Summary
שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.
Abstract
מתחמי טיטניום (IV) ונדיום (V) הם סוכנים אנטי סרטני חזקים מאוד. אתגר בסינתזה שלהם מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic, ולכן ההכנה שלהם צריכה להתנהל תחת אווירת אינרטי. הערכה של הפעילות אנטי סרטנית של מתחמים אלה יכול להיות מושגת על ידי assay MTT.
Assay MTT הוא assay כדאיות colorimetric מבוסס על הפחתה האנזימטית של מולקולת MTT לformazan כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. התוצאה של הירידה היא שינוי צבע של מולקולת MTT. מדידות ספיגת יחסית לשליטה לקבוע את אחוז שנותר תאים סרטניים קיימא לאחר הטיפול שלהם בריכוזים שונים של מתחם שנבדק, אשר תורגם לפעילות אנטי סרטנית המתחם וIC 50 ערכיה. Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity בשל הדיוק שלו, מהירות ופשטות היחסית.
במסמך זה אנו מראשנשלח פרוטוקול מפורט לסינתזה של תרופות המבוססות על אוויר מתכת רגישה ומדידות כדאיות תא, כולל הכנה של צלחות התא, דגירה של התרכובות עם התאים, מדידות כדאיות באמצעות assay MTT, והנחישות של IC 50 ערכים.
Introduction
כימותרפיה היא עדיין אחד הקורסים העיקריים של טיפולים המועסקים במרפאת למחלות סרטן שונות, ובכך כמות עצומה של מחקר שנערכה ברחבי העולם במטרה לפתח תרופות נגד סרטן חדשים ומשופרות. מחקרים כאלה בעיקר להתחיל ברמה הכימית, עם העיצוב והכנה של תרכובות, ואחריו הערכה ביולוגית של התכונות ציטוטוקסיות במבחנה. כדאיות תא עשויות להיות מוערכות על ידי מבחני שונים המספקים מידע על פעילות תאית 1-2.
ציספלטין הוא דוגמא מורכבת פלטינה כי נעשה שימוש נרחב כתרופה כימותרפית, הנחשבת לטיפול יעיל בעיקר לסרטן אשכים ושחל 3-4. עם זאת, הטווח שלה צר פעילות ותופעות לוואי חמור לעורר מחקרים של קומפלקסי מתכות מעבר חזק אחרים 5-8. בין יתר, טיטניום (IV) ונדיום מתחמים (V) הראו תוצאות מבטיחות של פעילות גבוהה והקטינורעילות 9-16. טי (IV) מתחמים היו הראשונים להיכנס לניסויים קליניים לאחר ציספלטין בשל מאפיינים אלה, עם זאת, הם נכשלו בניסויים בשל קשיי ניסוח וחוסר יציבות hydrolytic. יש אפוא צורך הנוכחי לפתח נגזרים משופרים של מתחמי מתכת אלה שעשויים לשלב פעילות אנטי סרטנית גבוהה עם עמידות למים 15,17-21.
אתגר בהכנה של טי (IV) ו-V (V) מתחמים מתייחס לחוסר יציבות hydrolytic של ריאגנטים המבשר, ולכן, יש לשמור אווירת אינרטי. ההכנה של טי (IV) ו-V (V) תרכובות מתבצעת בתנאי N 2 או אר בתא הכפפות או תוך שימוש בטכניקות שורת Schlenk.
שיטה נפוצה אחת לצורך ההערכה של הפעילות אנטי סרטנית מבוססת על MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) רומיד -2,5-diphenyltetrazolium) assay. assay זה assay כדאיות colorimetric שהוצג ב1983 על ידי Mosmann22. הוא מאוד נחקר היטב ומאופיין, והיא נחשבת יעילה ביותר כאשר אנו מעריכים את האפקטיביות של תרכובות ציטוטוקסיות חדשות בשל הדיוק שלו, מהירות, ויכולתה להיות מיושמת במגוון רחב של שורות תאים. assay כדאיות זה מבוסס על שינוי הצבע של מולקולת MTT כאשר הוא נחשף לתאי קיימא. מדידה של הספיגה, שהוא פרופורציונאלי למספר תאי קיימא, והשוואה לקבוצת ביקורת שלא טופלה, מאפשרת הערכה של יכולות עיכוב צמיחת תאים של המתחם שנבדק.
