामने जाल प्लेट वोल्टेज, 1.5 वी, वापस जाल प्लेट वोल्टेज, 1.6 वी और विश्लेषक प्रवेश द्वार वोल्टेज, -4 FTICR संचालन मानकों का एक सेट निर्धारित करने के बाद वी., ईएसआई जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण और "ते ट्यूनिंग मिक्स" समाधान में मानक यौगिकों के संदर्भ जनता का उपयोग कर साधन जांचना.
  4. धुन पर MALDI आपरेशन के लिए साधन, 1 माइक्रोन प्रत्येक के एक एकाग्रता में मैट्रिक्स समाधान में एक मिश्रित Terfenadine और Reserpine मानक समाधान के कई 1 μl aliquots भंग, और सीधे Tissu में से एक पर इन समाधान हाजिरई वर्गों एक आईटीओ में लिपटे स्लाइड पर मुहिम शुरू की गई है जो (यानी एक परीक्षण ऊतक अनुभाग). एक ऊतक स्लाइड अनुकूलक (यानी एक विशेष MALDI लक्ष्य) में इतो में लिपटे स्लाइड प्लेस और दोहरी ईएसआई / MALDI आयन स्रोत में MALDI ओर से अनुकूलक लोड. प्रत्येक जन स्कैन के लिए MALDI संकेत संचय, आदि के लिए लेजर शक्ति और लेजर दृश्यों की संख्या के लिए उपयुक्त MALDI परिचालन मापदंडों का अनुकूलन विशिष्ट MALDI संचालन मानकों हैं: लेजर शॉट, 50, और 300 वी. के एक MALDI थाली वोल्टेज
  5. ट्यूनिंग के बाद, औजार, और MALDI-MSI प्रयोगों के लिए साधन के अनुकूलन इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर इसकी दर्ज ऑप्टिकल छवि के साथ imaged किया जा करने के लिए एक ऊतक अनुभाग के भौतिक स्थान संरेखित. एक तीन सूत्री त्रिभुजन विधि का उपयोग इस संरेखण के लिए पहले से आईटीओ में लिपटे स्लाइड सतह की विपरीत दिशा (कदम 1.9) पर डाल दिया गया था जो तीन "सुधार द्रव" के निशान, का प्रयोग करें.
  6. एक साथ ईएसआई और मल प्रदर्शन करनाडि आपरेशन प्रत्येक जन स्पेक्ट्रम अधिग्रहण के बाद आंतरिक जन अंशांकन के लिए "ते ट्यूनिंग मिक्स" समाधान के संदर्भ जन चोटियों शामिल हैं. इस MALDI एमएस दौरान सबसे सटीक जन माप का परिणाम देगा. ऐसा करने के लिए, पहले ईएसआई calibrant संकेतों आंतरिक जन अंशांकन के लिए अभी भी काफी अधिक हैं, जबकि MALDI संकेत स्पेक्ट्रा हावी तक केशिका वोल्टेज कम से ईएसआई संकेत attenuate.
  7. अगला, लेजर विकिरण के लिए एक स्वचालित rastering विधि की स्थापना की. Imaged किया जा ऊतक क्षेत्रों को परिभाषित करने और उचित लेजर रेखापुंज कदम आकार निर्धारित किया है. छोटे रेखापुंज कदम आकार उच्च संकल्प ऊतक छवियों को प्रदान ध्यान दें कि, लेकिन एक काफी लंबे समय तक जन वर्णक्रमीय अधिग्रहण के समय और अधिक डेटा भंडारण स्थान की आवश्यकता होती है. छवि पिक्सल की संख्या निर्धारित करने के लिए लेजर रेखापुंज कदम आकार और ऊतक आकार पर निर्भर है. एक 1 सेमी 2 टिशू आकार है जो एक विशिष्ट गोजातीय लेंस के लिए, एक ऊतक छवि आमतौर पर सीए से बना है.

4. डेटा विश्लेषण

  1. प्रारंभिक तुलना के लिए आंतरिक अंशांकन का उपयोग MALDI जन स्पेक्ट्रा जांचना और एमएस / एमएस के लिए चोटियों का चयन करने के लिए. De-आइसोटोप और एक स्वनिर्धारित VBA स्क्रिप्ट 38 का उपयोग करते हुए, पहले से वर्णित के रूप में monoisotopic चोटियों का चयन करें.
  2. निर्यात monoisotopic शिखर सूचियों और metlin 39 और / या पुस्तकालय प्रविष्टियों के साथ बड़े पैमाने पर मिलान के लिए HMDB 40 metabolome डेटाबेस में इनपुट मापा मी / z मूल्यों जिसके परिणामस्वरूप. ± 1 पीपीएम के एक स्वीकार्य जन त्रुटि के साथ, डेटाबेस खोजों के दौरान (एम + एच) +, (एम + ना) +, और (एम + K) + आयनों पर विचार करें.
  3. Imag का उपयोग पूरे ऊतक अनुभाग में पता चला लिपिड संस्थाओं के सभी के लिए MALDI छवियों को उत्पन्नचोटी शीर्ष पर 1 पीपीएम के एक जन फिल्टर चौड़ाई के साथ ई विश्लेषण सॉफ्टवेयर,.
  4. छवियों डेटाबेस प्रविष्टियों से मेल खाने वाले सभी मी / z मूल्यों के लिए उत्पन्न किया गया है एक बार, बाद में जांच की जा सकती है कि अद्वितीय वितरण पैटर्न के लिए देखने के साथ ही अन्य सभी चोटियों के लिए छवियों को उत्पन्न करते हैं.

