Behavior

げっ歯類におけるオロ顔面ノシチブ応答の尺度としての食事期間

Published: January 10, 2014 doi: 10.3791/50745

¹Department of Biomedical Sciences, Texas A&M University Baylor College of Dentistry

Summary

食事の持続時間の延長は、顔面痛を有するヒトの保護行動と同様のげっ歯類における顔面のノシシブ行動を表す。食べることは、訓練や動物操作を必要とせず、皮質の参加を必要とし、他の実験的に誘発された行動と競合せず、このアッセイを代替反射またはオペラの測定と区別する行動である。

Abstract

食事時間の延長は、顔面痛みを伴うヒトの保護行動と類似性を有する顔面機械的過痛の増加を測定するために使用することができる。食事の持続時間を測定するために、無制限のラットは継続的に減衰し、コンピュータ化された給餌モジュールを数日間から数週間、摂食行動を記録する。これらの音減衰室はチャウペレットディスペンサーが装備されている。ディスペンサーは、トラフの底に配置された光ビームを備えたペレットトラフを有し、げっ歯類がフィーダートラフからペレットを除去すると、このビームはもはやブロックされず、コンピュータに別のペレットを落とすように合図する。コンピュータは、ペレットがトラフから採取された日時を記録し、このデータから実験者が食事パラメータを計算することができます。食事パラメータを計算する際に食事は前の作業に基づいて定義され、10分(つまり動物が10分間食べない場合は、動物の食事の終わりとなる)に設定した場合、最小の食事サイズも3ペレットに設定した。食事の期間、食事数、食物摂取量、食事の大きさおよび食事間隔はオペレータが望む任意の期間のソフトウェアによって計算することができる。食事期間を算出できる摂食パラメータのうち、雄ラットおよびマウスおよび雌ラットにおけるオロフェイシャル・ノシセプションの連続的な非侵襲的生物学的マーカーであることが示されている。食事の期間の測定は、定量的であり、訓練や動物の操作を必要とせず、皮質の参加を必要とし、他の実験的に誘発された行動と競合しない。これらの因子は、このアッセイを、顔面の異性の記録のための他のオペラまたは反射法と区別する。

Introduction

動物モデルは、顔面損傷や炎症に関連する痛みやノシセプションを研究するために使用されてきましたが^、適切な動物モデルの欠如は、メカニズムの不完全な理解をもたらします。現在のモデルは、急性および慢性のオロ顔面痛に関与する様々なメカニズムを理解するのに役立ちますが、これらの動物モデルには長所と短所があります。

多くのモデルは、短時間の行動性の忍化応答を測定します。顔のグルーミングは顔面神経の収縮に続く既知の行動応答^である3.他の研究は、イプシラショナル前頭またはヒスポとの顔面擦れ、ならびに、顎関節(TMJ)または唇^4-7にホルマリン注射を投与した後に頭部をひるむを測定した。頭部離脱遅延は、ラット⁸の剃毛ビブリッサエパッドに熱を加えた後に、修飾されたテールフリック鎮痛計を使用して、可分化応答(すなわち頭部離脱)を定量化するノシシブ挙動を測定するための別のモデルである。Digastricおよびマッサージ筋活性は、TMJ⁹にグルタミン酸注射後の痛みの相関としても記録されている。別の研究は、炎症を起こしたTMJを有する雄および女性ラットにおける夜行化応答を評価するための睡眠パラメータの変化を測定し、これらのパラメータには睡眠遅延、急速眼球運動(REM)、非レム睡眠の割合、およびレム睡眠¹⁰の割合が含まれていた。行動性の特性応答を測定するほとんどの動物モデルは、短い時間枠、すなわち^1日11-14日の分から時間を利用する。さらに、ほとんどの動物モデル試験は、ラットのような夜行性動物の光相および夜行性動物において起こり、これは、夜起性の結果^15〜18を混乱させ得るストレスを引き起こす可能性がある。上記アッセイは、様々なオロ顔面状態での起分の応答を測定するが、短い期間のため、したがって急性障害を研究するためにのみ使用することができる。代替アッセイは、中程度の持続期間の分性の尺度として表情を用いてきたが、この方法論は主観的な¹⁹である。

