Protokoller for å gjennomføre en Published: September 16, 2013 doi: 10.3791/50762

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Zachary Z. Sun*¹, Clarmyra A. Hayes*², Jonghyeon Shin³, Filippo Caschera⁴, Richard M. Murray², Vincent Noireaux⁴

¹Department of Biology, California Institute of Technology, ²Department of Bioengineering, California Institute of Technology, ³Synthetic Biology Center, Department of Bioengineering, Massachusetts Institute of Technology, ⁴School of Physics and Astronomy, University of Minnesota

* These authors contributed equally

Summary

Denne fem-dagers protokollen skisserer alle trinn, utstyr, og supplerende programvare som er nødvendig for å skape og drive en effektiv endogen Escherichia coli basert TX-TL celle-fri ytring system fra bunnen av. Med reagenser, tar protokollen 8 timer eller mindre å sette opp en reaksjon, samle inn og behandle data.

Abstract

Ideelle cellefrie ekspresjonssystemer kan teoretisk emulere en in vivo cellulær miljø på en kontrollert in vitro plattform. ^Ett Dette er nyttig for ekspresjon av proteiner og genetiske kretser på en kontrollert måte, så vel som for å tilveiebringe et miljø for proto syntetisk biologi. ^2,3 For å oppnå det siste målet, celle-frie uttrykk systemer som bevarer endogen Escherichia coli transkripsjon-oversettelse mekanismer er i stand til mer nøyaktig gjenspeiler i vivo cellulære dynamikk enn de som er basert på T7 RNA polymerase transkripsjon. Vi beskriver utarbeidelse og gjennomføring av en effektiv endogen E. coli basert transkripsjon-transla-(TX-TL) cellefritt ekspresjonssystem som kan produsere ekvivalente mengder av protein som T7-baserte systemer med en 98% kostnadsreduksjon til lignende kommersielle systemer. ^4,5 Fremstillingen av buffere og rå celleekstrakt er beskrevet, så vel som utførelse av entre rør TX-TL reaksjon. Hele protokollen tar fem dager for å forberede og gir tilstrekkelig materiale for opp til 3000 enkle reaksjoner i en forberedelse. Når forberedt, tar hver reaksjon etter 8 timers fra oppsett til datainnsamling og analyse. Mekanismer for regulering og transkripsjon eksogene til E. coli, slik som lac / Tet repressorer og T7 RNA-polymerase, kan kompletteres. ^seks Endogene egenskaper, slik som mRNA og DNA-nedbrytningshastigheter, kan også justeres. ^syv TX-TL cellefritt ekspresjonssystem er vist for stor skala kretsstevne, utforske biologiske fenomener, og uttrykket av proteiner under begge T7-og endogene arrangører. ^6,8 Medfølgende matematiske modeller er tilgjengelig. ^9,10 Den resulterende system har unike applikasjoner i syntetisk biologi som en prototyping miljø, eller "TX- TL biomolekylære brødfjel. "

Introduction

Cell-ytringsfrihet teknologi startet i 1950 som rent translasjonsforskning, marsj år senere til å omfatte kombinert transkripsjon-oversettelse mekanismer ved hjelp T7 bakteriofag DNA. ^11,12 Siden da har mange anstrengelser er gjort for å optimalisere etableringen av råolje celle ekstrakt (eller E . coli S30 ekstrakt). ^13,14 Disse optimaliseringer inkluderer forlenge cellefritt proteinsyntesen gjennom ATP regenerering eller belastningsskader modifikasjoner, og redusere protokoll tid og kostnad. ^15-17 Alternative cellefrie ekspresjonssystemer eksisterer som bruker rekonstituert komponenter i stedet for råolje celleekstrakt for ekspresjon. ^fem Både rå celleekstrakt, og oppløsningsfremgangsmåter er blitt utviklet for kommersiell bruk.

Med bruk av syntetisk biologi, det er et økt behov for et godt karakterisert plattform for å teste og uttrykke konstruert biologiske moduler og kretser. ^18,19 Denne plattformen må væreallsidig, godt karakterisert, enkle å manipulere, og fokusert på bruker innkjøpte deler. Til tross utvikles et halvt århundre tidligere, cellefrie systemer basert på E. coli egen dele disse krav, da de er en forenklet in vitro fremstilling av cellulære prosesser uten at kompleksiteten i vekst og metabolisme. I tillegg har alle de grunnleggende kunnskap fra in vivo arbeide på E. coli gjelder lett til E. coli-celle-frie systemer.

Selv om cellefrie ekspresjonssystemer kan ha programmer i syntetisk biologi, hittil målet for de fleste cellefritt uttrykk systemer har vært maksimering av protein og metabolitt yield. Dette oppnås ved hjelp av T7-bakteriofag transkripsjon av sekvenser drevet av T7 promotorer. ^20. Selv om uttrykket er effektiv og robust, er disse systemer tjener et høyt spesialiserte formål. Cellereguleringsmetoder er begrenset, må mål-DNA-maler blireengineered å inkludere T7 arrangører, og enkelte sekvenser som ribosomal komplekser kan ikke bli transkribert og monteres. ^21,22 Eksisterende cellefrie ekspresjonssystemer ikke klarer å opprettholde høy avkastning og samtidig bevare endogene reguleringsmekanismer, en nødvendig fleksibilitet for syntetisk biologi.

Vi har utviklet en endogen E. coli cellefritt ekspresjonssystem som bevarer effektiviteten av protein ekspresjon demonstrert ved tidligere systemer, men tilføyer ytterligere fleksibilitet ved å tillate ekspresjon og regulering basert på både endogene og eksogene (T7 eller andre mekanismer). Protokollen er beskrevet her er opprinnelig basert på Kigawa et al. (2004) og Liu et al. (2005), men har betydelige modifikasjoner. Det benytter Mg-og K-glutamat enn Mg-og K-acetat for økt effektivitet, fjerner 2-mercaptoethanol, og lyserer celler ved hjelp av et kule-visp. ^17,23,24 Bead-juling velges fremfor homogeniseringtrykk-baserte metoder, eller sonikering på grunn av sin lavere pris og sammenlignbare utbytter i konkurrerende systemer. ^23. 3-phosphoglyceric syre (3-PGA) benyttes som energikilde som det ble funnet å gi overlegne protein utbytter sammenlignet med kreatinfosfat og fosfoenolpyruvat. ^4,25 Vårt system kan produsere opp til 0,75 mg / ml reporter protein ved hjelp av enten en sigma70-baserte arrangøren med lambda-fage operatører eller en T7-drevet promoter, lik avkastningen fra andre kommersielle systemer. ^4,6 Fem dager er nødvendig for å produsere alle de nødvendige reagenser (figur 1). Videre gir det en 98% kostnadsreduksjon i forhold til sammenlignbare kommersielle cellefrie systemer - materielle kostnader er $ 0,11 per 10 mL reaksjon, som stiger til $ 0,26 med arbeid inkludert (figur 2).