5. Imaged लिपिड की पहचान की पुष्टि

  1. MALDI-MS/MS द्वारा, FTICR साधन (phospholipids के लिए जैसे 184.073) का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है कि विशेषता टुकड़ा आयनों है जो उच्च बहुतायत लिपिड, की पहचान की पुष्टि. सीधे ऊतक पर टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) का उपयोग MALDI-MS/MS प्रदर्शन करना.
  2. सीधे MALDI-MS/MS से इसकी पुष्टि नहीं की जा सकती कि उन लिपिड प्रजातियों के लिए, एक क्यू TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर 34 करने के लिए मिलकर एक UPLC प्रणाली का उपयोग करें.
    1. मैन्युअल ब्याज की प्रजातियों स्थानीयकृत किया गया था जहां क्षेत्र से ऊतक की ~ 10 मिलीग्राम से युक्त aliquots काटना. 2 में इन ऊतकों aliquots रखेंएमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों.
    2. दो 5 मिमी स्टेनलेस स्टील धातु गेंदों के साथ एक मिक्सर चक्की का उपयोग, पानी के 250 μl में प्रत्येक ऊतक विभाज्य homogenize.
    3. क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल समाधान (01:03, वी / वी), और भंवर ट्यूब के 1 मिलीलीटर जोड़ें. इसके बाद, 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर एक microcentrifuge का उपयोग ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
    4. Supernatants इकट्ठा करने और एक रोटरी गति शून्य concentrator में उन्हें सूखी.
    5. पानी: 30:70 isopropanol के 100 μl में अवशेष भंग. ढाल क्षालन का उपयोग कर अलग होने के लिए UPLC स्तंभ पर एक 10 μl विभाज्य इंजेक्षन.
    6. पहले 34 प्रकाशित किया गया है जो ऑन लाइन लिपिड LC-MS/MS, के लिए chromatographic शर्तों का उपयोग करें.
    7. उत्पन्न निकाले आयन वर्तमान (XIC) सैद्धांतिक जनता के आसपास ± 50 पीपीएम के एक खिड़की के साथ, सैद्धांतिक मी / z मानों का उपयोग chromatograms.
    8. उन लिपिड के लिए प्रामाणिक यौगिकों उपलब्ध हैं, Corre के लोगों के साथ प्रामाणिक यौगिकों की अवधारण बार मैचऊतकों के नमूनों से XIC चोटियों sponding. यौगिकों वही कर रहे हैं, तो अवधारण समय और एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा मैच चाहिए.
  3. एक प्रामाणिक परिसर में उपलब्ध नहीं है, तो ऐसे metlin या HMDB के रूप में एक metabolome डेटाबेस से एक मानक एमएस / एमएस स्पेक्ट्रम मैच के लिए पता लगाया लिपिड के विखंडन पैटर्न का उपयोग करें. लिपिड के लिए एक संभव संरचना निर्धारित करने के लिए नए सिरे से जन वर्णक्रमीय व्याख्या का प्रयोग करें.

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Representative Results

आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड पर sectioned और पिघलना बढ़ रहे हैं कि ऊतक के नमूने दिखाई फाड़ के बिना, अक्षत होना चाहिए. कई ऊतकों के लिए, एक आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड पर बढ़ते प्रत्यक्ष ऊतक पिघलना स्वीकार्य है. बढ़ते प्रत्यक्ष पिघलना (चित्रा 1 ए) का इस्तेमाल किया जाता है जब इस तरह के गोजातीय लेंस के रूप में कुछ विशिष्ट ऊतकों के लिए, ऊतक के व्यापक फाड़ अक्सर देखा जाता है. इथेनॉल या फार्मिक एसिड के साथ आईटीओ कांच स्लाइड के पूर्वलेपन (चित्रा 1 बी) के बढ़ते ऊतक दौरान ऊतक वर्गों की अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है.

मैट्रिक्स के चुनाव और विलायक का चयन दोनों MALDI स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता को प्रभावित करने में महत्वपूर्ण कारक हैं. एक उपयुक्त MALDI एमएस स्पेक्ट्रम ऊतक अनुभाग से प्राप्त कर लिया गया है, जब बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम जन पता लगाने रेंज (चित्रा 2A) के भीतर लिपिड संकेतों के साथ आमतौर पर घना है. वे छोर इतनी है कि एक मैट्रिक्स और एक विलायक चुना जाना चाहिए. ONT आकार: 14.399999618530273px; लाइन ऊँचाई: 28px; MALDI प्रक्रिया मैट्रिक्स क्रिस्टल में analyte की एक ठोस चरण समाधान की आवश्यकता है क्योंकि "> ब्याज की analytes के समान है, आम तौर पर सबसे अच्छा analyte संकेत तीव्रता उपयोग से आते हैं वांछित analytes की है कि इसी तरह solubilities साथ MALDI matrices के 41,42. चित्रा 2A (0.01% TFA के साथ 70% ACN) एक कुशल मैट्रिक्स विलायक के साथ उत्पादित एक स्पेक्ट्रम का एक उदाहरण से पता चलता है, और चित्रा 2B मैट्रिक्स की एक गरीब पसंद से पता चलता है और dithranol के लिए विलायक (0.01% TFA के साथ 70% MeOH).