持続的または慢性のオロ顔面の結知を評価するために、一部の人は、皮膚の表面にフォン・フレイフィラメントの適用を使用して、神経収縮またはTMJ炎症を受けた動物の機械的感受性を評価する^3,20。Liverman ら 2009ラット^21,22のマッセター筋へのCFA注射に続く等級モノフィラメントを用いた離脱応答を測定した。2008年、山崎らは、TMJをCFAに注入し、その後14日間にわたってTMJ地域に適用される機械的または熱的または冷たい刺激に対する加性挙動を定量化した。残念ながら、これらのノシセ化行動アッセイは、動物の拘束を伴い、ストレスホルモン、学習、または測定結果を妨げる可能性のある代替行動を生み出す。

歯の中での分知を測定するモデルは顎の開口反射を利用するが、この方法は信頼できない²³ または不正確な²⁴である可能性がある。歯の分電を測定するために筋電図活性が用いられてきた^が、この方法では通常、動物が無意識である必要があるが、一つの研究では歯の交知は自由に動くラット²⁶で調べられた。2008年、カーンは敏感なひずみゲージ²⁷ を用いて歯科線切りと咀嚼機能の関係を研究したが、この咬傷持続時間モデルは正常な活動²⁸から動物を拘束する必要がある。咬傷力は人間の歯の痛みの信頼できる尺度ですが、ラットは咬傷力を測定するための訓練および/または拘束を必要とするため、ストレスの原因が導入され、疑わしい生理学的意義を持つ所見を生み出すことができます^29-31

拘束とストレスのいくつかの制限は、衝動的な行動を評価するためにオペラントデザインを使用することによって克服することができます。1つのオペランモデルは、不快な温度の回避を使用して、顔面のノシセプション^32-35を評価し、特徴付けます。この報酬競合モデルは、加熱または冷却された熱プローブ^34,36に対して自発的にその顔を配置するためにげっ歯類を誘導するために甘味ミルクの報酬に基づいています。しかし、テストは動物の訓練を必要としますが、アッセイの強みは、データが自動化された方法で収集される方法です。

さらに別の動物モデルは、顔面ノシセプション³⁷の指標として、ノシセプション誘発性かじり機能不全を使用した。しかし、げっ歯類はチューブに閉じ込められており、その唯一の脱出はダボをかじって出て行くだけです。このモデルの利点は、マウスの急性または慢性顎損傷後の顎機能を測定することです。しかし、げっ歯類は閉じ込められ、混乱する代替競合行動、 すなわちエスケープが追加され、ストレスが多く、したがって発知アッセイの結果に影響を与える可能性があります。

食事期間は、TMJ関節炎^38-41、歯髄暴露^42、及び筋肉損傷⁴³を有する動物におけるノシセプションを測定するために使用されてきた。動物が食事を始めた後、顔面のノシセプションを経験したげっ歯類はよりゆっくりと食べました。TMJの痛みを経験している患者はまた、彼らの食べ物を噛むために長い時間がかかり、TMJの痛みが減少するとサイクル長が短くなります^44-46.TMJ疼痛が存在する場合の食事期間の延長は「ガード行動」であると予想され、動作上、補助的行動⁴⁷と定義される。

食事期間は、雄マウスおよび雌ラットにおいて最大19日間の非侵襲的方法を用いたTMJノシセプションを測定し、雄マウスにおいて6日間(最長期間試験)し、ノシセプション^38〜41の生物学的マーカーとして記述することができる。食事の持続時間が起き上がった応答を測定することを支持して、薬物学的介入によって薬物の受け入れが減少し、動物の食事期間が正常^38,40,41に戻る。これはまた、カプサイシンを使用してノシシ化ニューロンが破壊されたときに確認されました。神経破壊後、動物の食事期間は、TMJ 40へのCFAの注入後に増加しなかった。

以下は、食事の継続時間データを取得し、統計的に分析する方法に関するプロトコルです。

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Protocol

このモデルでは、ラットまたはマウスに食物および水のアドリビタムを与えた。テキサスA&M大学ベイラー歯科施設動物ケア使用委員会は、すべての実験プロトコルを承認しました。以下の特定の設定は斜体で示され、ラットTMJ関節炎モデルのために特別に利用される。マウスもまたこのモデルで利用することができ、代替歯の痛みや筋顔面疼痛動物モデルも^42,43.

