Summary
Werkwijze voor de synthese van lucht-gevoelige titaan en vanadium antikankermiddelen wordt beschreven, samen met de evaluatie van hun cytotoxische activiteit voor humane kankercellijn de MTT assay.
Abstract
Titaan (IV) en vanadium (V)-complexen zeer krachtige anti-kanker middelen. Een uitdaging in hun synthese verwijst naar hun hydrolytische instabiliteit derhalve hun bereiding onder een inerte atmosfeer uitgevoerd. Evaluatie van de antikanker activiteit van deze complexen kunnen worden bereikt door de MTT-bepaling.
De MTT test is een colorimetrische levensvatbaarheid-assay gebaseerd op enzymatische reductie van MTT tot formazan molecuul wanneer het wordt blootgesteld aan levensvatbare cellen. Het resultaat van de reductie is een kleurverandering van de MTT molecuul. Absorptiemetingen opzichte van een controle bepalen percentage resterende levensvatbare kankercellen na de behandeling met verschillende concentraties van de geteste verbinding, die wordt omgezet naar de verbinding antikanker activiteit en de IC50-waarden. De MTT-test is algemeen gebruikelijk in cytotoxiciteit studies vanwege zijn nauwkeurigheid, snelheid en relatieve eenvoud.
Hierin hebben we pregaf een gedetailleerd protocol voor de synthese van lucht gevoelige metaal gebaseerde geneesmiddelen en cellevensvatbaarheid metingen, inclusief voorbereiding van de celplaten, incubatie van de verbindingen met de cellen, de levensvatbaarheid met de MTT-bepaling en de bepaling van IC50-waarden.
Introduction
Chemotherapie is nog steeds een van de belangrijkste reeksen behandelingen die in de kliniek voor diverse kanker ziekten, en dus enorme hoeveelheid onderzoek is wereldwijd uitgevoerd teneinde nieuwe en verbeterde geneesmiddelen tegen kanker te ontwikkelen. Dergelijke studies meestal beginnen op chemisch niveau, met het ontwerp en de bereiding van verbindingen, gevolgd door biologische evaluatie van de cytotoxische eigenschappen in vitro. Levensvatbaarheid van de cellen kan worden beoordeeld door de verschillende testen die informatie over de cellulaire activiteit 1-2 bieden.
Cisplatine is een voorbeeld van een platina complex dat veel gebruikt wordt als een chemotherapeutisch middel, dat wordt beschouwd als een efficiënte behandeling voornamelijk testis en ovarium 3-4. Echter, de smalle activiteit bereik en ernstige bijwerkingen veroorzaken studies van andere krachtige overgangsmetaalcomplexen 5-8. Onder andere, titaan (IV) en vanadium (V)-complexen waren veelbelovend hoogactieve en verminderdetoxiciteit 9-16. Ti (IV)-complexen werden de eerste klinische fase te starten na cisplatine vanwege deze eigenschappen, maar hebben ze niet de onderzoeken vanwege formulering moeilijkheden en hydrolytische instabiliteit. Er is dus een huidige behoefte aan verbeterde derivaten van deze metaalcomplexen die hoge antikanker activiteit kan combineren met waterbestendigheid 15,17-21 ontwikkelen.
Een uitdaging bij de bereiding van Ti (IV) en V (V) complexen betrekking op de hydrolytische instabiliteit van de precursor reagentia en derhalve dient inerte atmosfeer gehandhaafd. De bereiding van Ti (IV) en V (V) verbindingen wordt uitgevoerd onder N2 of Ar omstandigheden in een zuurkast of via Schlenk lijn-technieken.
Een gemeenschappelijke methode voor het evalueren van de activiteit tegen kanker is het MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay. Deze test is een colorimetrische test die de levensvatbaarheid in 1983 door Mosmann22. Het is zeer goed bestudeerd en gekarakteriseerd, en het wordt beschouwd als zeer efficiënt bij de beoordeling van de effectiviteit van nieuwe cytotoxische verbindingen vanwege zijn precisie, snelheid en zijn vermogen aan te brengen op diverse cellijnen. De levensvatbaarheid assay is gebaseerd op de kleurverandering van de MTT molecuul wanneer het wordt blootgesteld aan levensvatbare cellen. Meting van de absorptie, die evenredig is met het aantal levensvatbare cellen, en vergelijking met onbehandelde controles, maakt beoordeling van de celgroei remming mogelijkheden van de geteste verbinding.