Protocol

En. Crude Cell Extract Forberedelse

Forbereder råolje celle ekstrakt over tre dager krever to personer til å utføre effektivt. Protokollen funksjonelt består av tre deler: kultur vekst (trinn 1,1 til trinn 1.11), cellelyse (trinn 1.12 til trinn 1,37), og pakk avklaring (trinn 1.38 til trinn 1.52). Det er presentert delt inn i dager for bekvemmelighet. Ideelt ekstrakt kan produsere 0,75 mg / ml deGFP fra plasmid pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene # 40019), og har en grov celleekstrakt konsentrasjon mellom 27-30 mg / ml protein. ^4. Imidlertid , trekke egenskaper varierer fra parti til parti. Den følgende oppskrift leverer nok til ca 3000 enkle reaksjoner (6 ml urene celle-ekstrakt). Hvis skalere ned, er det anbefalt å bruke ikke mindre enn 1/6 av verdier gitt her. På grunn av tidspress, oppskalerer ikke anbefales.

Dag 1

1. Forbered bakteriekultur media, kulturture plate, og medie kosttilskudd som beskrevet i Tabell 1. Se Supplemental Materiale en for oppskrifter.
2. . Serie BL21-Rosetta2 belastningen fra -80 ° C til en 2 x YT + P + Cm agar plate og inkuberes i minst 15 timer ved 37 ° C eller inntil kolonier er lett synlig Merk: kloramfenikol (Cm) blir brukt til å selektere for et plasmid koding sjeldne tRNAs i BL21-Rosetta2 belastning.

Dag 2

3. Forbered buffere og kosttilskudd, som beskrevet i tabell 2. Se Supplemental Materiale en for oppskrifter.
4. Forbered og sterilisere materialer som kreves for dag tre, inkludert: 6 x 4 L kolber med aluminiumsfolie dekselet (autoklaveres), 4 x 1 L sterile sentrifugeflasker, trakt (autoklaveres), 100 g av 0,1 mm glassperler (autoklaveres), 2 stir-barer (autoklaveres), en L og 500 ml målesylinder (autoklaveres), 2 x 1 L kanner (autoklaveres), 3 ml sprøyte med 18 G kanyler (sterilt), 2-3 flhavre bøyer, 2-3 10k MWCO dialyse kassetter (sterilt), kyvetter.
5. Forbered mini-kultur en. Tilsett 4 ml 2 x YT + P-media og 4 pl av Cm til et 12 ml sterilt kulturrøret og pre-varm til 37 ° C i 30 min.
6. Vaksinere mini-kultur en med en koloni fra 2 x YT + P + Cm agar plate. Inkuber ved 220 rpm, 37 ° C i 8 timer.
7. 7 timer og 30 min senere, utarbeide mini-kulturen to. Tilsett 50 ml av 2 x YT + P medier og 50 pl av Cm i en steril 250 ml Erlenmeyerkolbe, og pre-varm til 37 ° C i 30 min.
8. Inokuler mini-kultur 2 med 100 mL av mini-kultur 1 og inkuberes ved 220 rpm, 37 ° C i 8 timer.