1. ソフトウェア設定

フィーダーユニットの動物モニタソフトウェアをコンピュータにロードします。
動物モニターソフトウェアは、アイコンをクリックして開かれ、ファイルメニューの選択の下に「構成」プルダウンオプションを選択します。
「動物モニタ構成」ウィンドウで、「ペレット配信入力」と題するチェックボックスをオフにします(図1A)。
注: このボックスは、通常、デフォルトで工場でチェックされます。このオプションの選択を解除します。研究者がこのオプションを選択解除すると、ペレットが分配されるときではなく、トラフからペレットを除去することによって結果が記録されます。
注: [ファイルの自動命名] ボックスにチェックを入れると、ソフトウェアは自動的にファイルに名前を付けます (図 1A)。このボックスは、通常、デフォルトで工場でチェックされます。
タイマーライトを06:00(午前6時)に点灯し、20:00(午後8時)に消灯するように設定します。
注: フィーダーユニットのハードウェアは、ボックス内のライトがソフトウェアによって制御されず、隔離された24時間のタイマーに配線されるように変更されました。したがって、構成ソフトウェアに示された「ハウスライト」は、これらの例では機能しなかった。
編集プルダウンメニューを選択し、実験を選択します。「Box 01 -」というタイトルのウィンドウが表示されます (図 1B)。
このウィンドウ内でデータを保存するファイル名を入力します。
注: ファイル名を入力しないと、データファイルは自動的にソフトウェアによって命名されます。実験の詳細はこのウィンドウに追加され、データファイルと一緒に保存することができます。ウィンドウ上の情報は保存し、後続の実験に使用することもできます。
「実験の長さ (日):」と題する入力ボックスに、実験の合計時間より大きい数値を入力します。
注: これは、実験が完了するまでソフトウェアがデータを保存することを保証します,間違いはこの値を短く設定しすぎ、動物がまだ給餌モジュールに残っていてもデータを記録するのを止めます。
「1 日の時間数」と題する入力ボックスに「24」と入力します。
注: 長さは実験者の仕様に変更できます。
「食事期間終了基準 (分):」と題するボックスに「10」と入力します。
注:ラットの食事は、以前の研究⁴⁸ に基づいて食事の終末10分を使用して定義された(すなわち、食事はペレットを服用しない10分の期間で前後に括弧で囲まれた)、最小食事サイズは、このソフトウェアパッケージの食事ごとに3ペレットに設定した。
「ペレットサイズ (mg)」と題するボックスに「45」と入力します。個人がこのウィンドウ内でマウス入力20を使用したい場合。
ラットの場合は、フィーダーディスペンサーホッパーに45mgのげっ歯類のチョウペレットを追加します。
注:マウスの場合は、チャウホッパーに20mgのげっ歯類のチョウペレットを追加します。
実験ウィンドウの「フェーズ」セクションで、「名前」フィールドに「曜日」と入力し、「時間の数」フィールドに「24」と入力します(図1B)。
注意: 「フェーズ」のセクションの下には、2 つの大きなオープンフィールドがあります。 最初の大きなオープンフィールドは、前の「フェーズ」フィールドと「名前」フィールドに入力されたテキストによって設定されます。
次の大きなオープンフィールドには、「Day Phase」という見出しが「名前」というフィールドに「ライト」という名前が付けられており、そのフィールドに「パーセント」という数字60を入力します。
注: この入力されたテキストは、下の大きなフィールドに入力されます。
次に、"名前" という名前のフィールドに「Dark」と入力し、数値 40 の「パーセント」と題するフィールドに入力します。注: これらのエントリでは、1 日の 60% は明るい位相に起因し、40% は暗位相に起因します。ソフトウェアが食事パターンを計算する際に、この情報が使用されます。14:10明暗サイクルで飼われているサイクリングの雌の動物のためのこれらの設定。
[すべてのボックスをこのように設定]ボタンを選択します。この情報を保存し、[OK] をクリックします。
「スタートボックス」画面が表示され、アクティブにするフィーダーを選択してOKを押します(図1C)。
次に、動物モニタのランタイムウィンドウが食事パターンデータとともに表示されます(図1D)。
注: このウィンドウから「ペレットの塗布の#」を監視して記録し、ラットの現在の状態を確認します。約300グラムの健康な雄のラットは、通常、1日300〜800 45mgペレットの間で食べます。
ファイルは毎日生成され、自動的に保存されます。CSV 拡張子。これらのファイルを開くと、食物摂取、食事数、食事時間、食事サイズ、食事間隔などの食事パターンデータを取得できます。これらの食事パターンの間隔は、一日または暗いおよび明るい段階などの一日の段階のために計算することができます。前述のように、設定は 14:10 の明暗サイクル用です。各ペレットがトラフから取り除かれた時の生データも生として記録される。CSV ファイル。
注: ソフトウェアの古いバージョンでは、最小の食事サイズは 3 ペレットは、を生成するための計算では使用されません。CSV ファイル。さらに、古いソフトウェアを使用して平均食事時間を取得するには、の平均食事時間列の値から 10 分を減算する必要があります。CSV ファイル。
ソフトウェアが動作しているとき、オペレータは手動でファイルプルダウンメニューオプションを選択し、毎日「生データを保存」を選択することができます。これにより、実験全体ではなく、24 時間の期間の生データが保存されます。この生データは、ユーザーの裁量で代替ソフトウェアによって処理することができます。
注:結果では、我々は3ペレットの最小食事サイズを含むように代替ソフトウェアを使用しました。