De MTT-colorimetrische test wordt uitgevoerd in een 96-putjes 23. De cellen kunnen voorincubatie in de putjes voor de toevoeging van het geteste geneesmiddel vereisen. De pre-incubatie kunnen variëren 0-24 uur afhankelijk van de cellijn eigenschappen. Cellen worden gewoonlijk blootgesteld aan het geneesmiddel 24-96 uur afhankelijk van de drugactiviteit. MTT oplossing wordt vervolgens toegevoegd aan de behandelde cellen, waarbij de schreeuwenow MTT paars formazan verminderd verschillende mitochondriale en cytosolische enzymen die operationeel in levensvatbare cellen (figuur 1) 24 zijn. De MTT molecuul wordt niet verminderd door dode cellen of rode bloedcellen (metabolisch inactieve cellen), miltcellen (rustende cellen) en concanavaline-A gestimuleerde lymfocyten (geactiveerde cellen) 22. Na 3-4 uur incubatie met MTT de formazan precipitaten. De vorming van formazan begint na 0,5 uur incubatie maar voor een optimaal resultaat is het het beste om de cellen bloot te MTT tenminste 3 uur 22. Bijgevolg wordt het groeimedium verwijderd en de formazan wordt opgelost in een organisch oplosmiddel, bij voorkeur isopropanol 25, hoewel DMSO kan worden gebruikt 26. De eliminatie van het medium is cruciaal om nauwkeurige resultaten omdat fenolrood, die op grote schaal voor in groeimedium en neerslaan eiwitten kunnen interfereren met de absorptie meting 25. Wanneer de formazan oplossing bereikt homogeen, de extinctie van de oplossing wordt gemeten met een spectrofotometer microplaat lezer. De absorptie bij 550 nm is recht evenredig met het aantal cellen in het bereik van 200-50,000 cellen per putje, en dus zeer kleine hoeveelheden cellen kan worden gedetecteerd 22. De absorptie geeft de hoeveelheid levensvatbare cellen die overblijven na behandeling met het geneesmiddel, en vergeleken met de absorptie van controlecellen die niet werden blootgesteld aan het geneesmiddel. Analyse van de resultaten op juiste software geeft de IC50 (inhibitie concentratie 50%) waarden en hun statistische fouten gebaseerd op verschillende herhalingen van de meting.
De MTT test is algemeen gebruikelijk in cytotoxiciteit studies voor het screenen van nieuwe anti-kanker verbindingen, vanwege zijn relatieve eenvoud en nauwkeurigheid. Wanneer echter de MTT assay, die afhankelijk enzymatische reactie moet men overwegen dat verschillende remmers opstelling kan de reductie van MTT eend leiden tot verkeerde resultaten 27. Bovendien is de MTT-bepaling geen enkele informatie over het moleculaire mechanisme van de cytotoxische activiteit van het geneesmiddel 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
- Voorbereiding van de V (V) complex (figuur 2); 18 gedragingen stappen 1,1-1,4 in een handschoen-box, als een handschoen-doos niet beschikbaar is, doorgaan naar de alternatieve stappen 2 (2,1-2,6).
- Los 0,42 mmol van de liganden H 2 L in droog THF toevoegen aan een geroerde oplossing van equivalente hoeveelheden van VO (O'Pr) 3 in THF.
- Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 min, en verwijdert de vluchtige stoffen onder vacuüm.
- Voeg koude hexaan en verwijder deze onder vacuüm. Een donkerpaars poeder moet worden verkregen in een kwantitatieve opbrengst.
- Weeg 8 mg van de verkregen verbinding in een Eppendorf buisje. Doorgaan naar stap 3.
- Bereid de V (V) complex met een Schlenk lijn.
- Ontbinden 0,42 mmol van het ligand H 2 L in droge THF in een droge Schlenkkolf met een septumdop, hechten aan een Schlenk lijn en toepassen afwisselend vacuüm / inert gas (N2 of Ar) omgevingen, het is aan te raden om drie s toe te passenuch rondes en wacht 2-5 min. op de vacuüm fases.
- Voeg droge THF via een injectiespuit door het septum dop.
- Voeg equivalente hoeveelheden van VO (O'Pr) 3 in een THF-oplossing, die op soortgelijke wijze had voorbereid door het inhaken van een goede droge Schlenkkolf aan de lijn, het aanbrengen van een inerte atmosfeer en het toevoegen van de reagentia door middel van een spuit van de vanadium oplossing aan die van het ligand.
- Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en verwijder de vluchtige stoffen onder vacuüm, als er een probleem van onstabiele producten, voeren Schlenk soort destillatie van de vluchtige stoffen onder een inerte atmosfeer; gebruik inert gasstroom naar de gewenste glaswerk die was voorgedroogd hechten .
- Voeg koude hexaan en verwijder deze onder vacuüm. Een donkerpaars poeder moet worden verkregen in een kwantitatieve opbrengst.
- Weeg 8 mg van de verkregen verbinding in een Eppendorf buisje.
- Bereiding van de Ti (IV) complex (Figuur 2), 28
- Los 0,35 mmol van het ligand H 2 L in droog THF toevoegen aan een geroerde oplossing van equivalente hoeveelheden van Ti (O'Pr) 4 in THF.
- Roer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Verwijder de vluchtige stoffen onder vacuüm om een gele product in een kwantitatieve opbrengst.
- Weeg 8 mg van de verkregen verbinding in Eppendorf buisje.
- Cultuur HT-29 cellen in een 75 cm2 fles met RPMI-1640 medium dat 1% penicilline / streptomycine antibiotica, 1% L-glutamine en 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C met 5% CO2 bevat .
- Verwijder het medium als de HT-29 cellen te bereiken maximale confluentie (90-100%, om de 3-4 dagen zonder subcultuur). Wassen met 1 mltrypsine (0,25%) / EDTA (0,05%) oplossing en verwijder deze.
- Voeg 1 ml trypsine (0.25%) / EDTA (0,05%) oplossing en incubeer gedurende 5 minuten.
- Maak de HT-29 cellen van de kolf en voeg 10 ml van het medium om de trypsine-activiteit uit te schakelen. Breng 5 ml van de cellen mengsel tot een buis.
- Gebruik pipet een paar druppels van de cellen mengsel over in teller kamer. De teller kamer bevat 5 x 5 vierkanten.
- Tel de cellen in 5 representatieve pleinen met behulp van een microscoop: de 4 vierkantjes in de hoeken en de een is dat in het midden.
- Bereken het geraamde bedrag van cellen aanwezig. Tel de cellen in de 5 representatieve pleinen en delen door 20.
- Verdeel 0.6 door het resultaat van stap 4.7. Het ontvangen nummer is de hoeveelheid celmengsel nodig per plaat. Deze berekening heeft betrekking op een plaat die 0,6 x 10 6 cellen (9000 cellen per well) bevat.
- Gebruik pipet om de hoeveelheid celmengsel nodig per p overdragenlaat (zoals berekend in paragraaf 4.8) en voeg 13,2 ml van het medium (200 ul per putje × 66 putten).
- Voeg het mengsel aan 96-wells plaat met 11-kanaals pipet (200 ul per putje 6 lijnen 66 putjes in totaal). Een goed van elke regel moet voor blanco controle leeg blijven.
- Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 24 uur om de cellen te hechten aan de plaat.
- Voeg 200 ul (of verschillende hoeveelheid afhankelijk van de gewenste concentratiebereik) droge THF tot 8 mg van elke verbinding gewogen zoals beschreven in stap 1.4 (of 2.6) en 3.3. Weeg 8 mg van de ligand H 2 L, ook.
- Verdun elke verbinding oplossing verder door 60 gl THF 9 verschillende Eppendorf buisjes.
- Breng met een pipet 60 ul van het mengsel in paragraaf 5.1 de eerste Eppendorf flesje, resuspendeer en overdracht 60 ul aan de volgende flesje, en zo verder tot 10 verschillende concentraties obtained (inclusief de ouderdieren mengsel in paragraaf 5.1).
- Verdun 20 pi van elke concentratie in THF met 180 pl medium.
- Bereid een controlevloeistof slechts THF, 20 pl THF met 180 ul medium in elk meting.
- Voeg 10 ul van de verkregen oplossing (inclusief THF controle), aan elk putje waar al 200 pl van de bovengenoemde oplossing van cellen in het medium tot eindconcentraties van de verbinding van maximaal 200 mg / L geven (het concentratiebereik kan worden aangepast aan de verbinding activiteit).
- U sommige precipitatie bij de hoogste concentratie verschilt naar gelang van de oplosbaarheid van de verbinding nemen.