Assay colorimetric MTT מתנהל במתכונת צלחת 96 היטב 23. התאים עשויים לדרוש preincubation בבארות לפני התוספת של התרופה הנבדקת. הפעמים preincubation עשויות להשתנות 0-24 שעה בהתאם למאפייני הקו הסלולרי. תאים בדרך כלל נחשפו לתרופה ל24-96 שעות בהתאם לפעילות התרופה. פתרון MTT הוא הוסיף אז לתאים שטופלו, שבו לצעוקow MTT מצטמצם formazan הסגול על ידי מגוון של אנזימים של המיטוכונדריה וcytosolic כי הם מבצעיים בתאי קיימא (איור 1) 24. מולקולת MTT לא מצטמצמת על ידי תאים מתים או תאי דם אדומים (מטבולית תאים לא פעילים), תאי טחול (תאי מנוחה) ולימפוציטים מגורה concanavalin (תאים הופעלו) 22. אחרי 3-4 שעות של דגירה עם MTT משקעים formazan. היווצרות formazan מתחילה אחרי 0.5 שעות של דגירה, אבל עבור תוצאות אופטימליות עדיף לחשוף את התאים לMTT לפחות 3 שעות 22. כתוצאה מכך, הגידול הבינוני מוסר וformazan הוא מומס בממס אורגני, רצוי isopropanol 25, למרות DMSO יכול לשמש גם 26. חיסולו של המדיום הוא חיוני להשגת תוצאות מדויקות מאז פנול אדום, שהוא נפוץ באופן נרחב במדיום גידול, והאצת חלבונים יכולים להפריע למדידת ספיגת 25. כאשר הפורםפתרון זאן מגיע הומוגנית, הספיגה של הפתרון נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר microplate קורא. הספיגה ב 550 ננומטר עומד ביחס ישר למספר התאים בטווח של 200-50,000 תאים לכל טוב, ולכן ניתן לאתרם כמויות קטנות מאוד של תאים 22. הספיגה מציינת את כמות תאי קיימא שנותרה לאחר טיפול בתרופה, והוא לעומת הספיגה של תאי בקרה שלא נחשפו לתרופה. ניתוח התוצאות על ידי תוכנה מתאימה מספק (ריכוז עיכוב; 50%) IC 50 ערכים והשגיאות הסטטיסטיות שלהם מבוססים על מספר חזרות של המדידה.
Assay MTT הוא נפוץ באופן נרחב במחקרי cytotoxicity להקרנת תרכובות אנטי סרטניות חדשות, בשל דיוקה ופשטות יחסית. עם זאת, בעת שימוש assay MTT, אשר היה תלוי בתגובה האנזימטית, יש לקחת בחשבון כי מעכבי אנזים שונים יכולים להשפיע על ההפחתה של MTTd להוביל לתוצאות שגויות 27. בנוסף, assay MTT אינו מספק כל מידע על המנגנון המולקולרי של הפעילות ציטוטוקסית של התרופה 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- הכנת V (V) מורכב (איור 2); 18 התנהלות צעדים 1.1-1.4 בתא הכפפות, אם כפפת תיבה אינה זמינה, דלג לחלופת שלבים 2 (2.1-2.6).
- ממיסים 0.42 מילימול של ligands H 2 L ב THF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) 3 בTHF.
- מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות, ולהסיר את נדיפים תחת ואקום.
- הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני.
- שוקל 8 מ"ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf. דלג לשלב 3.
- הכן מורכב V (V) באמצעות קו Schlenk.