2. 食事時間アッセイ

光ビームコンピュータ作動ペレットフィーダーを備えた音減衰チャンバーに個々のラットを配置します。
注:これらの供給ユニットには、厚い吸収性紙のシートが配置されている段階的な水のボトルや廃棄物の鍋があります。フィーダーディスペンサーホッパー45mgのげっ歯類のチョウペレットは、ラットまたは20mgのげっ歯類のチョウペレットをマウスに加えることができる。チャウペレットはV字型給餌トラフに分配され、このトラフの底にはフォトビームがあります。トラフに分配されたペレットは、この光ビームを壊すことによって検出されます。ラットがフィーダートラフからこのペレットを取り除くと、光ビームが復元され、これはコンピュータに別のペレットを落とすように合図します。光ビームの復元はまた、日付と時刻を記録するためにコンピュータをトリガし、分配されたペレットの実行集計を維持します。このペレットの集計は、Med Assoc. Inc.ソフトウェアを使用して、一日の任意の部分の間に食物摂取量、食事数、食事時間、食事のサイズ、または食事間間隔を決定するために分析されます。再び生.CSVデータファイルは、外部ソフトウェア^39,40,49-51で分析することができます。
ペレットの総食数、消費水量、および実験中のラットの一般的な健康状態を識別する動物の重量を記録します。
水のボトルをすすいで、毎日新鮮な水で満たし、必要に応じてフィーダーホッパーにチャウを追加します。
毎日ゴミ鍋とケージの下の厚い吸収紙をダンプし、高圧空気を使用して毎日フィーダーの一部を移動からほこりを吹きます。
注意:個人的な保護具(例えば、ガウン、手袋、マスク、マスク)が必要です。
実験が完了した後、床、廃鍋、水筒を取り除き、これらの部品を洗浄します。また、手洗いまたは食器洗い機でケージ洗浄から供給エレクトロニクスを取り外します。

3. TMJ関節炎の誘導

実験の少なくとも4日前に動物をフィーダーに入れる。
注: このデータは、ベースラインフィード動作を取得するために前の日として報告されます。次いで、動物は治療のためにフィーダーから取り除かれます。一つの治療法は、関節炎TMJを誘導することであった。このモデルでは、ラットがイソフルラン(5%流量)で麻酔された後、08:00(すなわち光相の開始)に完全なフロイントアジュバント(CFA)を注射する。
各TMJの垂直空間に250mgのCFAを両側に注入する。
注: 例(図2)では、50LのCFAの250mgを各TMJに注入したが、15μlの小さな体積で10mgの低用量は、より短い期間の時間⁵²にわたって有効である。
コントロールラットTMJを0.9%生理液の50 Lで注入する。注:すべての動物は麻酔の誘導後5分以内に移動した。より少ない量のCFAがより少ない量で与えられる場合、対照ラットはこの同じ量の生理的な生理を受け取るだろう。