Dag 3

9. Vei fire tomme sterile 50 ml Falcon-rør og platemasse i tabell 3. Chill Falconrør på is, og disse vil senere bli brukt i trinn 1.18.
10. 7 timer og 30 min etter trinn 1.8, utarbeide sluttbakteriekulturmedier. Ved hjelp av en steril en L uteksaminert sylinder, transfer 660 ml 2 x YT + P medier into hver av seks 4. L Erlenmeyer-kolber og pre-varm til 37 ° C i 30 min. Merk: 4 L eller større Erlenmeyerkolber er anbefalt for riktig luftning.
11. Til 6,6 ml av mini-kultur 2 inn i hver 4 l Erlenmeyerkolbe. Inkuber ved 220 rpm, 37 ° C inntil kulturen har nådd en OD på 1,5-2,0 ved 600 nm (svarende til middels logaritmisk vekstfase). Sjekk OD jevne med en 1:10 kultur fortynning for nøyaktighet Dette trinnet bør ikke ta mer enn tre timer - 3 timer 45 min;. Rask vekst og samling under mid-log fasen er avgjørende for ekstrakt kvalitet.
12. Umiddelbart etter vekst, overfører alle kulturer jevnt fordelt i fire 1 L sentrifugeflasker og sentrifuger ved 5000 xg i 12 min ved 4 ° C for å pelletere bakterieceller.
13. Selv sentrifugering, komp S30A buffer preparatet ved å tilsette 4 ml av 1 M DTT i 2 l av tidligere fremstilt S30A. Bland og opprettholde buffer på is.
14. Når sentrifugering er ferdig, helt fjern supernatanten fra trinn 1.12 av dekanting og blotting sentrifuge flasker på en steril papirhåndkle.
15. Legg 200 ml S30A buffer ved 4 ° C til hver av de fire sentrifugeflasker, og rist flaskene kraftig til pellet er fullstendig solubilisert med ingen gjenværende klumper. Sentrifuger fire flasker ved 5000 g i 12 min ved 4 ° C.
16. Helt fjern supernatanten fra forrige trinn ved dekantering og blotting sentrifuge flasker på en steril papirhåndkle.
17. Gjenta trinn 1,15 og 1,16.
18. Legg 40 ml S30A buffer ved 4 ° C for hvert sentrifugeflaske. Overfør hver pellet og S30A kombinasjon i et avkjølt Falcon rør fra 1,9). Merk: Dette trinnet er å overføre pellets inn i en mindre container.
19. Sentrifuger Falconrør ved 2000 g i 8 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved dekantering.
20. Re-sentrifuge Falcon-rør ved 2000 g i 2 min ved 4 ° C. Helt fjerne restsupernatant med pipette. Hold på is.
21. Vei fvåre Falconrør med pellet og ta opp massen i tabell 3. Beregn pellet masse, S30A buffervolum er nødvendig, og massen av perler for basert på de spesifikke formler i tabell 3.
22. Riktig lasting og perle juling av pellets er avgjørende for å lage kvalitet ekstrakt, og er den mest utfordrende trinnet. Det anbefales å gjennomgå video før du prøver. Unnlatelse av å unngå luftbobler og fordele jevnt perler vil resultere i ineffektiv ekstrakt.
23. Til mengden av S30A buffer beregnet i tabell 3 til hver Falcon rør, vortex inntil homogen, og gå tilbake til is.
24. Samtidig som de andre Falconrør på is, tilsett perler intermitterende til en enkelt Falcon rør i tre alikvoter hver, ved anvendelse av 1/3 av den totale perler. Etter tilsetning av hver porsjon av perlene, vortex i 30 sek. Plasser Falcon rør på is mellom virvel trinn og etter endelig vortex. Etter siste delmengde er lagt, sikreperler blir jevnt fordelt. En tykk pasta skal formes.
25. Forbered en 5 ml (volum) pipettespissen ved å kutte av enden ved hjelp av en steril barberblad for å lage en 3-4 mm åpning. Dial pipette til 2 ml Merk: Ulike pipettes sett og tips gir ulike mengder sug som kanskje ikke er tilstrekkelig til å trekke og slippe tykk perle-celle-løsning, en 1 ml pipette med slutten fjernet kan brukes i stedet..
26. Plasser 20 perle-juling rør på is.
27. Kontroller høy viskositet av celle-perle løsning ved hjelp av modifisert pipette. Det bør være tyktflytende til poenget med knapt spennende pipettespissen under utkastelse. Hvis for tyktflytende, re-justere pipettespissen i henhold til punkt 1.25. Hvis ikke viskøs nok, kan perler tilsettes i inkrementer på (pellet masse * 0,05), til en maksimal masse (pellet masse * 5.1). Etter hver tilsetning av perler, vortex i 30 sek, og gå tilbake til is. Se figur 3a for en demonstrasjon av viskositet.
28. Fjern perle-celle løsning fra Falcon rør ved hjelp av modifisert pipette, og overfør til en steril perle-juling tube, fylle det tre fjerdedeler fulle med perle-celle løsning. Spin ekstremt kort (1s) på et møte mini-sentrifuger for å fjerne luftbobler uten å omfordele perler. Se figur 3b-d for stillbilder av perle-juling tube lasting.
29. Finish legge bead-celle-løsning for å danne en konkav menisk.
30. Legg en liten dråpe perle-celle løsning på innsiden av en perle-juling rør cap, er forsiktig med å ikke hindre utenfor kanten på lokket, ellers vil ikke perlen-juling tube nær sufficientl y. Trykk lokket på et flatt underlag, og kontroller at det ikke er luftbobler i bunnen av hetten.
31. Cap perle-juling røret med perle-juling cap fra forrige trinn. Hånd til assistent for perle juling. Hvis det gjøres riktig, bør lokket være tett tillukket, ingen luftbobler should være synlig, og litt (hvis noen) perle-celle-løsning bør renne over. Gjør om lasteprosessen hvis luftbobler er synlige eller lokket ikke helt tett.
32. Vortex Falcon rør fra trinnet 1.24 med de resterende perle-celle-løsning for å sikre jevn fordeling av kulene. Gjenta trinn 01.28 til 01.31 fram til Falcon tube er tom, deretter gjenta trinn 01.24 til 01.31 for hver ekstra Falcon rør.
33. Conduct trinn 1,33 til 1,38 samtidig. Har assistent take fylt perle-juling rør fra 1,31 og legg på is. Når to fylt perle-juling rør har blitt samlet inn og har ligget på is i minst ett minutt, begynner perle juling.
34. Beat ett rør i 30 sekunder ved 46 rpm. Plasser opp ned på isen i 30 sekunder mens du pisker den andre røret.
35. Gjenta foregående trinn, slik at hver fylt perle-slår røret er blitt banket for 1 min totalt.
36. Gjenta trinn 1,33 til 1,35 til 8 fylt perle-juling rør (eller det høyeste beløpet sentrifugen kan holde) have blitt behandlet. Deretter konstruere filterapparat fra 15 ml Falcon (Figur 3e). Legg til en ny perle-juling cap, flat-del med forsiden opp, til bunnen av en 15 ml Falcon. Deretter fjerner hetten fra bearbeidet perle-juling røret og trykk mikro-kromatografikolonne fast på slutten av bearbeidet perle-juling rør til det er helt forseglet. Feste av eluering enden av mikro-kromatografikolonne, og plassere mikro kromatografi-kolonnen, eluering ende ned i det tomme bead-perler røret. Plasser dette komplekset i 15 ml Falcon. Gjenta for alle åtte fylt perle-juling rør, hold på is når du er ferdig.
37. Sentrifuger åtte filterapparat, Falcon rør uncapped, ved 6000 g i 5 min ved 4 ° C for å separere ekstrakt og pellet fra perlene.
38. Kontroller hver perle-juling tube har produsert levedyktig ekstrakt. Riktig slå ekstrakt vil ikke bli grumset, og pelleten vil ha to distinkte lag. Kast alle grumsete rør, og overføre supernatanten fra ikke-grumsete rør into individuelle 1,75 ml mikro-sentrifugerør, tar så lite pellets som mulig. Hold på is til alle perle-juling rør har blitt behandlet. Se figur 3f sammenligne en riktig g. feilaktig behandlet perle-juling tube.
39. Sentrifuger mikro-sentrifugerør fra forrige trinn ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C.
40. Transfer pellet frie supernatant til tomme perle-juling rør ved hjelp av en pipette, konsolidere 500 mL inn en ny perle-juling tube.
41. Inkuber foregående trinn, med perle-slår hetter er fjernet, ved 220 opm, 37 ° C i 80 min. Dette trinnet digests resterende nukleinsyrer ved hjelp av endogene eksonukleaser frigjøres under vulsten-perler prosessen, og kan gjøres ved å stå i perle-slår røret opp i en vevskultur rør.
42. Forbered dialyse materialer. Fullstendig S30B buffer preparatet ved å tilsette 2 ml av 1 M DTT til 2 l av tidligere fremstilt S30B. Bland og tilsett 900 ml i hver av to sterile en L kanner. Legg sterile magnetrører i hvert beger, hold ved 4 ° C.
43. Etter trinn 1.41, bør ekstrakt se grumset. Samle ekstrakt i 1,5 ml alikvoter i 1,75 ml mikro-sentrifugerør og sentrifuger ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C.
44. Ved hjelp av en pipette, konsolidere pellet frie supernatant i 15 ml Falcon rør på is, og bland godt ved tildekking røret og invertere. Spar 10 mL av supernatant på is for steg 1,47.
45. Bestem totale mengden ekstrakt produsert, og gi fuktighet til nødvendig antall 10k MWCO dialyse kassetter ved oppslukt i S30B i 2 min, forutsatt 2,5 ml av ekstrakt per kassett.
46. Last inn kassetter med 2,5 ml ekstrakt. Hvert begerglass kan ta opptil to kassetter, dialyser, under omrøring, ved 4 ° C i 3 timer Merk: partiell lasting av kassetter er akseptabelt.. Dialyse øker protein produksjon yield.
47. I det foregående trinnet, karakter ekstrakt proteinkonsentrasjon med en Bradford assay, ved hjelp av ekstrakt lagret i trinn 1.44. Se Supplemental Materiale 2 for detaljer.
48. Etter dialyse er fullført, alikvoter ekstrakt med 1,5 ml i 1,75 ml mikro-sentrifugerør. Sentrifuger ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C. En pellet vil danne i bunnen av røret.
49. Samle klare supernatant fra foregående trinn ved å pipettere inn i en 15 ml Falcon rør på is. Homogenisere ved å snu 5-10x.
50. Basert på konsentrasjonen bestemt ved Bradford i trinn 1.47, bestemme mengden av ekstrakt i alikvoten i individuelle 1,75 ml rør. Hvert enkelt rør bør ha et volum med 810-900 mg av totalt protein. Ekstrakt bør ha en total protein-konsentrasjon som er større enn 27 mg / ml. Dette trinnet krever assistanse til å utføre hensiktsmessig Bemerk:. Delmengde ekstrakt under 30 mg / ml i 30 pl aliquoter og skala hvis konsentrasjonen er høyere, for eksempel delmengde ekstrakt ved 28 mg / ml med 30 pl, og alikvoter ekstrakt ved 32mg / ml ved 28,1 pl.
51. Delmengde ekstrakt følgende trinn 1,50, ta vare å unngå bobler. Flash-fryse-ekstrakt i flytende nitrogen. Merk: Aliquoter med bobler kan fjernes ved sentrifugering ved 10,000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C.
52. Fjern rør fra flytende nitrogen ved hjelp av en sil og umiddelbart oppbevar ved -80 ° C. Sikkerhet: Bruk vernebriller, caps av ekstrakt rør kan komme ut på grunn av temperaturforskjellen mellom flytende nitrogen og romtemperatur.

2. Amino Acid Løsnings Fremstilling

Amino Acid Solution bør være forberedt på bulk. Følgende oppskrift benytter en hel pakke med RTS Amino Acid Sampler, leverer nok for ca 11 000 enkelt reaksjoner. Hvis skalere ned, er det anbefalt å bruke ikke mindre enn en halv kit. Hver aminosyre i lager tilføres på 1,5 ml, 168 mM, bortsett fra leucin til 140 mM. Den endelige sammensetning av aminosyreløsning i:leucin, 5 mM, alle andre aminosyrer, 6 mM. Dette er 4x arbeidskonsentrasjon.