- ממיסים 0.42 מילימול של L יגנד H 2 בTHF היבש בבקבוק Schlenk יבש עם כובע מחץ, לצרף קו Schlenk ולהחיל לסירוגין סביבות ואקום / גז אינרטי (N 2 או אר), מומלץ ליישם את שלושה sUCH סיבובים ולהמתין 2-5 דקות על שלבי הוואקום.
- הוספת THF היבש באמצעות מזרק דרך פקק מחצה.
- להוסיף כמויות שווה ערך של VO (O i Pr) 3 בתמיסת THF, שהוכנה באופן דומה על ידי משדלת בקבוק Schlenk יבש נכון לשורה, החלת סביבת אינרטי והוספת חומרים כימיים באמצעות מזרק מהפתרון ונדיום לזה של ליגנד.
- מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות ולהסיר את נדיפים תחת ואקום, ואם יש חשש של מוצרים יציבים, לבצע זיקוק סוג Schlenk של נדיפים תחת אווירת אינרטי; להשתמש זרימת גז אינרטי לצרף הזכוכית הנדרשת שpredried .
- הוספת הקסאן הקר ולהסיר אותו תחת ואקום. יש לקבל אבקה סגולה כהה בתשואה כמוני.
- שוקל 8 מ"ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf.
- הכנת Ti (IV) מורכב (איור 2); 28
- ממיסים 0.35 מילימול של L יגנד H 2 בTHF היבש ולהוסיף אותו לפתרון ערבוב של כמויות שווה ערך של טי (O i Pr) 4 בTHF.
- מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות. הסר את נדיפים תחת ואקום כדי לתת מוצר צהוב בתשואה כמוני.
- שוקל 8 מ"ג של המתחם שהושג בבקבוקון Eppendorf.
- תרבות HT-29 תאים בבקבוק 2 75 סנטימטר עם מדיום RPMI-1640 המכיל פניצילין / אנטיביוטיקה 1% סטרפטומיצין, 1% L-גלוטמין, ו10% בסרום שור העובר (FBS), על 37 ° C עם 5% CO 2 .
- הסר את המדיום כאשר HT-29 התאים מגיעים confluency המקסימאלי (90-100%, כל 3-4 ימים ללא תת). לשטוף עם 1 מיליליטרפתרון של טריפסין (0.25%) / EDTA (0.05%) ולהסיר אותו.
- הוסף 1 מיליליטר של טריפסין (0.25%) פתרון / EDTA (0.05%) ו דגירה במשך 5 דקות.
- לנתק את HT-29 התאים מהבקבוק ולהוסיף 10 מיליליטר של המדיום כדי להשבית את פעילות טריפסין. להעביר 5 מיליליטר של תערובת התאים לצינור.
- השתמש פיפטה להעביר כמה טיפות של תערובת התאים לתוך תא דלפק. קאמרי הדלפק כולל 5 x 5 ריבועים.
- ספירת התאים ב5 ריבועי נציג באמצעות מיקרוסקופ: 4 ריבועים בפינות והאחד שהוא באמצע.
- לחשב את הסכום המשוער של תאים קיימים. סיכום התאים ב5 ריבועי הנציג ולחלק ידי 20.
- מחלקים 0.6 ידי התוצאה של צעד 4.7. המספר שקיבל הוא כמות תערובת תא הנדרשת לכל צלחת. חישוב זה מתייחס לצלחת המכילה 0.6 x 10 6 תאים (9,000 תאים לכל היטב).
- השתמש פיפטה להעביר את כמות התערובת הדרושה לכל תא p(200 μl לכל טוב × 66 בארות) באיחור (כפי שמחושב בסעיף 4.8) ולהוסיף 13.2 מיליליטר של המדיום.
- מוסיף את התערובת לצלחת 96 היטב על ידי פיפטה 11 ערוצים (200 μl לכל טוב, 6 קווים, 66 בארות בסך הכל). גם אחד של כל שורה צריך להישאר ריקים לבקרה ריקה.
- דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך 24 שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לצלחת.
- הוסף 200 μl (או כמות שונה בהתאם לטווח הריכוז הרצוי) של THF היבש עד 8 מ"ג של כל מתחם שקל כפי שמתואר בשלב 1.4 (או 2.6) או 3.3. שוקל 8 מ"ג L יגנד H 2, יותר מדי.
- לדלל כל פתרון מתחם נוסף על ידי הוספת 60 μl של THF ב9 מבחנות אפנדורף שונות.
- העבר עם טפטפת 60 μl מהתערובת בסעיף 5.1 לבקבוקון אפנדורף הראשון, resuspend והעברת 60 μl לבקבוקון הבא, וכן הלאה עד 10 ריכוזים שונים הם obtained (כולל תערובת ההורה בסעיף 5.1).
- לדלל 20 μl של כל ריכוז בTHF עם 180 μl של מדיום.
- הכן פתרון שליטה עם THF בלבד; 20 μl של THF עם 180 μl של מדיום בכל מדידה.
- הוסף 10 μl מהפתרון שהתקבל (כולל שליטת THF), לכל טוב שכבר מכיל 200 μl של הפתרון הנ"ל של תאים במדיום לתת ריכוזים סופיים של המתחם של עד 200 מ"ג / ליטר (יכול טווח הריכוז להיות שונה בהתאם לפעילות במתחם).
- אתה יכול לראות כמה משקעים בריכוז הגבוה ביותר מיושם בהתאם למסיסות המתחם.
- חזור על כל מדידה של 3x המתחם (3 קווים בצלחת של אותו מתחם); כל שורה מכילה: תאים שטופלו במתחם ב10 ריכוזים שונים, 1 תאים המכילים גם טופלו בממס רק לבקרה ול1 גם ללא תאים לריקים שליטה.
- דגירה את הצלחת העמוסה במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 אווירה.
- הכן את פתרון MTT על ידי הוספת 1 גרם של אבקת MTT לפתרון 200 מיליליטר של מדיום RPMI-1640 ללא פנול אדום. פתרון המניות יכול להיות מחולק ל15 צינורות מיליליטר ומאוחסן -20 ° C.
- הוסף 20 μl של פתרון MTT לכל פיפטה 11 ערוצית באמצעות היטב (פרט לבארות שליטה הריקה ללא תאים מצעד 4.10), ו דגירה את הצלחת למשך 3 שעות נוספות.
- הסר את הפתרון הבינוני מכל טוב.
- הוסף 200 μl של isopropanol היטב כל אחד לפזר formazan. מערבבים את הצלחת ל0.5 שעה עד שיגיע homogeneousness.
- מדוד את הספיגה ב 550 ננומטר ל200 μl של הפתרון האמור על ידי ספקטרופוטומטר microplate קורא.
- חזור על כל מדידה (הכולל 3 חזרות, ראה שלב 5.8) ב -3 ימים שונים.
- לחשב tהוא אחוז של כדאיות תא על ידי ניכוי הערך ספיגת שליטה הריקה מהערך הנמדד, חלוקת התוצאה על ידי הספיגה של ערך שליטת ממס THF והכפלה ב100%.
- חישוב IC 50 ערכים באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה (או שווה ערך).
- IC דיווח 50 הוא הממוצע של כל IC 50 הערכים שנאספו על לפחות שלושה ימים שונים, ואת ערך השגיאה הוא סטיית התקן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מתחמים הוכנו על בסיס נהלים שנקבעו 18,28 וטוהר שלהם עשוי להיות מוערך על ידי ניתוח NMR ויסודות.