एक दोहरे मोड electrospray ionization (ईएसआई) के लाभों में से एक / MALDI आयन स्रोत इसके साथ ही पृथक प्रक्रिया के साथ दखल के बिना MALDI स्पेक्ट्रा प्राप्त करते हुए ईएसआई calibrant संकेतों के अलावा की अनुमति देता है. ये ईएसआई calibrant संकेतों <0.5 पीपीएम 38 की बड़े पैमाने पर त्रुटि के साथ उच्च जन सटीकता प्रदान करने के लिए आंतरिक जन अंशांकन के लिए अनुमति देते हैं. जैसामानक "ते ट्यूनिंग मिक्स" समाधान के ईएसआई संकेत ऊतक से analytes की MALDI संकेतों की तुलना में मजबूत परिमाण के एक आदेश हो सकता है, ईएसआई व्युत्पन्न calibrant संकेत तनु किया जाना चाहिए. Calibrant संकेत दिखाई और स्पेक्ट्रा की जांच के लिए पर्याप्त तीव्रता का होना चाहिए, लेकिन स्पेक्ट्रा हावी नहीं होना चाहिए.

एक MALDI-MSI प्रयोग से जन स्पेक्ट्रा के सेट का अधिग्रहण किया गया है, पता लगाया आयनों से प्रत्येक के लिए छवि एक ऊतक अनुभाग की सतह से एक लेजर विकिरण मौके का प्रतिनिधित्व प्रत्येक पिक्सेल के साथ उत्पन्न किया जा सकता है. एक MALDI MSI प्रयोग से ऊतक अनुभाग भर में विभिन्न आयन तीव्रता के साथ व्यक्तिगत पिक्सल के सभी संयोजन ऊतक 1 के भीतर लक्ष्य analytes की आयनीकरण को दर्शाता है. यह, बारी में, ऊतक अनुभाग (चित्रा 3 बी) के विभिन्न भागों में analytes की रिश्तेदार सांद्रता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं. देखभाल के प्रसंस्करण में लिया जाना चाहिएकई कारकों के बाद से डेटा देखा है क्या प्रभावित करते हैं और डेटा व्याख्या की है कैसे कर सकते हैं. सबसे प्रयोगों में, डेटा प्रत्येक स्पेक्ट्रम के भीतर कुल आयन वर्तमान (घरेलू) के लिए सामान्यीकृत है. इस सामान्य बनाने के बिना, बेहतर analyte मैट्रिक्स सह क्रिस्टलीकरण (यानी तथाकथित 'हॉट स्पॉट') के साथ क्षेत्रों analytes के लिए मजबूत संकेतों के कारण सकता है और इस बात का वास्तविक रिश्तेदार सांद्रता के साथ अच्छी तरह से मेल नहीं हो सकता है कि जानकारी प्रदान करके डेटा तिरछा होता analytes (आंकड़े -3 सी-3D).

ऊतक तैयारी भी नाटकीय रूप से उत्पन्न होता है कि छवि बदल सकते हैं. नमूना (यानी बहुत ज्यादा विलायक लागू किया गया था) "भी गीला" है, तो analytes ऊतक पर delocalize जाएगा और स्थानिक जानकारी के बहुत (चित्रा 3F) नष्ट हो जाएगी. डाटा अधिग्रहण की विधि प्राप्त अंतिम छवि में भी महत्वपूर्ण है. अनुपचारित ऊतक वर्गों पर MALDI प्रयोगों स्वाभाविक "गंदा & # रहे हैं34;, साधन की संवेदनशीलता समय के साथ कम हो सकती है. कम प्रयोगों के लिए यह कमी स्पष्ट नहीं हो सकता है, लेकिन यह अब प्रयोगों या विशेष रूप से गंदा नमूने के लिए एक समस्या हो सकती है. डेटा नमूना भर रैखिक हासिल कर ली है, तो साधन की संवेदनशीलता की कमी आई है के बाद ऊतक अनुभाग के विशिष्ट क्षेत्रों का विश्लेषण किया जाएगा के रूप में यह एक स्थानीय पूर्वाग्रह पैदा कर सकते हैं. इसलिए, सभी डेटा अधिग्रहण के लिए यादृच्छिक स्पॉट का उपयोग की सिफारिश की है. इस विधि में अधिक समय लगता है, यह डेटा में इस पूर्वाग्रह को दूर या कम से कम करने में मदद करता है.

CHCA और DHB की तुलना में जब हमारे पिछले पेपर 34 में दिखाया गया है लिपिड CHCA और DBH अभी भी पता लगाया जा सकता है के साथ पाया जबकि, डीटी, अतिरिक्त लिपिड प्रजातियों का पता लगाने में सक्षम बनाया.