- Herhaal de meting van de samenstelling 3x (3 lijnen in de plaat van dezelfde verbinding); elke regel: cellen behandeld met de verbinding in 10 verschillende concentraties, 1 putje met cellen behandeld met oplosmiddel alleen voor controle en 1 goed zonder cellen blanco controle.
- Incubeer de geladen plaat gedurende 3 dagen bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer.
- Bereid de MTT door toevoeging van 1 g MTT poeder een 200 ml oplossing van RPMI-1640 medium zonder fenol rood. De stamoplossing kan worden verdeeld over 15 ml buizen en opgeslagen in -20 ° C.
- Voeg 20 ul MTT-oplossing aan elk putje met 11-kanaals pipet (behalve de blanco controleputjes zonder de cellen van stap 4.10) en incubeer de plaat gedurende nog 3 uur.
- Verwijder het medium uit elk putje oplossing.
- Voeg 200 ul isopropanol aan elke well formazan te lossen. Roer de plaat gedurende 0,5 uur tot homogeniteit is bereikt.
- Meet de absorptie bij 550 nm van 200 pl van de bovengenoemde oplossing met een spectrofotometer microplaat lezer.
- Herhaal elke meting (dat is inclusief 3 herhalingen, zie stap 5.8) op 3 verschillende dagen.
- Bereken tHij percentage levensvatbaarheid van de cellen verminderd met het blanco controle absorptiewaarde van de gemeten waarde, het resultaat te delen door de absorptie van de THF-oplossingen controlewaarde en vermenigvuldigen met 100%.
- Bereken IC50 waarden met GraphPad Prism software (of gelijkwaardig).
- De gerapporteerde IC50 is het gemiddelde van IC50 waarden verzameld op ten minste drie verschillende dagen, en de foutwaarde de standaarddeviatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De complexen werden opgesteld op basis van vastgestelde procedures 18,28 en hun zuiverheid kan worden beoordeeld met behulp van NMR en elementaire analyse.
De van de MTT assay gegevens geanalyseerd om de cytotoxiciteit van de verbinding 18,21 evalueren. Eerst wordt aftrekken van de blanco controle absorptiewaarde van alle andere waarden uitgevoerd. Ten tweede wordt de THF-oplossingen regelwaarde op 100% levensvatbaarheid als geen groei remmende verbinding werd toegevoegd. Alle andere waarden worden omgezet in percentage levensvatbaarheid overeenstemming met het besturingssignaal. De concentraties toegepast en de relatieve levensvatbaarheid percentage berekend worden vervolgens in de GraphPad Prism software (of gelijkwaardig) om de IC50-waarden op basis van een lineaire regressie van een variabele helling (vier parameters) model (figuur 4, tabel 1) 29 te bepalen.
De metingen moeten worden uitgevoerd op een reeksvan concentraties die een grafiek een nog puntenverdeling zal produceren: minstens drie punten op elk plateau en drie punten op de helling (figuur 3, grafiek A) definiëren. Onvoldoende metingen bij hoge concentraties of lage concentraties (Figuur 3, grafiek B) de lineaire regressie pasvorm van de curve die voor de bepaling van IC50-waarden beïnvloeden, en daardoor verminderen de nauwkeurigheid daarvan.
Relatieve IC50-waarden, zoals bepaald door de lineaire regressie pasvorm 29, overeen met de concentraties die tot 50% van de celgroei remming kan door de geteste verbinding, die wordt berekend als het middelpunt tussen de maximale en minimale cellevensvatbaarheid gemeten (niet se 100% en 0%, respectievelijk, zie figuur 3, grafiek C, a). Bijvoorbeeld, indien een verbinding remt slechts 60% van celgroei opzichte van de controle (0% en een lage concentraties), de relatieve IC50 is de concentratie die tot 30% remming ten opzichte van de controle. De foutwaarden moet de afwijking van de verkregen voor verschillende herhalingen van de gemiddelde IC50 waarde gerapporteerd, geldt als soa resultaten weerspiegelen. Bovendien moeten maximale celgroei inhibitie (%) waarden worden gerapporteerd, zoals berekend door van 100% de minimale levensvatbaarheid gemeten.