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Representative Results

食事期間は、TMJ関節炎(図2)および虫歯を有する動物に適用された顔面痛および食事期間測定の行動相関である(図3)。1つの実験では、ラットはCFAの高い250mg用量を投与した後にTMJ関節炎を有し、この治療は19日間の食事期間の有意な増加を誘発した(図2)。各TMJ関節に注入された低用量のCFA(10mg)は、この食事期間アッセイを用いたCFA投与に対する用量応答を示す^{わずか2〜3日間52}の食事期間の増加を生じさせる。食事の持続時間は、顎顔面領域における可射性応答を測定したが、膝の内側の関節炎からの応答を検出しなかった(図2)。

第2の実験では、食事期間は、パルプ露光を有するラットの可食応答も検出した(図3)。パルプ暴露は虫歯をもたらし、ヒト⁴²における歯痛のモデルであった。食物摂取量、食事数、食事サイズなどの他の摂食パターンは、これらの他の食事パターンが食事期間³⁹ほど受容性の高い反応に対する敏感な尺度ではないことを示唆する食事期間ほど大きくも、また期間も変わらない。食事の持続時間が大幅に増加するにつれて、通常、食事数と食事の大きさに有意でない傾向があり、治療された動物の体重がシャムまたはコントロール動物の体重に等しくなるように、食物摂取量が正常に近い結果となる。

図1および以前の平均および標準偏差データ^38-42のデータから、80%のパワーを有する少なくとも2分の治療群間の有意差を計算する(ANOVAを使用)、約9匹の動物/治療群を必要とするであろう。

図 1.動物モニターソフトウェアのスクリーンショット。 パネル 1A は、動物モニタ構成ウィンドウです。パネル 1B は、編集プルダウンメニューを選択し、このメニューから実験を選択したときに表示されるウィンドウです。パネル 1C は、特定のフィーダーユニットの選択的活性化を可能にするウィンドウである。パネル 1D は、次に表示されるウィンドウで、「動物モニター」と題されています。このウィンドウには、アクティブフィーダユニットの食事パラメータのリアルタイム計算が表示されます。ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。

図 2.関節関節顎関節(TMJ)を有する雄ラットでは、食事期間が19日間有意に延長された。 対照群のスプレイグ・ドーレーラットに対して、各TMJ(SALINE/TMJ、n=13)に50L生理食物の注射を与えた。完全なフロイントアジュバント(CFA)の実験群250gにおいて、TMJ(CFA/TMJ、n=14)または膝(膝/CFA、n=7)に注入した。食事期間データは、TMJまたは膝注射後の1日(0)および1〜21日(1、2、3 など)について計算した。各関節は、注射部位を検証する行動検査の後に解剖によって調べた。値は、独立変数処理(生理食道およびCFA)を有する反復測定を伴うSEM±手段として与えられ、時間および従属可変食事期間がこれらの研究で使用された。CFA治療に対して顕著な主効果が認められた, F(2, 31)=4.7, p<0.05.データはさらにダンカンのポストホックテストを使用して分析されました。a = p<0.05 の場合、SALINE/TMJ グループと CFA/TMJ グループの比較が行われました。b = p<0.05 の場合、CFA/TMJ グループと CFA/KNEE グループの比較が行われました。

図 3.雄のスプラケドウリーラットの6つの上顎臼歯を暴露し、手術後6日間の食事期間を測定した。 対照ラットは、パルプ暴露手術を受けなかったが、麻酔を投与した。治療の独立変数(制御、暴露)と時間と依存可変食事期間を使用して反復測定を伴う双方向のANOVAを使用して、食事期間データを分析した。パルプ露光に対して顕著な主効果が認められた, F(1, 12)=66, P<0.001.データはさらにダンカンのポストホックテストを使用して分析されました。コントロールと、臼歯を露出させたラットとを比較する場合 * = p<0.05, ** = p<0.01。SEM±意味し、5匹のラットが各治療群に含まれた。

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Discussion

TMJ患者は、咀嚼時間の増加による疼痛の増加を報告し、その様に、咀嚼サイクルは、個人が^45,53-56を噛んでいる時間が長くなるほど長くなる。我々の行動アッセイは、食事の持続時間³⁹を測定する際に、ラットとマウスで同様の検査を可能にする。最近の未発表の研究では、フォン・フレイ・フィラメント検査は食事期間測定よりも感度が高く、より長い期間の有意な変化を示すが、フォン・フレイ・フィラメント検査は反射応答成分を有することができるのに対し、食事期間測定は中枢神経系の領域による処理を必要とする。したがって、フォン・フレイのフィラメント試験では感度が高くなるかもしれませんが、応答の一部は反射を反映する可能性があります。しかし、中心効果を有する薬物による治療は、アッセイを示唆するフィラメント試験結果を改変し、中央疼痛処理⁵⁷のいくつかの側面を反映する。