चित्रा 1 >
चित्रा 1. ऊतक बढ़ते और कटौती. फार्मिक एसिड prewetting (एक), और फार्मिक एसिड prewetting साथ बिना दो गोजातीय बछड़ा लेंस ऊतक वर्गों (20 माइक्रोन मोटी) का तुलनात्मक ऑप्टिकल छवियों, (ख), आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड पर घुड़सवार.

चित्रा 2
चित्रा 2. . जन स्पेक्ट्रा MALDI एमएस स्पेक्ट्रा एक ऊतक अनुभाग से सीधे प्राप्त कर लिया: एक) एक आदर्श 0.01% TFA साथ लिपिड संकेतों के साथ घनी आबादी वाले जन स्पेक्ट्रम (70% ACN), ख) के एक गरीब विकल्प के साथ लेपित एक ऊतक अनुभाग से उत्पन्न एक जन स्पेक्ट्रम विलायक (0.01% TFA के साथ 70% MeOH). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 3. MALDI MSI छवियों प्रतिनिधि MALDI MSI छवियों: एक) एक गोजातीय लेंस ऊतक अनुभाग, एक ही ऊतक अनुभाग के ख) एक MSI छवि, ग) एक MSI छवि एक पृष्ठभूमि आयन दिखा, उसी आयन ई की घ) एक nonnormalized आयन नक्शा). एक गोजातीय लेंस ऊतक अनुभाग, और एफ) के कारण overwetting के लिए एक आंशिक रूप से delocalized analyte दिखा एक आयन नक्शा.

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Discussion

सफल MALDI MSI के लिए सबसे महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं: 1) ऊतक तैयारी, 2) मैट्रिक्स चुनाव, 3) मैट्रिक्स आवेदन, और 4) डेटा की व्याख्या और विश्लेषण. नमूना और मैट्रिक्स उचित तैयार कर रहे हैं, एमएस डाटा अधिग्रहण स्वचालित है. इस प्रकार के परीक्षण से डेटा विश्लेषण काफी श्रम प्रधान है.

उचित ऊतक तैयारी सफल MALDI MSI प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. ऊतक के स्रोत और हैंडलिंग अंतिम विश्लेषण पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है. नमूनों कुछ मेटाबोलाइट्स सेल्सियस भी -80 पर अस्थिर हो सकता है के रूप में तुरंत, तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत फ्लैश, और वे समय की एक विस्तारित अवधि के लिए भंडारित नहीं किया जाना चाहिए होना चाहिए

कई स्तनधारी ऊतकों के लिए, 10-15 माइक्रोन मोटी ऊतक स्लाइस MALDI MSI के लिए सिफारिश की गई है. इन प्रयोगों में, गोजातीय बछड़ा लेंस 20 माइक्रोन मोटी ऊतक है में भूमध्य रेखा की दिशा में काट रहे थेएक पहले से वर्णित प्रक्रिया 35 का उपयोग कर लेंस decapsulation निम्नलिखित lices. यह ऊतक काटने के दौरान और बढ़ते ऊतक के दौरान दोनों एक लेंस ऊतक अनुभाग की अखंडता को बनाए रखने के लिए मुश्किल पाया गया था क्योंकि मोटा गोजातीय बछड़ा लेंस ऊतक वर्गों इस्तेमाल किया गया. लेंस अपनी इक्वेटोरियल विमान के साथ एक स्फेरिकली सममित ऊतक, इसलिए करने के लिए, या कम से करीब थे जो केवल स्लाइस, इक्वेटोरियल विमान एकत्र किए गए है.

कारण (लिपिड के लिए) या ​​चींटी एसिड (प्रोटीन और पेप्टाइड्स 35 के लिए) ऊतक काटने के दौरान ऊतक अखंडता को बनाए रखने और बढ़ते हैं, इथेनॉल जैसे एक विलायक का उपयोग prewetting में कठिनाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी प्रोटीन और पेप्टाइड इमेजिंग के लिए, नमूने अक्सर बढ़ते के लिए इस्तेमाल किया लिपिड और अक्टूबर सहित छोटे अणुओं को निकालने के लिए एक कार्बनिक विलायक के साथ धो रहे हैं, उस पर ध्यान दिया जाना चाहिए, लेकिन, एक कपड़े धोने कदम ही भंग नहीं है कि विलायकों के साथ किया जाना चाहिए ब्याज की analytes, और SMA के लिए नहीं होना चाहिएडालूँगा अणु विश्लेषण.

मैट्रिक्स का चुनाव भी सभी MALDI प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन, पर ऊतक मैट्रिक्स प्रदर्शन एक शुद्ध मानक के साथ मैट्रिक्स प्रदर्शन के रूप में ही नहीं हो सकता. उदाहरण के लिए, कम से कम लेजर सत्ता पर, डीटी ऊतक से मुक्त मैट्रिक्स धब्बे और इन संकेतों डीटी oligomers और उनके इसी सोडियम और पोटेशियम adducts रूप में सौंपा गया से प्रचुर मात्रा में डीटी संबंधी पृष्ठभूमि संकेतों उत्पन्न, लेकिन, ऊतक पर, इन संकेतों के कई थे चुनाव के विशिष्ट नमूना पर अलग matrices के परीक्षण के लिए एक दिया MALDI एमएसआई के विश्लेषण के लिए उचित मैट्रिक्स के चयन में महत्वपूर्ण हो सकता है कि यह दर्शाता है, नहीं मनाया. डीटी शायद ही कभी कारण मैट्रिक्स द्वारा उत्पन्न की सूचना उच्च पृष्ठभूमि को लिपिड विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, MALDI-FTICR एमएस द्वारा लिपिड पर ऊतक रूपरेखा के लिए DHB और CHCA के साथ तुलना में हालांकि, जब डीटी अनुकूल परिणाम का उत्पादन किया. इस प्रकार इस मैट्रिक्स इस उपकरण का उपयोग कर MALDI ऊतक इमेजिंग के लिए एक संभावित उपयोगी मैट्रिक्स हो सकता है