1. Fjern alle 20 aminosyrer fra -20 ° C og tining ved værelsestemperatur. Tint, vortex inntil aminosyrer oppløses, inkubering ved 37 ° C hvis det er nødvendig. Etter aminosyrer blir løst opp, settes alle aminosyrer på is bortsett fra Asn, Phe, og Cys, som blir holdt ved romtemperatur. Cys kanskje ikke fullt oppløses.
2. På is, tilsett 12 ml sterilt vann til et sterilt 50 ml Falcon-røret.
3. Tilsett 1,5 ml av hver aminosyre i den følgende rekkefølge, å ta vare på vortex Falcon rør etter hver tilsetning, og for å holde løsningen på is: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Møtte, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, Leu, Cys. Cys kan tilsettes som en suspensjon. Etter tilsetning, inntil oppløsningen er vortex relativt klar, inkubering ved 37 ° C hvis det er nødvendig. Cys kanskje ikke fullt oppløses.
4. Delmengde Amino Acid Solution inn 50 rør på26 mL hver på isen. Delmengde resten på 500 mL per rør på is. De 26 pl aliquoter blir benyttet for kalibrering av ekstraktet, mens de 500 pl aliquoter blir brukt for fremstilling av buffer. Mens aliquoting, vortex hovedlager ofte for å unngå skjev fordeling av suspensjonen.
5. Flash fryse alikvoter i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C. Sikkerhet: Bruk vernebriller, caps av ekstrakt rør kan komme ut på grunn av temperaturforskjellen mellom flytende nitrogen og romtemperatur.
6. Valgfritt: Gjennomføre en aktivitet analyse av nylig gjort Amino Acid Løsning mot tidligere gjort Amino Acid Solutions.

Tre. Energy Solution Forberedelse

Energy Solution brukes både for å kalibrere råolje celle ekstrakt og for å lage buffer, og må være forberedt på bulk. Følgende oppskrift leverer nok for ca 10 000 enkelt reaksjoner. Hvis skalere ned, er det å anbefalnded å bruke ikke mindre enn 1/24 av verdier gitt her. Som Energy Solution er en betydelig økonomisk kostnad, kan første gang brukere ønsker å forberede seg på 1/24 skala. Den endelige sammensetningen av Energy Solution er: HEPES pH 8 700 mm, ATP 21 mm, GTP 21 mm, CTP 12,6 mM, UTP 12,6 mM, tRNA 2,8 mg / ml, CoA 3,64 mM, NAD 4,62 mM, cAMP 10,5 mm, folinsyre 0,95 mM, spermidin 14 mm, 3-PGA 420 mM. Dette er 14x arbeidskonsentrasjon. Om ønsket, kan hvert enkelt element i tabell 4 lagres ved -80 ° C for senere bruk.

1. Fjern alle kjemikalier i tabell 4 fra -80 ° C, -20 ° C eller 4 ° C til romtemperatur i 30 min.
2. Forbered stamløsninger, som beskrevet i tabell 4. Se Supplemental Materiale en for oppskrifter. Legg alle løsninger på is etter tilberedning.
3. I en 15 ml Falcon rør, legge i følgende rekkefølge, ta vare å vortex Falcon rør etter hvert tillegg, og å holde løsninger on ice: 3,6 ml 2 M HEPES, 144 mL vann, 1,39 ml nucleotide mix, 576 mL 50 mg / ml tRNA, 576 mL 65 mm CoA, 276 mL 175 mM NAD, 170 mL 650 mM cAMP, 288 mL 33,9 mM Folinsyre , 144 mL 1 M spermidin, og 3,09 ml 1,4 M 3-PGA.
4. Delmengde Energy Solution inn 50 rør på 7 mL hver på isen. Alikvot resten på 150 mL per rør på is. De 7 mL alikvoter vil bli brukt for kalibrering av ekstraktet, mens de 150 pl aliquoter blir brukt for fremstilling av buffer. Mens aliquoting, vortex hovedlager ofte.
5. Flash fryse alikvoter i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 ° C. Sikkerhet: Bruk vernebriller, caps av ekstrakt rør kan komme ut på grunn av temperaturforskjellen mellom flytende nitrogen og romtemperatur.
6. Valgfritt: Gjennomføre en aktivitet analyse av nylig gjort Energy Solution mot tidligere gjort Energy Solutions.

4. Buffer Forberedelse

Buffer Forberedelse krever gjennomføring av Crude Cell Extract Forberedelse, Amino Acid Solution Forberedelse, og Energy Solution Forberedelse. Hver buffer er unik for en batch av råolje celle ekstrakt. Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT (i den rekkefølgen) er optimalisert i denne delen for å produsere reaksjoner med maksimale nivåer av uttrykk. Følgende protokoll benytter en pre-skrevet mal, TXTL_e (mal) _calibration_JoVE.xlsx (Supplemental Material 3), for å kalibrere pre-forberedt råolje celle ekstrakt og forberede buffer. Imidlertid kan man også kalibrere rå celleekstrakt og forberede buffer uten malen ved å optimalisere Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT manuelt og sette opp buffer slik at sammen med ekstrakt, er det 75% av totalt reaksjonsvolum. Hvis kalibrering manuelt, kan sluttreaksjonsbetingelsene blir funnet i trinn fem.

1. Fullfør "Generelle data" form.
2. Tine på is 100 mM Mg-glutamat (4 ° C), 3 M K-glutamat (4 ° C), 6mM aminosyreløsning (26 pl, -80 ° C), Energy løsning (7 mL, -80 ° C), 100 mM DTT (-20 ° C), positiv kontroll-DNA (-20 ° C), 40% PEG- . 8000 (4 ° C), råolje celle ekstrakt (-80 ° C), og vann (4 ° C) Merk: Bruk en nM arbeidskonsentrasjon pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 (Addgene plasmid 40019) for den positive kontroll (eksitasjon 485 nm, emisjon 525 nm), eller en annen referanse som frembringer høy signalintensitet. ^fire
3. Forbered sju 10,5 mL reaksjoner, teste et utvalg av 4-10 mm Tilleggs Mg-glutamat, ved aliquoting sett mengder av lager Mg-glutamat i individuelle mikro-sentrifugerør. Merk: Selv om 10,5 mL reaksjoner er i utgangspunktet forberedt, er den endelige reaksjonen 10 mL.
4. Forbered mester blanding som angitt i malen under "Mg-glutamat kalibrering," legger til en ekstra 80 mM K-glutamat. Hold på is og vortex etter tilsetting av hvert element. Merk: De oppgitte og i malen verdier eri tillegg til de mengder av Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT til stede i S30B buffer brukt til å gjøre grove celleekstrakt.
5. Legg mester mix til prøver som inneholder Mg-glutamat og forberede reaksjoner. Se trinn 05.10 til 05.13 for detaljerte instruksjoner.
6. Løpe reaksjon ved 29 ° C, enten i en inkubator eller en plate-leser.
7. Bestem optimal Mg-glutamat konsentrasjon av end-uttrykk nivå og maksimal hastighet på protein uttrykk (figur 4a). Merk: Runtimes variere avhengig av eksperimentet, men vanligvis sist etter 8 timers.
8. Gjenta trinn 4.2 til 4.7 for K-glutamat under "K-glutamat kalibrering," innstilling Mg-glutamatnivåene til de som finnes i trinn 4.7.
9. Gjenta trinn 4.2 til 4.7 for DTT under "DTT kalibrering," innstilling Mg-glutamatnivåene med de som finnes i trinn 4,7 og K-glutamat nivåer til de som finnes i trinn 4.8. Merk: Vi har funnet ut at lagt DTT ikke vesentlig påvirke slutt uttrykk nivåer.
10. Brukverdier som finnes i kalibrerings under "Buffer sammensetning" for å bestemme sammensetningen av bufferen til å bli fremstilt. Basert på mengden av rå-celleekstrakt fremstilt, blir en konsentrat-blanding oppskrift produsert for en bestemt mengde av buffere.
11. Tine alikvoter som er oppført i master mix oppskrift på is. Tint, forbereder konsentrat-blanding, og holder på is og virvling etter tilsetningen av hvert element.
12. Delmengde av beløpet som er angitt under "Buffer komposisjon." Flash-fryse buffer rør i flytende nitrogen. Mens aliquoting, vortex hoved lager ofte.
13. Fjern rør fra flytende nitrogen ved hjelp av en sil og umiddelbart oppbevar ved -80 ° C. Sikkerhet: Bruk vernebriller, caps av ekstrakt rør kan komme ut på grunn av temperaturforskjellen mellom flytende nitrogen og romtemperatur.