Een alternatieve analyse kunnen bepalen van absolute IC50 waarden. Deze corresponderen met de concentratie die tot 50% remming van celgroei opzichte van de 100% controle, ongeacht de maximale en minimale cellevensvatbaarheid gemeten. Dergelijke waarden kunnen ook worden verkregen door een niet-lineaire regressiemodel. Omdat deze waarden zijn absolute, het rapporteren van de maximale celgroeiremming waarden is optioneel. Zoals weergegeven in figuur 3, grafiek C, een verbinding kan een relatief lage activiteit in termen van de maximale cel gGROEI inhibitie eigenschappen (curve a), en toch vertonen een relatieve IC50 waarde die lager is dan niet alleen de absolute een, maar dan een samenstelling die dicht bij 100% groeiremming (curve b) bereikt. Het is dus uiterst waardevol voor de curve met de gerapporteerde IC50 waarden van welke aard presenteren.
Bij de inspectie van de resultaten van de in het protocol beschreven experimenten (figuur 4, tabel 1), blijkt dat cisplatine en complexen LTi (O'Pr) 2 en VO (O'Pr) zijn zeer actief. Het is ook opvallend dat hoe dichter de maximale remming waarde van een bepaalde verbinding tot 100%, hoe dichter de relatieve IC50 waarde is de absolute een. Bij het vergelijken van de IC50-waarden van de verschillende verbindingen, de Ti (IV) complex het hoogste cytotoxiciteit en de IC50 waarden lager dan die van cisplatin en V (V) complex. Echter, de frequentiee ligand vertoont sterk verminderde activiteit, omdat na toevoeging van het ligand in verschillende concentraties, ofwel de levensvatbaarheid van de cellen niet zo aanzienlijk dalen als voor de complexen. Dit verzekert dat de hoge antikanker activiteit van de complexen is gebaseerd op de metaalcentra. Aangezien het vrije ligand nauwelijks 50% celgroei remming bereikt, absolute IC50 waarde niet nauwkeurig worden afgeleid. In feite is een relatieve waarde kon ook niet op adequate wijze zijn berekend door de software te wijten aan de geringe activiteit en de bijbehorende hoge foutenpercentages waarden. Niettemin is duidelijk dat zelfs wanneer een relatieve IC50 waarde kon worden afgeleid voor H 2 L, zou niet weerspiegeld merkbare activiteit, waardoor het verslag van de maximale remming waarde rendering met relatieve IC50-waarden (en de voorstelling van de curve) van essentieel belang.
| Relatieve IC50 (uM) | Absolute IC50 (uM) | Maximale remming (%) | |
| LVO (O'Pr) | 13 ± 3 | 19 ± 8 | 81% |
| LTi (O'Pr) 2 | 3 ± 1 | 5 ± 3 | 87% |
| H 2 L | - | - | 47% |
| Cisplatine | 14 ± 5 | 13 ± 6 | 91% |
Tabel 1. Cytotoxiciteit resultaten voor de geteste verbindingen: relatieve en absolute IC50 (uM) en maximale remming van celgroei waarden gaan HT-29-cellen na een incubatieperiode van drie dagen met de V (V) complex slechtzichtvlucht (O'Pr), Ti (IV ) complex LTi (O'Pr) 2, het vrije ligand H 2 L en cisplatine; 18,21 IC50 waarden zijn gegeven als gemiddelde van ten l oosten drie keer drie herhalingen met foutwaarden als soa's.
Figuur 1. De reductie van MTT door mitochondriale en cytosolische enzymen om formazan. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Bereiding van V (V) en Ti (IV) complexen 18,28. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Voorbeelden van resultaten van de levensvatbaarheid van de cellen metingen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Dosisafhankelijke cytotoxiciteit curven voor de geteste verbindingen: Afhankelijkheid van HT-29 cel levensvatbaarheid op toegediende concentratie van de V (V) complex slechtzichtvlucht (O'Pr) (blauw), Ti (IV) complex LTI (O'Pr) 2 ( rood), vrij ligand H 2 L (zwart) en cisplatine (groen), na een incubatietijd van drie dagen, zoals obtained uit ten minste drie maal drie herhalingen zoals weerspiegeld door de fout waarden 18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De methode combineert dit manuscript beschreven chemische synthese met biologische cellevensvatbaarheid assay. Zoals bij elke biologische methoden betreffende levensvatbare cellen, is het essentieel om te werken in een laminaire kap en onderhouden steriele omstandigheden, inclusief het gebruik van steriele organische oplosmiddelen. Ook, bereiding en opslag van instabiel voor hydrolyse metaal gebaseerde geneesmiddelen moeten worden uitgevoerd onder inerte omstandigheden, waarvoor handschoenenkastje of Schlenk lijn technieken moeten worden gebruikt.