कुशल मैट्रिक्स के सह क्रिस्टलीकरण और analyte उच्च संवेदनशीलता MALDI एमएस विश्लेषण के लिए एक शर्त है. इस प्रकार मैट्रिक्स में एक analyte की ठोस चरण घुलनशीलता MALDI प्रक्रिया 41,42 में महत्वपूर्ण है. वांछित analytes के समान ही solubilities साथ MALDI matrices मजबूत analyte संकेत तीव्रता का उत्पादन करने के लिए सूचित किया गया है. डीटी शास्त्रीय Brønsted-लौरी एसिड आधार निराकरण सिद्धांत 43 और घुलनशीलता के सिद्धांत पर आधारित एक कमजोर कार्बनिक अम्ल, साथ ही एक बहुत हाइड्रोफोबिक कार्बनिक यौगिक है, क्योंकि यह सकारात्मक आरोप लगाया और कम ध्रुवीय का आयनीकरण पक्ष की उम्मीद है यौगिकों. वास्तव में, हम डीटी मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल किया गया था जब ध्रुवीय लिपिड सकारात्मक आयन मोड में पाया यौगिकों प्रभुत्व पाया.

एक मैट्रिक्स समाधान तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया विलायकों भी MALDI एमएस द्वारा प्रत्यक्ष ऊतक विश्लेषण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. पीएच एक के रूप में शामिल किया गया हैमहत्वपूर्ण एक मैट्रिक्स के प्रभाव में कारक, और TFA CHCA और DHB के साथ इस्तेमाल एक आम additive है. हालांकि, डीटी के साथ, एक एसिड या आधार संशोधक के अलावा परिणामी डेटा पर खास असर नहीं पड़ा. क्योंकि डीटी और ध्रुवीय विलायकों में अपने सीमित घुलनशीलता की hydrophobicity की, एक lipophilic कार्बनिक विलायक की सिफारिश की है. लिपिड का विश्लेषण, क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल का एक मिश्रण (2:1, वी वी) लिपिड निकासी के लिए एक विशिष्ट जैविक विलायक है जो 1% चींटी एसिड, साथ इस्तेमाल किया गया था. हम इस डीटी साथ लिपिड की बेहतर सह क्रिस्टलीकरण प्रदान करता है कि माने. पिछले तरल निष्कर्षण सतह विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LESA एमएस) प्रयोगों 44 में प्रदर्शन के रूप में विलायक के lipophilic प्रकृति भी, इस तरह के प्रोटीन और लवण जैसे अन्य यौगिकों की solubilization रोक सकता है. यह कम contaminants के साथ मैट्रिक्स और लिपिड के बेहतर क्रिस्टलीकरण के लिए नेतृत्व करेंगे. विश्लेषण के लिए चुना जाता है कि विलायक प्रणाली मैट्रिक्स की घुलनशीलता और देसी अधिकतम करने चाहिएलाल analytes (लिपिड) अवांछित contaminants (लवण और प्रोटीन / पेप्टाइड) की घुलनशीलता जबकि कम से कम.

ऊतक की सतह पर मैट्रिक्स की कोटिंग संभव के रूप में समान रूप से किया जाना चाहिए. छवि के स्थानिक संकल्प को अधिकतम करने के लिए, क्रिस्टल आकार संभव के रूप में 45 के रूप में छोटा होना चाहिए. एक इलेक्ट्रॉनिक मैट्रिक्स स्प्रेयर का उपयोग करना, मैट्रिक्स एक छोटे क्रिस्टल के आकार के साथ समान रूप से और reproducibly लेपित किया जा सकता है. यह हमारी प्रयोगशाला में पसंदीदा तरीका है. यह स्थान आकार, एकरूपता, और reproducibility कम कर देता है के रूप में यह बहुत मैनुअल आवेदन को प्राथमिकता दी जाती है. हालांकि, छोटे अणुओं का एमएसआई के लिए उपयोगी होते हैं कि विलायकों के कई स्वचालित मैट्रिक्स स्प्रेयर के निर्माण में प्रयुक्त सामग्री के साथ संगत नहीं हैं. अभी तक हमारी प्रयोगशाला में लागू नहीं है, उच्च बनाने की क्रिया आधारित मैट्रिक्स आवेदन लिपिड विश्लेषण 22 के लिए सिफारिश की गई है. इस पद्धति में सुधार (यानी कम) स्थान आकार, एकरूपता, और reproduc प्रदान करता हैibility और चयनित मैट्रिक्स इस विधि को मिलनसार है जब यह शायद पसंद की विधि होना चाहिए.