5. Eksperimentell Gjennomføring av en TX-TL Reaction

Endelige reaksjonsbetingelser er: 8,9 til 9,9 mg / ml protei (fra rå ekstrakt), 4.5 mm-10.5 mM Mg-glutamat, 40-160 mM K-glutamat, 0,33 til 3,33 mM DTT, 1,5 mm hver aminosyre unntatt leucin, 1,25 mM leucine, 50 mMHEPES, 1,5 mM ATP og GTP, 0.9 mM CTP-og UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0,068 mM folinsyre, 1 mM spermidin, 30 mM 3-PGA-, 2% PEG-8000. En grunnleggende TX -TL-reaksjonen har tre deler (rør): urene celle-ekstrakt, buffer, og DNA. Forholdet er: 75% buffer og ekstrakt, 25% DNA Reaksjonene kan variere i volum, og vi bruker 10 mL av konvensjonen for å minimere reaksjon volum og aktiver kjører i en 384-brønns plate.. Større volumer krever agitasjon for riktig oksygenering. Følgende protokoll benytter en pre-skrevet mal, TXTL_JoVE.xlsx (Supplemental Material 4), for å gjennomføre en 10 mL reaksjon. Elementer i lilla indikerer brukerinngangsverdier, og elementer i blått angir ytterligere reagenser for å legge til reaksjonen. Imidlertid kan man også gjennomføre en reaksjon viddhout malen ved følgende reaksjons-betingelser som er skissert ovenfor.

1. Fullfør "Generelle data" form.
2. Under "Master Mix Forberedelse," sett inn ekstrakt prosentverdi fra trinn 4.1 i den lilla boksen.
3. Utform eksperimentet i silico hjelp av "Master Mix Preparation" (radene 10-17) og "DNA Preparation" (radene 19-50) seksjoner. Vanligvis kan konstanter bli satt inn i "Master Mix Forberedelse" delen, mens variabler kan settes inn i "DNA Forberedelse"-delen. Minimer prøver per eksperiment for å unngå prøve fordampning og eksperimentell starttid bias. Se figur 6 for en prøveoppsett.
4. Under "Master Mix Preparation", legger reagenser som indusere eller proteiner, som vil gå i alle prøver ved en konstant konsentrasjon. Fra og med rad 14, fylle ut de blå skyggelagte områder, holde ett reagens til hver linje. Enhetene er relative forholdstall.
5. Under "DNA Forberedelse," legge til DNA som vil være prøve spesifikkeic. Eksempel IDer # 1 og # 2 tilsvarer positive og negative kontroller, henholdsvis. Eksempel IDer # 3 og ovenfor er brukermodifiserbare for DNA, lager konsentrasjonen i ng / mL, lengde i basepar, ønsket sluttkonsentrasjon i nM, og gjentar (av 10 mL reaksjoner). Mengden av lager-DNA for å oppnå ønsket sluttkonsentrasjon beregnes automatisk. . Summen over p summene til 10,5 * n, hvor n er antallet av gjentakelser Merk: Selv om den endelige reaksjonsvolum er 10 pl, beregningene antar et totalvolum på 10,5 ul per reaksjon, for å ta hensyn til volumet som går tapt ved pipettering.
6. Under "DNA Preparation", legger reagenser eller flere DNA som vil være prøven bestemt til blå kolonner. Lager DNA-konsentrasjoner i nM kan beregnes i henhold til "DNA Preparation", mens eksempler på spesifikke reagenser krever manuell beregning basert på et totalt reaksjonsvolum på 10,5 * n. De angitte volumer trekkes ut av volumet av den samme raden vann.
7. Fjern nødvendig number av rør med buffer, rå celleekstrakt, og positiv kontroll under "-rør for å tine", fra -20 ° C eller -80 ° C og tines på is.
8. Forbered DNA-prøver. For hver prøve ID, delmengde ut den indikerte DNA, vann, og bruker levert elementer per den "DNA Forberedelse"-delen inn i en mikro-sentrifugerør, ved romtemperatur. Merk: for å unngå prøvetap, nylig kalibrert pipets og lav-stick pipettespisser og mikro-sentrifugerør anbefales.
9. Når rørene fra trinn 5.7 er tint, forberede master blanding bestående av buffer, ekstrakt, og eventuelle globale bruker levert elementer basert på de oransje-fargede bokser, holde på is og virvling etter tilsetting av hvert element. Merk: Extract er ekstremt tyktflytende. Aliquoter med bobler kan fjernes ved sentrifugering ved 10,000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C.
10. Til mengden av konsentrat-blanding som er angitt i de oransje celler under (kolonne O) "DNA Preparation" til hver DNA-prøve, og holdes i romtemture. behandle dette som reaksjonen starttid.
11. Vortex hver prøve, og sentrifuger ved 10 000 xg i 30 sekunder ved romtemperatur for å få ned eventuelle gjenværende prøven, og for å redusere bobler.
12. Hvis gjennomføre reaksjonen i mikro-sentrifugerør, ruge direkte på 29 ° C. . Ellers pipette 10 ul av prøven i en 384-brønners plate Merk: Reactions i volum som er større enn 10 ul krever omrøring for oksygenering.
13. Sentrifuger plate ved 4000 xg i 30 sekunder ved romtemperatur for å få ned eventuelle gjenværende prøven, og for å redusere bobler. Tett plate etterpå for å hindre fordamping.
14. Kjør reaksjon ved 29 ° C. Merk: Runtimes varierer avhengig eksperiment, men vanligvis vare i henhold til åtte timer.

Representative Results

Vi har presentert en fem dagers protokoll for fremstilling av en endogen Escherichia coli basert TX-TL cellefritt ekspresjonssystem. Et eksempel på tidslinjen for å lage de anvendte reagenser - urene celle-ekstrakt og buffer - kan finnes i figur 1. Når den er laget, kan disse lagres ved -80 ° C i opp til ett år. Etter reagenser er opprettet, kan eksperimentelle oppsett og gjennomføring gjøres på mindre enn åtte timer.