הנתונים שהתקבלו מassay MTT מנותח להעריך cytotoxicity של המתחם 18,21. ראשית, חיסור של הערך ספיגת שליטה הריקה מכל הערכים האחרים מתבצע. שנית, ערך שליטת ממס THF מוגדר כדאיות 100%, כפי שאין צמיחת עיכוב מתחם נוספת. כל הערכים האחרים הופכים אחוז הכדאיות בהתאם לשליטה. הריכוזים שיושמו ואחוז הכדאיות היחסי מחושב אז מוכנס לתוך תוכנת GraphPad פריזמה (או שווה הערך) כדי לקבוע את IC 50 הערכים הבוסס על רגרסיה ליניארית של שיפוע משתנה (ארבעה פרמטרים) מודל (איור 4, טבלת 1) 29.
המדידות צריכה להתבצע על מגווןשל ריכוזים שיפיקו גרף מוצגות חלוקה שווה נקודה: לפחות שלוש נקודות בכל רמה ושלוש נקודות כדי להגדיר את המדרון (איור 3, גרף). מדידות מספיקות בריכוזים גבוהים או ריכוזים נמוכים (איור 3, גרף ב ') תפגע בכושר רגרסיה ליניארית של העקומה הנדרשת לקביעת IC 50 ערכים, וכתוצאה מכך, מפחיתות את הדיוק שלהם.
IC 50 ערכים יחסי, כפי שנקבעו על ידי רגרסיה ליניארית 29 כושר, מתאימות לריכוזים מובילים ל50% מעיכוב צמיחת תאים אפשרי על ידי המתחם שנבדק, המחושב כנקודת אמצע בין המקסימאלי וכדאיויות תא מינימליות שנמדדו (לא בהכרח 100% ו -0%, בהתאמה, ראו איור 3, גרף ג, א). לדוגמא, אם מתחם מעכב רק 60% מתאי גידול יחסי לשליטה (ו 0% בריכוז נמוךים), 50 IC היחסי שלה הוא הריכוז שמוביל ל30% עיכוב ביחס לשליטה. ערכי השגיאה צריכים לשקף את הסטייה של התוצאות שהתקבלו לחזרות שונות מהערך IC 50 הממוצע שדווח, שנלקחו כמחלות המין. בנוסף, יש לדווח על ערכי עיכוב צמיחת תאים מקסימאלי (%), כפי שמחושבים על ידי הפחתה מ100% הכדאיות המינימלית שנמדדה.
ניתוח חלופי עשוי לכלול קביעת IC 50 ערכים מוחלטים. אלה מתאימות לריכוזים מובילים ל50% ביחס עיכוב צמיחת תאים לשליטת 100%, ללא קשר לכדאיויות התא המקסימאלי ומינימאליים שנמדדו. יכולים להיות גם נגזרים ערכים כזה על ידי מודל רגרסיה שאינו ליניארי. כערכים אלה הם מוחלטים, שדיווחו על ערכי עיכוב צמיחת תאים מקסימאלי הוא אופציונלי. כמתואר באיור 3, גרף C, תרכובת עשויה להיות פעילות נמוכה יחסית במונחים של g תא המקסימאלימאפייני עיכוב rowth (עקומה), ועדיין מפגין ערך IC 50 יחסי שהוא נמוך לא רק ממה המוחלט אחת שלה, אלא גם מזו של תרכובת המגיעה קרוב ל100% עיכוב גדילה (עקומה ב). זה יקר מאוד וכך להציג את העקומה יחד עם IC 50 ערכים המדווחים מכל סוג.