(क्लोरोफॉर्म सहित) स्वचालित मैट्रिक्स स्प्रेयर के साथ असंगत सॉल्वैंट्स युक्त matrices की कोटिंग के लिए, मैट्रिक्स कोटिंग का एक वैकल्पिक तरीका एक एयर ब्रश बंदूक का उपयोग करने के लिए है. इन मैट्रिक्स समाधान के लिए, हम एक pneumatically सहायता प्रदान की airbrush स्प्रेयर का इस्तेमाल किया. हवा ब्रश बंदूक का उपयोग एक आदर्श तरीका नहीं है, यह अन्य तरीकों के साथ असंगत हैं जो विलायकों और matrices के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि केवल विधि हो, और साथ प्रशिक्षण और अनुभव यह बहुत वर्दी मैट्रिक्स कोटिंग उत्पन्न कर सकते हैं कर सकते हैं. मैन्युअल रूप से मैट्रिक्स समाधान लागू करने, तरल के केवल न्यूनतम राशि मुश्किल से ऊतक की सतह गीला करने के लिए प्रत्येक चक्र के दौरान लागू किया जाना चाहिए. बहुत अधिक तरल संभावित कार्बनिक विलायकों के कारण analytes delocalize सकता है. मैनुअल आवेदन और अनुभव के साथ reproducibility के मुद्दों पर इस विधि के साथ स्लाइड कोटिंग में कर रहे हैं मैंसफलता के लिए आवश्यक है. कारण हवा ब्रश बंदूक मैट्रिक्स आवेदन का मार्गदर्शन करने के लिए प्रकृति, देखभाल एक समान कोटिंग किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए, एक inhomogeneous कोटिंग मैट्रिक्स कोटिंग और नहीं analyte स्थानीयकरण का प्रतिनिधि है, जो विषम डाटा को चुरा सकते हैं.

MALDI MSI प्रयोगों का आयोजन करते हैं, तो पता चला analytes की प्रारंभिक पहचान आमतौर पर एक उच्च संकल्प साधन 38 प्रयोग किया जाता है जब आम तौर पर ही उपलब्ध हैं, जो मापा सटीक जनता की metabolome डेटाबेस खोज पर आधारित है. सुप्रीम-Qe 12 टेस्ला संकर quadrupole-FTICR मास स्पेक्ट्रोमीटर पर दोहरी ईएसआई / MALDI आयन स्रोत / MALDI desorption को प्रभावित किए बिना, प्रत्येक MALDI जन स्पेक्ट्रम के लिए आंतरिक जन calibrant चोटियों के रूप में उपयोग के लिए ईएसआई उत्पन्न संकेतों के अलावा के लिए अनुमति देता है आयनीकरण प्रक्रिया. आंतरिक जन अंशांकन का उपयोग MALDI-FTICR में उच्च जन माप सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है. बाहरी अंशांकन पूरी तरह से ध्यान में नहीं ले सकतेआईसीआर सेल 46-48 के भीतर अंतरिक्ष प्रभारी प्रभाव. FTICR की ट्यूनिंग और अंशांकन सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. साधन के इस प्रकार पर यह विश्लेषक (आईसीआर सेल) को टक्कर सेल से यात्रा करने के लिए एक आयन के लिए समय लेता है जो "उड़ान के समय" (TOF) नामक एक पैरामीटर, सबसे महत्वपूर्ण में से एक है उपयोगकर्ता परिभाषित एक FTICR साधन का पता लगाने संवेदनशीलता को प्रभावित करने वाले सेटिंग्स. किसी दिए गए जन रेंज (यानी मी / z 200-1,400) के भीतर, एक कम TOF कम मी / z आयनों का पता लगाने के पक्ष में है और एक उच्च TOF उच्च मी / z आयनों का पता लगाने के पक्ष में है. इस प्रकार, का पता लगाने के लिए बड़े पैमाने पर सीमा के भीतर दोनों कम और उच्च मी / z आयनों की उच्च संवेदनशीलता का पता लगाने के लिए, 9 मिसे के एक TOF मूल्य वांछनीय है.

एक व्यावहारिक प्रयोग के लिए, एक व्यापार बंद उचित डाटा अधिग्रहण आकार, सामूहिक संकल्प, और एमएस इमेजिंग डेटा प्राप्त करने पर खर्च समय के बीच बनाया जाना चाहिए. एक FTICR एमएस प्रयोग के लिए, प्राप्त डेटा फ़ाइल का आकार और द्रव्यमान resolutiपर मुक्त प्रेरण क्षय (खूंटी) संकेत के डाटा अधिग्रहण आकार पर निर्भर कर रहे हैं. एक उच्च डाटा अधिग्रहण आकार एक उच्च सामूहिक संकल्प और एक बड़ा डेटा फ़ाइल आकार में परिणाम होगा. हालांकि, एक उच्च डाटा अधिग्रहण का आकार भी एक धीमी एमएस स्कैन दर का कारण बनता है. एक व्यापार बंद के रूप में, यह 1024 केबी / सेक का एक डाटा अधिग्रहण आकार FTICR पर इस्तेमाल किया जा सिफारिश की है. एक कम डाटा अधिग्रहण आकार और एक इसी कम सामूहिक संकल्प कुछ समदाब रेखीय आयन प्रजातियों की जुदाई की अनुमति नहीं है.