I tillegg har vi optimalisert uttrykket betingelser TX-TL cellefritt ekspresjonssystem. Andre bruker levert tillegg, slik som buffere eller DNA-løsninger, bør kalibreres for toksisitet på forhånd. For eksempel, forskjellige metoder for behandling plasmider fører til ekspresjon forskjellig på grunn av saltinnholdet. Vi har også testet effekten av Tris-Cl elueringsbuffer på reaksjonseffektiviteten (Fig. 5).

Et eksempel på rå celleekstrakt kalibrering, med henvisning trinn 4,1 til 4,9, er visti figur 4a. Generelt, våre forsøk viser at det urene celleekstrakt som er mest følsom for Mg-glutamat-nivåer, etterfulgt av K-glutamat-nivåer. For å demonstrere den cellefrie ekspresjonssystem, har vi konstruert og testet i en negativ tilbakekoblingssløyfe basert på tet undertrykkelse. ²⁶ (figur 6). I det cellefrie ekspresjonssystem, samme krets løpe med og uten ATC viser et 7-fold end-point ekspresjon endring av deGFP reporter etter åtte timers uttrykk. Selv om dette eksperimentet ikke krever globale indusere eller repressors, om nødvendig de kan legges under "Master Mix Forberedelse."

Figur 1. Tidslinje for råolje celleekstrakt, aminosyreløsning, og energi-løsning preparat. Med en fem dagers timelin e for en typisk gjennomføring av protokollen er gitt ovenfor, optimalisert for overnattings inkubasjoner og dagtid arbeidsmåten.

Figur 2. Kostnader og uttrykk analyse av konkurrerende råolje celle ekstrakter. a) Fordeling av kostnader til arbeidskraft og materialer av TX-TL celle-ytringsfrihet system. Basert på kostnader av reagenser fra desember 2012, og lønnskostnader på $ 14 per time. B) Sammenligning av TX-TL cellefrie uttrykk systemkostnader kontra andre kommersielle systemer. Kostnadene fordeler seg per mL, selv om reaksjonsvolumer kan variere per kit. C) Sammenligning av TX-TL celle-fri ytring system avkastning vs andre kommersielle systemer. Protein uttrykk avkastning bestemmes av produsenten standarder./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

Figur 3. Lasting og behandling av en perle-juling tube. a) demonstrasjon av riktig viskositet av celle-perle løsning. Cell-perle løsningen vil ha en viskositet avhengig av mange faktorer, blant annet hvor mye S30A buffer tilsatt, mengde perler lagt, og tid brukt på isen. B) Lasting av perle-juling røret før rask bordsentrifuge. Den sentrifuge fjerner bobler akkumulert under lasting. C) bobler til overflaten etter tabletop sentrifugering. Størrelsen på boblene vil variere, de kan være popped eller fjernes ved hjelp av en pipette tips d) Fullstendig fylt perle-juling røret før tildekking.. En menisk dannes i perle-slår tube, og hetten har nok til å dekke og forårsake små mengder til å overfylle. e) Korrekt lastet filter apparat. Disse kan gjenbrukes. F) Sammenligning av korrekt vs feilaktig behandlet perle-juling tube. Røret til venstre er et godt-beat tube - det har en liten og godt avgrenset øverste laget, og veldig klar supernatant. Røret til høyre er suboptimal, basert på den større, disig andre lag, og det uklare supernatanten. Rør som er suboptimal bør ikke gjennomgå ytterligere behandling.

Figur 4. Egenskaper av råolje ekstrakt preparater. a) Typiske tomter kalibrerings for råolje celle ekstrakt. Rå ekstrakt er kalibrert for ytterligere Mg-glutamat, K-glutamat, og DTT-nivåer, i den rekkefølgen. Vist er endepunkt fluorescence etter 8 timer, så vel som maksimal hastighet på proteinproduksjon basert på en 12-minutters glidende gjennomsnitt. Basert på disse tomter, er et akseptabelt utvalg av ekstra Mg-glutamat 4 mm, K-glutamat er 60-80 mM, og DTT er 0-3 mm. Merk at hver råekstrakt må kalibreres uavhengig for disse tre variablene. B) Variasjon fra ekstrakt forberedelser. Endpoint fluorescens av to Råekstrakter forberedt på forskjellige datoer vises; feilfelt er ett standardavvik fra tre uavhengige kjører på ulike dager. Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Effekter av DNA løsning på uttrykket effektivitet. a) Sammenligning av to forskjellige rensingmetoder for behandling av plasmider. 1 nM av pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 er utarbeidet ved hjelp av bare en QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification metode 1) eller post-behandlet med en QiaQuick PCR rensing kit (Purification metode 2). Vist er endepunkt fluorescens etter 8 timer, så vel som maksimal hastighet på proteinproduksjon basert på en 12-minutters glidende gjennomsnitt. Feilfelt er ett standardavvik fra fire uavhengige kjører på ulike dager. B) Effekt av elueringsbuffer (Tris-Cl). Forskjellige konsentrasjoner av Tris-Cl er sammenlignet i en cellefri ekspresjon reaksjon basert på ekspresjonen av 1 nM av pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Konsentrasjonene er gitt er endelige konsentrasjoner av Tris-Cl i reaksjonen; elueringsbufferen brukes er 10 mM Tris-Cl. Feilfelt er ett standardavvik fra tre uavhengige kjører på ulike dager. Klikk her for å se større figur .

Figur 6. Prøve TX-TL kjøring av en negativ feedback-sløyfe. a) Prøve oppsett av en cellefri utførelse reaksjon. Tester "på" vs "av" state of the negative feedback loop, med positive og negative kontroller. B) plasmidkartet negativ feedback loop. C) Representative resultater. Data er basert på forsøk a) og b), med negative kontroll subtrahert fra signalet. Genetisk kretsen vist i innsatsen. Feilfelt er ett standardavvik fra tre uavhengige kjører på ulike dager. Klikk her for å se større figur .

Navn	Konsentrasjon	Beløp	Sterilisering	Merknader
Kloramfenikol (Cm)	34 mg / ml i etanol	1 ml	Filter sterilisere (0,22 mm)	Kan gjøres i større mengder som er lagret ved -20 ° C for senere bruk.
2 x YT + P + Cm agar plate	31 g / L 2 x YT, 40 mM kaliumhydrogenfosfat, 22 mM kaliumfosfat enbasisk, 34 mg / ml kloramfenikol	En plate	Autoklav
2 x YT + P media	31 g / L 2 x YT, 40 mM kaliumhydrogenfosfat, 22 mM kaliumfosfat enbasisk	4 L	Autoklav

Tabell 1. Reagenser for dag 1 av Crude Cell Extract protokollen.

Navn	Konsentrasjon	Beløp	Sterilisering	Merknader
Tris basen	2. M	250 ml	Filter sterilisere (0,22 mm) eller autoklav	Kan lagres ved romtemperatur.
DTT	En M	6 ml	Filter sterilisere (0,22 mm)	Kan lages i store volumer og lagret ved -20 ° C for senere bruk.
S30A buffer	14 mM Mg-glutamat, 60 mM K-glutamat, 50 mM Tris, pH 7.7	2 L	Autoklav	For å nå pH 7,7, titrere med eddiksyre. Legg DTT 2 mM sluttkonsentrasjon like før bruk. Oppbevar ved 4 ° C.
S30B buffer	14 mM Mg-glutamat, 60 mm K-glutamat, ~ 5 mM Tris, pH 8,2	2 L	Autoklav	For å nå pH 8,2, titrere med 2MTris. Legg DTT til 1 mM sluttkonsentrasjon like før bruk. Oppbevar ved 4 ° C.