כאשר בודקים את התוצאות של הניסויים שתוארו בפרוטוקול (איור 4, טבלת 1), ברור שציספלטין וקומפלקסי LTI (O i Pr) 2 וVO (O i Pr) הם מאוד פעילים. זה גם בולט, כי ערך העיכוב המקסימאלי הקרוב יותר של מתחם נתון הוא ל100%, קרוב יותר IC 50 הערך היחסי הוא מוחלט אחת. כאשר משווים את IC 50 ערכים בין התרכובות השונות, יש לו את טי (IV) המורכב cytotoxicity הגבוה ביותר וIC 50 הערכים שלה נמוכים מאלה של ציספלטין ו V המורכב (V). עם זאת, freמוצגי יגנד דואר במידה ניכרת פעילות מופחתת, שכן בעקבות תוספת של ליגנד בריכוזים שונים, כדאיות התא לא לרדת באופן משמעותי כפי שהיא עושה למתחמים שלה. זה מבטיח כי הפעילות אנטי סרטנית הגבוהה של הקומפלקסים מסתמכת על מרכזי המתכת. מאז יגנד החופשי בקושי מגיע 50% עיכוב צמיחת תאים, לא ניתן לגזור IC 50 ערך מוחלט בצורה מדויקת. למעשה, ערך יחסי גם לא היה יכול להיות מחושב כראוי על ידי התוכנה בשל הפעילות קלה ומתאים לערכים גבוהות שגיאה. עם זאת, ברור כי גם אם IC 50 ערך יחסי יכול כבר נגזר על H 2 L, זה לא היה בא לידי ביטוי בפעילות ניכרת, וכך הופך את דו"ח ערך העיכוב המקסימאלי יחד עם IC 50 ערכים יחסי (והתיאור של העקומה) חיוני.
| 50 IC יחסית (מיקרומטר) | המוחלט 50 IC (מיקרומטר) | עיכוב מקסימאלי (%) | |
| LVO (O i Pr) | 13 ± 3 | 19 ± 8 | 81% |
| LTI (O i Pr) 2 | 3 ± 1 | 5 ± 3 | 87% |
| H 2 L | - | - | 47% |
| ציספלטין | 14 ± 5 | 13 ± 6 | 91% |
טבלת 1. תוצאות cytotoxicity לתרכובות שנבדקו: IC יחסית ומוחלט 50 (מיקרומטר) וערכים מרביים צמיחת תאי עיכוב כלפי HT-29 תאים הבאים תקופת דגירה של שלושה ימים עם V (V) LVO המורכב (O i Pr), Ti (IV ) מורכב LTI (O i Pr) 2, L יגנד החופשי H 2 וציספלטין; ניתנים 18,21 50 ערכי IC כממוצע של ליטר שלוש פעמים מזרחה שלוש חזרות עם ערכי שגיאה כמו מחלות מין.
איור 1. ההפחתה של MTT על ידי אנזימים של המיטוכונדריה וcytosolic לformazan. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. הכנת V (V) וטי (IV) קומפלקסים 18,28. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 3. דוגמאות לתוצאות של מדידות כדאיות תא. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 4. מינון עקומות תלויות cytotoxicity לתרכובות שנבדקו: תלותה של HT-29 כדאיות תא בריכוז מנוהל של V (V) LVO המורכב (O i Pr) (כחול), טי (IV) המורכב LTI (O i Pr) 2 ( , H אדום) ליגנד החופשי 2 L (שחור) וציספלטין (ירוק), לאחר תקופת דגירה של שלושה ימים, כobtained מלפחות שלוש פעמים בשלוש חזרות כפי שמשתקף בערכי השגיאה 18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת בכתב היד הזה משלבת סינתזה כימית עם assay כדאיות תא ביולוגי. כמו בכל שיטות ביולוגיות הנוגעות לתאי קיימא, הוא חיוני לעבודה בברדס למינרית, ולשמור על תנאים סטריליים, כוללים השימוש בממסים אורגניים סטרילי. כמו כן, הכנה ואחסון של תרופות על בסיס לא יציבה hydrolytically מתכת צריכה להתבצע בתנאי אינרטי, שעבורו צריכה להיות מנוצלים טכניקות תא הכפפות או קו Schlenk.