यह ब्याज की analytes की एमएस छवियों के लिए एक अच्छा पिक्सेल संकल्प प्रदान करने के लिए काफी छोटा है कि इतनी लेजर रेखापुंज कदम आकार भी चुना जाना चाहिए, लेकिन, एक बहुत छोटी रेखापुंज कदम आकार डेटा एक एमएस इमेजिंग डेटा फ़ाइल पर असहनीय फाइल कर सकते हैं MALDI जन स्पेक्ट्रा के हजारों से बना है. गोजातीय लेंस के अपेक्षाकृत बड़े आकार, सीए. 1.2 व्यास में -1.5 सेमी देखते हुए, हम 250 माइक्रोन की एक रेखापुंज कदम आकार इस्तेमाल किया. एक 1024 केबी / सेक डेटा acqu का प्रयोगisition आकार और एक 250 माइक्रोन रेखापुंज कदम आकार, हमारे नमूना डाटासेट लगभग 60 जीबी था. इस वजह से धीरे - धीरे संकेत क्षीणन के लिए स्थान आधारित पूर्वाग्रह से बचाता है के रूप में डाटा अधिग्रहण के दौरान, एक यादृच्छिक स्थान विश्लेषण, इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन, यादृच्छिक हाजिर डेटा प्राप्त करने के लिए अब काफी समय की आवश्यकता है.

हमारे FTICR एमएस साधन पर हासिल कर लिया MALDI MSI डेटासेट सटीक सामूहिक डेटा शामिल है, क्योंकि निकाला मी / z ऐसे metlin और / या HMDB रूप metabolome डेटाबेस के खिलाफ खोजा जा सकता है. एक ± 1 पीपीएम खिड़की का प्रयोग मेटाबोलाइट्स के लिए कई आयन संकेतों के प्रारंभिक कार्य उच्च आत्मविश्वास की हैं. कई प्रजातियों ही रासायनिक सूत्र है क्योंकि हालांकि, आईडी की पुष्टि अक्सर वैकल्पिक साधनों का उपयोग किया जाना चाहिए. इस प्रकार, एमएस / एमएस प्रयोगों, और पहले से प्रकाशित आंकड़ों के साथ एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा की तुलना में एक विश्वास की पहचान के लिए किया जाना चाहिए. MALDI-MS/MS स्पेक्ट्रा कभी कभी FTICR साधन पर सीधे हासिल कर ली, लेकिन माँ के लिए किया जा सकता हैNY लिपिड अणु, उनके abundances और / या आयनीकरण क्षमता उपयोगी एमएस / एमएस डेटा प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त हैं, और पूर्व LC-MS/MS को संवर्धन और शुद्धि के लिए आवश्यक हैं. इन विश्लेषण में, मनाया लिपिड की सबसे ध्रुवीय फॉस्फोलिपिड थे, और पीसी, पीई, एसएमएस, पीएसएस, पीजीएस, पीए, और ceramide फॉस्फेट (CerPs) के रूप में सौंपा गया, पहचान अन्य लिपिड अणु स्टेरोल लिपिड, एसाइल carnitines, और ग्लिसराइड शामिल हैं. विलायक और मैट्रिक्स के गुणों के आधार पर, यह उम्मीद की जा रही है. पीसी के एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा ध्रुवीय पीसी सिर समूह, phosphocholine, साथ ही अणुओं की स्पष्ट पहचान दे सकते हैं जो अतिरिक्त संरचना की दृष्टि से महत्वपूर्ण जानकारी, के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है जो मी / z 184.073, पर एक प्रमुख शिखर होते हैं. साथ ही, इस विधि का उपयोग कर, कई स्टेरोल लिपिड पता चला रहे हैं, लेकिन, सबसे असंदिग्ध रूप से भी एमएस / एमएस डेटा के साथ, अद्वितीय पहचान को नहीं सौंपा जा सकता. मजबूत पोटेशियम adducts आम तौर पर स्पेक्ट्रा प्रबल होना, लेकिन protonated और sodiateडी adducts भी पता लगाया जा सकता है.

MALDI एमएस प्रक्रिया केवल प्रत्येक पिक्सेल के भीतर स्थानीय आयनीकरण दक्षता पर आधारित रिश्तेदार बहुतायत जानकारी प्रदान करने में सक्षम है क्योंकि स्थिर आइसोटोप लेबल आंतरिक मानकों 49 बिना MALDI MSI डेटा की व्याख्या करते हैं, तो ध्यान रखा जाना चाहिए. इसके अलावा, स्थानीयकरण परिणामों में विश्वास के लिए, पता चला किसी भी वितरण पैटर्न की पुष्टि वैकल्पिक तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए. पुष्टि के लिए विच्छेदित ऊतकों के नमूनों पर प्रदर्शन LC-MS/MS की सिफारिश की है.