Tabell 2. Reagenser for dag to av Crude Cell Extract protokollen.

	Falcon
	1	2	3	4
Tomme 50 ml Falcon (g)
50 ml Falcon med pellet (g)
Pellet masse (50 ml Falcon med pellet - tomt 50 ml Falcon) (g)
S30A buffer volum for å legge til (pellet masse * 0,9) (ml)
Totale massen av perler å legge til (pellet masse * 5,0) (g)

Tabell 3. S30A buffer og perlemasse kalkulator, for dag tre av Crude Cell Extract protokollen.

Navn	Konsentrasjon	Beløp	Sterilisering	Merknader
HEPES	2 M, pH 8	4 ml	Ingen	For å nå pH 8, titrere med KOH.
Nucleotide Mix	156 mM ATP og GTP, 94 mm CTP og UTP, pH 7,5	1,5 ml	Ingen	For å nå pH 7,5, titrere med KOH.
tRNA	50 mg / ml	600 mL	Ingen
CoA	65 mM	600 mL	Ingen
NAD	175 mM, pH 7,5-8	300 mL	Ingen	For å nå pH 7,5-8, titrere med Tris på 2 M.
cAMP	650 mM, pH 8	200 mL	Ingen	For å nå pH 8, titrere med Tris på 2 M.
Folinsyre	33,9 mM	300 mL	Ingen	Selv om bare 300 mL er nødvendig, er oppskriften på supplerende for 1,15 ml.
Spermidin	1 M	150 mL	Ingen	Lagres ved 4 ° C, varme til 37 ° C for å smelte.
3-PGA	1,4 M, pH 7,5	3,2 ml	Ingen	For å nå pH 7,5, titrere med Tris ved 2 M.

Tabell 4. Reagenser for å forberede Energy Solution protokollen.

Supplerende materiale ett. Oppskrifter for varer.

Kloramfenikol, 34 mg / ml: Forbered 0,51 g kloramfenikol og legge etanol til 15 ml. Filter sterilisere (0,22 uM), prøve for å 1 ml rør, lagre ved -20 ° C for senere bruk.

2 x YT + P + Cm agarplate: Fremstill 1,24 g 2 x YT, 1,6 ml kaliumfosfat dibasisk løsning @ 1 M, 0,88 ml kaliumfosfat monobasisk-løsning @ 1 M, 0,6 g agar, og vann til 40 ml. Autoklav. Avkjøl til 50 ° C og tilsett 40 pl Cm. Delmengde 25 ml inn i en 100 x 15 mm petriskål, og la avkjøles i en time.

2 x YT + P medier: Forbered 124 g 2 x YT, 160 ml kaliumhydrogenfosfat løsning @ 1 M, 88 ml kalium fosfat enbasisk løsning @ 1 M, og vann til 4 L. Aliquot ut i 2 x 1,88 L og 0,24 L. Autoclave.

Tris base, 2 M: Klar 60,57 g Tris base og vann til 250 ml. Steriliser, lagre på RT for senere bruk.

DTT, 1 M: Fremstill 2,31 g DTT og vann til 15 ml. Filter sterilisere (0,22 uM), prøve for å 1 ml rør, lagre ved -20 ° C for senere bruk.

S30A buffer: Fremstill 10,88 g Mg-glutamat og 24,39 g K-glutamat, 50 ml Tris med 2M, eddiksyre (til pH 7,7) og vann til 2 L. Autoklaver, oppbevar ved 4 ° C, tilsett 4 ml 1 M DTT før bruk.

S30B buffer: Forbered 10.88 g Mg-glutamat og 24,39 g K-glutamat, Tris på 2 M (til pH 8,2), og vann til 2 L. Autoclave, oppbevar ved 4 ° C, tilsett 2 ml 1 M DTT før bruk.

HEPES: Fremstill 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (til pH 8), og vann til 4 ml.

tRNA: Fremstill 30 mg av tRNA og vann til 600 pl.

CoA: Fremstill 30 mg CoA (MW 767,53), og vann til 600 pl.

NAD: Legg 34.83 mg NAD (MW 663,43), Tris ved 2 M (pH 7,5-8), og vann til 300 pl. (Legg 27 pl av 2 M Tris ved å bringe løsningen til pH 7,5-8).

cAMP: til 42,80 mg av cAMP (MW 329,22), Tris ved 2 M (til pH 8), og vann til 200 pl. (Legg 73 pl av 2 M Tris ved å bringe oppløsningens pH-verdi 8).

Folinsyre (33,9 mm): Til 20 mg fast folinsyre kalsium salt (MW 511,5), tilsett 1,15 ml vann.

Spermidin: Fremstill 23.55 pl av spermidin (MW 145,25), og vann til 150 pl. Forbered ved romtemperatur etter smelting kort på 37 ° C.
3-PGA: til 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), Tris ved 2 M (pH 7,5), og vann til 3,2 ml. (Legg til 1,73 ml tris ved 2 M for å bringe løsningen til pH 7,5).

Nucleotide Mix: Legg 145 mg av ATP kalium salt dihydrat (MW 619,4), 133 mg av GTP dinatrium salt (MW 567,14), 79,4 mg av CTP dinatriumsalt dihydrat (MW 563,16), 82,6 mg UTP trinatriumsalt dihydrat (MW 586,12) , KOH ved 15% fortynning (til pH 7,5) og vann til 1,5 ml. (Til 353 pl av KOH ved 15% fortynning for å bringe løsningen til pH 7,5).

Supplerende materiale to. Bradford analysen.

1. Fjern Bradford middel fra 4 ° C og satt ved romtemperatur.
2. Forbered 50 mL BSA standard ved 1 mg / ml og 0.1 mg / ml.
3. Forbered 40 mL 20x fortynning av ekstrakt fra trinn 1.47.
4. Legg 800 mL vann til 7 kyvetter.
5. Forbered standard kyvetter for 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 pl 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ul 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 ul 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 pl 1 mg / ml BSA).
6. Forbered eksperimentelle kyvetter i 2 pl av prøven og 4 pl av prøven.
7. Legg 200 mL av Bradford agenten til hver kyvette og bland godt by pipettering. Inkuber ved romtemperatur i minst 10 min.
8. Produsere standard kurve på OD 595 nm med kyvetter fra trinn 6.5. Avvis standardkurve hvis r ² <0,95.
9. Bestem ekstrakt konsentrasjon på OD 595 nm med kyvetter fra trinn 6.6.

Supplerende materiale tre. Buffer kalibrering regneark.

Se TXTL_e (mal) _calibration_JoVE.xlsx .

Supplerende materiale fire. Cell-ytringsfrihet kjøre regneark.

Se TXTL _JoVE.xlsx .

Discussion

Den endogene Escherichia coli basert TX-TL celle-fri ytring system som beskrives her er en lett-å-løp tre tube reaksjon som kan ta mindre enn åtte timer fra satt opp til datainnsamling. Prosessen med å lage alle reagenser krever fem dagers tid totalt (med betydelige arbeidsforbruk på bare én dag), men produserer råolje ekstrakt for 3000 reaksjoner og buffer-making reagenser for 10 000 reaksjoner (figur 1). Videre rå ekstrakt og buffer-making reagenser er stabile i minst ett år ved -80 ° C, noe som åpner for flere bruksområder av en forberedelse. ⁴ På $ 0,11 per 10 mL reaksjon ($ 0,26 inkludert arbeid), kostnadene er 98% lavere enn sammenlignbare kommersielle systemer (figur 2).