הבחירה של הטכניקה לעבוד תחת סביבת אינרטי היא בעיקר תלויה בזמינות של תא הכפפות. אם אחד זמין, כל הסינתזות שדורשות תנאי טמפרטורת חדר הם מאוד נוחים לבצע בו. סינתזות הדורשות חימום בדרך כלל נלקחו מהקופסה בבקבוק Schlenk ומצורפות אל קו Schlenk. איפה כפפת תיבה אינה זמינה, יכולות להתבצע כל המניפולציות עם כלי זכוכית שנבחרו בקפידה על Schleשורת nk, תוך שימוש בואקום / גז אינרטי (N 2 או אר) מניפולציות כדי לשמור על אווירה יבשה.
בתהליך הערכת cytotoxicity, יש צורך לבחון את המראה של התאים לאורך כל הניסוי. לפני תחילת הניסוי, מדיום הגידול של תאים חסיד בריאים צריך להיות ברור. תרבות מזוהמת תופיע עכורה. כמו כן, לאחר הדגירה של התאים עם טריפסין-EDTA, התאים צריכים להתנתק מהבקבוק ולטבול את הסוללה בינונית. אם רוב התאים להישאר דבק הבקבוק, הבקבוק צריך להיות מודגרות נוסף במשך כמה דקות.
אורכו של מדידה אחת כזו הוא חמישה ימים. אנו מאפשרים ליום אחד לתאים חסיד לצרף ולהסתגל לצלחת התא, ושלושה ימים לדגירה של התאים עם התרופות שנבדקו על מנת לאפשר לתאים כדי להמשיך לאפופטוזיס. יום נוסף נדרש לדגירת עם MTT. כל measureme זהNT יש לחזור לפחות עוד פעמים בימים שונים החל מתרביות תאים שונות, במטרה למדידות כדי להיות עצמאיות.
הטכניקה כפי שמתואר במסמך זה מוחלת על סוגים חסיד תא. על מנת ליישם את השיטה על סוגי nonadherent תא מספר התאמות צריכה להתבצע. הוא כבר לא נדרש להקדיש יום אחד לתאים לצרף ולהסתגל לצלחת התא, ולכן ההכנה של הצלחת והתוספת של התרופות שנבדקו יכולים להיות מושלמת באותו היום. בנוסף, בשלב הסופי של המדידה, רק לאחר הדגירה של התאים עם MTT, הפתרון צריך להיות centrifuged לפני הסרת בינונית ותוספת של isopropanol.
אפשר גם להחליף את הניצול של MTT כסמן של תאים חיוניים עם assay חלופי לעיכוב צמיחת תאים, שבו זמן הדגירה של התאים עם הסמן הוא קצר יותר מאשר לאכובע עם 30 MTT. גורם נוסף שיש לשקול בעת בחירת הסמן הוא מנגנון פעולה האפשרי של התרופה נבדקה 27. Assay MTT מספק מידע על פעילות המטבולית מיטוכונדריה, וכי הוא תלוי בתגובות אנזימטיות, ניתן להשפיע עליו על ידי מעכבי אנזים.
השילוב של הכנת תרופה עם ההערכה של cytotoxicity באמצעות assay MTT מייצג שיטה יעילה לפיתוח תרופות ציטוטוקסיות המבוסס על מתכת חדשה. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת כל מידע לגבי מנגנון המוות של תאים, השלב במחזור התא שמושפע מהסמים והמטרות הביולוגיות האפשרית שלו. למטרות אלה שיטות נוספות, כגון יודיד Propidium (PI) ספיגה Assay וניתוח מחזור התא צריכה להתבצע ביום 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מימון התקבל ממועצת המחקר האירופית במסגרת התכנית של הקהילה האירופית מסגרת השביעית (FP7/2007-2013) / הסכם גרנט ERC אין [239,603]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
References
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
- Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
- Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
- Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
- Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
- Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
- Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
- Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
- Meléndez, E.
- Evangelou, A. M.
- Djordjevic, C.
- Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C.
- Caruso, F., Rossi, M.
- Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
- Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A.
- Buettner, K. M., Valentine, A. M.
- Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
- Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
- Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
- Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
- Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
- Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
- Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research. 48, 589-601 (1988).
- Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
- Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
- Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
- McCarthy, N. J., Evan, G. I. Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).