कम द्रव्यमान सीमा रासायनिक फार्मूले में मापा सटीक जनता के आधार पर एक दिया मी / z के लिए उत्पन्न किया जा सकता है, एक 1 पीपीएम जन त्रुटि के भीतर और अनुमति सी, एच, ओ, और एन के एक असीमित संख्या, और 2 एस की एक अधिकतम और 2 पी अक्सर केवल एक ही मौलिक रचना संभव है. इस मी / z भी संभावित उम्मीदवार यौगिकों उपज हो सकती है जो HMDB और metlin डेटाबेस के खिलाफ खोजा जा सकता है. दुर्भाग्य से,FTICR एमएस पर कम द्रव्यमान कट ऑफ सीए है. यह मुश्किल सीधे एमएस / एमएस प्रदर्शन करने के लिए कर सकते हैं जो 130 दा,. इस प्रकार, एक अन्य प्रणाली का उपयोग कर पुष्टि अक्सर आवश्यक है.

क्यू TOF LC-MS/MS प्रयोगों आमतौर पर मैन्युअल रूप से ब्याज के ऊतकों के विशिष्ट क्षेत्रों से विच्छेदित किया गया है जो ऊतकों के नमूनों पर आयोजित की जाती हैं. वर्णित लिपिड निष्कर्षण विधि का प्रयोग, XICs लक्ष्य यौगिकों के लिए उत्पन्न किया जा सकता है और एमएस / एमएस पुष्टि के लिए अधिग्रहीत की जा सकती है. एक विश्वास रासायनिक असाइनमेंट वहाँ हो सकता है पहले एक प्रामाणिक मानक की तुलना या नए सिरे से संरचनात्मक व्याख्या या तो आवश्यक है.

Dithranol गोजातीय बछड़ा लेंस में लिपिड वितरण पैटर्न का पता लगाने के लिए किया जाता है और यह भी चूहे जिगर, दिल और गुर्दे के ऊतकों 34 पर परीक्षण किया गया है. MALDI MSI मानव रोग राज्यों के निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह पहले से ही वैकृत विश्लेषण 50 के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. और अधिक मजबूत के विकास और तेजी से टी के साथMALDI MSI, विशिष्ट यौगिकों के स्थानिक स्थानीयकरण के लिए echnologies एक रोगविज्ञानी के लिए उपयोगी जानकारी हो सकती है. एक analyte नियमित रूप से एक MALDI MSI आधारित पद्धति का उपयोग imaged किया जा सकता है एक बार, यह नैदानिक ​​उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वास्तव में, ऊतक इमेजिंग अगले पहले से ही 51 प्रदर्शित किया गया है, के रूप में यह सही ट्यूमर के हाशिए निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां ऑपरेटिंग कमरे में स्थित है, एक उपकरण के साथ, एक अस्पताल स्थापित करने में किया जा सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस लेखक मंच के वित्त पोषण, और समर्थन के लिए जीनोम कनाडा और जीनोम ब्रिटिश कोलंबिया स्वीकार करना चाहते हैं. हम भी पांडुलिपि और संपादन सहायता गंभीर की समीक्षा के लिए डॉ. कैरोल ई. पार्कर धन्यवाद. सीएचएल भी समर्थन के लिए धन्यवाद ब्रिटिश कोलंबिया प्रोटिओमिक्स नेटवर्क.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat Liver Pel-Freez Biologicals 56023-2
Bovine Calf Lens Pel-Freez Biologicals 57114-2 Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT) Sigma-Aldrich 10608 MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA) Sigma-Aldrich 70990 MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB) Sigma-Aldrich 85707 MALDI Matrix
Reserpine Sigma-Aldrich 83580
Terfenadine Sigma-Aldrich T9652
Formic Acid Sigma-Aldrich 14265
Ammonium Formate Sigma-Aldrich 14266
Ammonium Hydroxide Sigma-Aldrich 320145
Trifluoroacetic Acid (TFA) Sigma-Aldrich 302031
Water Sigma-Aldrich 39253
Methanol Sigma-Aldrich 34860
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967
Ethyl Acetate Sigma-Aldrich 34972
Isopropanol Sigma-Aldrich 34965
Chloroform Sigma-Aldrich 366927
Acetone Sigma-Aldrich 34850
Ethanol Commercial Alcohols 95%
ES Tuning Mix Agilent Technologies G2431A
ITO Coated Glass Slides Hudson Surface Technology PSI1207000 Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen Bic WOSQP11
Airbrush Sprayer Iwata Eclipse HP-CS
ImagePrep Bruker 249500-LS
MALDI adapter Bruker 235380

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 81 आंख आणविक इमेजिंग रसायन विज्ञान तकनीक विश्लेषणात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मैट्रिक्स सहायता प्रदान की लेजर desorption / आयनीकरण (MALDI) अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री लिपिड ऊतक इमेजिंग गोजातीय लेंस dithranol मैट्रिक्स FTICR (फूरियर आयन रूपांतरण साइक्लोट्रॉन अनुनाद)
एक फूरियर पर मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption / आयनीकरण इमेजिंग के लिए एक मैट्रिक्स के रूप में Dithranol आयन साइक्लोट्रॉन गूंज मास स्पेक्ट्रोमीटर रूपांतरण
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Le, C. H., Han, J., Borchers, C. H. Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer. J. Vis. Exp. (81), e50733, doi:10.3791/50733 (2013).

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