Det er noen uløste begrensninger, men til systemet. Slutten effektiviteten av hver råolje celle ekstrakt forberedelse kan variere basert på brukerkompetanse og på miljøforhold, selv om typical utbytte variant er mellom 5-10% (figur 4b). Som et resultat av batch-til-batch-variabilitet i begge end-point uttrykk og i uttrykket dynamikk er å forvente. Disse variasjonene vil trolig forbli inntil ekstrakt er fullstendig karakterisert eller til ekstrakt skapelse er helautomatisk. Hvis den cellefrie ekspresjonssystem blir brukt til å drive sensitive kvantitative eksperimenter, er det tilrådelig å kjøre alle forsøk med den samme batch av rå celleekstrakt. Utbyttet fra en enkelt råolje celle ekstrakt batch, ca 3000 reaksjoner, bør være tilstrekkelig for typiske eksperimentelle kurs. Selv om vi har mistanke om variasjoner kan fjernes ved å skalere opp og å automatisere fremgangsmåten, ville slike forsøk innebære en betydelig ressurs investering.

I tillegg, selv om endepunktet uttrykk nivåer er rimelig lett å finne ut, trenger mer arbeid som må gjøres i forståelse dynamikk iboende til cellen fritt system. Det er kjent at både ressurs COMPETITIOn og ressursbegrensning kan påvirke uttrykket dynamikk. For eksempel kan det begrensede endogene sigma 70 resultere i en mette regime med økt DNA-templat som produserer et uttrykk profil analog med den i nukleotid-eller aminosyre-uttømming. ^9,27 imidlertid dynamikk trenger ikke å være fullt forstått å utnytte systemet. For rene økning av utbytte, kan optimalisering gjøres maskinelt-læring tilnærminger. ²⁸ spørsmål av ressurs konkurranse og begrensning kan løses ved matematiske modeller verifisert ved hjelp av eksperimentelle data.

Protokollen som presenteres her er optimalisert for en BL21-Rosetta2 belastning, men er generaliseres til andre E. coli-stammer. Modifikasjoner i BL21-Rosetta2, slik som fjerning av genet som koder lon proteasen og tilsetning av gener som koder for sjeldne tRNAs, tillate maksimal proteinproduksjon. Vi har forsøkt protokollen med to andre ekstrakt stammer - BL21 bare og en BL21 trxA knockout-end fant 50% mindre protein yield. Vi hypotese at rentene på samme måte redusere ved bruk av andre stammer. Andre endringer i parametere, slik som å bytte 2 x YT vekstmedium for LB og andre rike buljonger, har resultert i redusert proteinmengde.

Cell-free ekspresjonssystemer utnytte både endogene og eksogene transkripsjon-oversettelse maskiner og reguleringsmekanismer har brede programmer i både protein og metabolitt uttrykk og i syntetisk biologi. ^3,29 i stedet for å være begrenset til T7-regulert kretser, kan man tenke seg å produsere komplekse biomolekyler i et brukerstyrt innstilling ved hjelp av en blanding av innfødte E. coli arrangører og eksogent levert transkripsjon og reguleringsmekanismer. Uten begrensninger av celledeling og metabolisme, kan variasjonen i syntetiske kretser som repressilator eller metabolske veier konstruert slik som de produserende artemisinin reduseres eller bedre forstått. ^30,31 Vi have brukte disse fordelene for å gjennomføre genetiske brytere, samt å forstå sigma faktor sequestration ^9,32 Slik teknologi kan også danne ryggraden i "minimal" eller "kunstige" celler -. lite, godt karakterisert og selvforsynt legemlig enheter av ekstrakt. ^33,34

Til syvende og sist, forventer vi umiddelbare anvendelser av denne endogene celle-frie uttrykk system som en prototyping miljø for syntetisk biologi. Kallenavnet "TX-TL biomolekylære koblingsbrettet," the cell-free ekspresjonssystem gir et kontrollerbart miljø hvor syntetiske kretser til slutt bestemt for in vivo-ekspresjon kan gjennomgå runder med proto - sykluser av testing på basis plasmid, lineær, eller kjemisk syntetisert DNA, etterfulgt ved analyse og rask endring. Prototyping runder kan bli hjulpet av prediktive matematiske modeller for tiden under utvikling. Ved å fjerne kloning og in vivo manipulasjon for ikke-ferdige kretser, forventer vi engineering syklustider for å bli redusert til 1-3 dager i stedet for dagens ukers standard.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2xYT	MP biomedicals	3012-032
3-PGA	Sigma-Aldrich	P8877
ATP	Sigma-Aldrich	A8937
Bacto-agar	BD Diagnostics	214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials)	BioSpec	522S
Beads, 0.1mm dia.	BioSpec	11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain	Novagen	71402
Bradford BSA Protein Assay Kit	Bio-rad	500-0201
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919
CoA	Sigma-Aldrich	C4282
CTP	USB	14121
Cuvettes, 1.5ml	Fisher	14-955-127
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Folinic acid	Sigma-Aldrich	F7878
GTP	USB	16800
HEPES	Sigma-Aldrich	H6147
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605
Micro Bio-Spin Chromatography Columns	Bio-Rad	732-6204
NAD	Sigma-Aldrich	N6522
Nunc 384-well optical bottom plates	Thermo-Scientific	142761
Nunc sealing tape	Thermo-Scientific	232701
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium phosphate dibasic solution	Sigma-Aldrich	P8584
Potassium phosphate monobasic solution	Sigma-Aldrich	P8709
RTS Amino Acid Sampler	5 Prime	2401530
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)	Thermo-Scientific	66382
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558
Tris base	Fischer	BP1521
tRNA (from E. coli)	Roche Applied Science	MRE600
UTP	USB	23160
1L Centrifuge Bottle	Beckman-Coulter	A98813	This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.
4L Erlenmeyer Flask	Kimble Chase	26500-4000
Avanti J-26XP Centrifuge	Beckman-Coulter	393127	Or 1L-capable centrifuge equivalent.
Forma 480 Orbital Shaker	Thermo Scientific	480	Or chest-size 6x4L shaker equivalent.
JLA-8.1000 Rotor	Beckman-Coulter	363688	Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.
Mini-Beadbeater-1	BioSpec	3110BX
Supplemental Material 1. Recipes for Items. Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. 2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 °C and add 40 μl Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 μM), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 °C for later use. S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 4 ml 1 M DTT before use. S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 °C, add 2 ml 1 M DTT before use. HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 μl. CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 μl. NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 μl. (Add 27 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 μl. (Add 73 μl of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. Spermidine: Prepare 23.55 μl of spermidine (MW 145.25) and water to 150 μl. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 °C. 3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 μl of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). Supplemental Material 2. Bradford Assay. Remove Bradford agent from 4 °C and set at room temperature. Prepare 50 μl BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml. Prepare 40 μl 20x dilution of extract from step 1.47. Add 800 μl water to 7 cuvettes. Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μl 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μl 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μl 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μl 1 mg/ml BSA). Prepare experimental cuvettes for 2 μl of sample and 4 μl of sample. Add 200 μl of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min. Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 < 0.95. Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6. Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx. Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. See TXTL _JoVE.xlsx.