食事期間アッセイでは、分配されたペレットの総数を毎日監視する必要があります。オスラットは通常、45mgペレットの400-800を摂取し、雌ラットは300〜600ペレットを摂取する。毎日のペレット値がこれらの典型的な値よりも小さい場合、ペレットディスペンサーがトラフからペレットを取り除く際に5ペレットを落とす場合、実験者はフィーダーユニットをチェックする必要があります。ペレットホッパー付近のペレットセンサー(トラフにはない)は、ほこりが付き、クリーニングが必要です。ディスペンサーが5ペレットを落としているにもかかわらず、コンピュータは1つのペレットだけが落とされたことを示します(低カウントを与えます)。したがって、5ペレットまたは1つのペレットがトラフにあるかどうか、コンピュータは1つのイベントのみを記録する。センサーを洗浄した後、単一のペレットは、フィーダートラフからペレットの除去時に分配されるべきです。あるいは、センサを交換することもできます。日次ペレット値がこれらの典型的な値よりも高い場合、給餌トラフ上のセンサはほこりが付く可能性があり、洗浄が必要です。センサーをクリーニングし、次の日にペレットの数が典型的な範囲内に収まっているかどうかを確認します。

食事時間は、種の違いによって影響を受け得る行動アッセイである。TMJ関節炎³⁹ を有するマウスを用いた以前の研究では、ペレットを買いだめするマウスの株があった。マウスはフィーダートラフからペレットを取り出し、ペレットを食べるのではなく、ケージの隅にペレットを落とし、廃棄物の鍋に落とします。買いだめ行動のために、食事パターン測定はマウスが食べている速度を反映せず、TMJ関節炎を有するマウスの機械的過痛のレベルを反映しない。この買いだめ動作をトラブルシューティングする1つの方法は、前処理段階でマウスをスクリーニングすることでした。以前の研究から、マウスの約40〜70%が採取した全ペレットの5%以上を買いだめしていた。その結果、食事パターンデータが大幅に変化しました。買いだめの問題を解消するために、マウスはペレットの5%未満を買いだめするように事前に選択した。実験を事前に選択した動物で実施し、実験全体を通して買いだめ行動をモニタリングした。実験のどの時点でも食物摂取量全体の5%を超えて買いだめした動物は、結果から排除された。この事前選択プロセスの2つの問題は1つであり、実験を完了するのに十分なマウスを事前スクリーニングするのに時間がかかり、第2に、このプロセスは多くの動物をスクリーニングする必要があり、その大部分は過剰なコストをもたらす実験に使用されない。

結論として食事期間は、実験者に主観的ではない定量的な尺度である。オペラの方法のように食べることは皮質の参加を必要とする行動ですが、食べることは、傷、フォンフレイの毛、または熱などの多くの反射測定とは異なる。食事の持続時間を測定する場合、動物はテストの前に訓練を受ける必要はありませんし、ストレスや代替行動を複合することができる固定化または処理する必要はありません。食事の持続時間の測定は連続的なので、げっ歯類が通常眠るときの光相でのテストとは対照的に、テストは暗い段階と光の段階で起こります。食事の期間の測定は、テストが特定の時間間隔で短時間実行される他の方法とは対照的に、数日間行うことができます。これらの利点は、食事の持続時間測定は、ヘッド領域におけるノシセプションのメカニズムを研究するための強力なツールになります。

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Disclosures

開示するものは何もありません。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Monitor software	Med Assoc. Inc	SOF-710	East Fairfield, VT
Dustless Precision Pellets, Rodent, Grain-Based	Bio-Serv	F0165	45 mg pellets, 50,000/box
Dustless Precision Pellets, Rodent, Grain-Based	Bio-Serv	FO163	20 mg pellets
Complete Freund's Adjuvant	Chondrex, Inc.	7001	No loger provides the 5 mg/ml concentration. Can use CFA from other sources as long as the investigator consistently uses this source