De keuze van de techniek te werken onder inerte atmosfeer is grotendeels afhankelijk van de beschikbaarheid van een handschoen-box. Indien beschikbaar, alle syntheses dat kamertemperatuur omstandigheden vereisen zijn zeer handig om daarin uit te voeren. Syntheses dat verwarming nodig zijn normaliter uit de doos genomen in een Schlenkkolf en zijn bevestigd aan de Schlenk lijn. Wanneer een handschoen-doos is niet beschikbaar, alle manipulaties kunnen worden uitgevoerd met zorgvuldig geselecteerde glaswerk uitgevoerd op een Schlenk lijn, terwijl het gebruik van het vacuüm / inert gas (N2 of Ar) manipulaties te droge atmosfeer te behouden.
In de cytotoxiciteit evaluatieproces, dient om het uiterlijk van de cellen gedurende het experiment te onderzoeken. Voor het begin van het experiment, dient het groeimedium van gezonde hechtende cellen duidelijk zijn. Een verontreinigde cultuur verschijnt troebel. Ook na de incubatie van de cellen met trypsine-EDTA, dient de cellen los van de kolf en dompel in het medium. Indien meeste cellen gehecht blijven aan de kolf, moet de kolf verder geïncubeerd gedurende enkele minuten.
De lengte van een dergelijke meting is vijf dagen. Wij staan een dag voor de hechtende cellen te bevestigen en te wennen aan de celplaat en drie dagen voor de incubatie van de cellen met de geteste geneesmiddelen om de cellen te laten voortgaan apoptose. Een extra dag nodig voor incubatie met MTT. Deze hele metent ten minste twee keer herhaald op verschillende dagen vanaf verschillende cellijnen, zodat de meting onafhankelijk is.
De techniek zoals hierin beschreven wordt toegepast hechtende celtypen. Om deze methode toe te passen op niet-hechtende celtypen moet met een aantal aanpassingen worden aangebracht. Het is niet langer nodig om een dag te wijden aan de cellen te hechten en wennen aan de celplaat en derhalve de bereiding van de plaat en de aanvulling van de geteste geneesmiddelen kan worden uitgevoerd op dezelfde dag. Bovendien, in de laatste stap van de meting, net na de incubatie van de cellen met MTT, de oplossing moet vóór de verwijdering drager en toevoeging van isopropanol gecentrifugeerd.
Het is ook mogelijk om het gebruik van MTT vervangen als marker van vitale cellen met een alternatieve assay voor remming van celgroei, waarbij de incubatietijd van de cellen met de merker korter dan thoed met MTT 30. Een andere factor om te overwegen bij het kiezen van de marker is de mogelijke werkingsmechanisme van het geteste geneesmiddel 27. De MTT-test geeft informatie over mitochondriën metabolische activiteit, en omdat het afhankelijk is van enzymatische reacties, kan worden beïnvloed door remmers.
De combinatie van medicijn preparaat met de beoordeling van de cytotoxiciteit door de MTT-bepaling vertegenwoordigt een effectieve methode voor de ontwikkeling van nieuwe metaal-gebaseerde chemotherapie. Toch is deze methode geen informatie verstrekt over de celdood mechanisme, de fase van de celcyclus die wordt beïnvloed door het geneesmiddel en de mogelijke biologische doelwitten. Daartoe andere methoden, zoals propidiumjodide (PI) Opname Assay en celcyclus analyse worden uitgevoerd 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De financiering werd onder het zevende kaderprogramma van de Europese Gemeenschap (FP7/2007-2013) ontvangen van de European Research Council / ERC Grant overeenkomst geen [239603]
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Hexane AR | Gadot | 830122313 | Dried using a solvent drying system |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38 | |
| Isopropanol AR | Gadot | 830111370 | |
| L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M5655-1G | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | Biological Industries | 03-031-1B | |
| RPMI-1640 with phenol red with L-glutamine | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| RPMI without phenol red | Biological Industries | 01-103-1A | |
| Tetrahydrofuran (THF) AR | Gadot | 830156391 | dried using a solvent drying system |
| Ti(OiPr)4 | Sigma-Aldrich | 205273-500ML | moisture sensitive |
| Trypsin/EDTA | Biological Industries | 03-052-1B | |
| VO(OiPr)3 | Sigma-Aldrich | 404926-10G | moisture sensitive |
| Equipment | |||
| 12-channel pipette 30-300 μl | Thermo Scientific | ||
| 12-channel pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
| 75 cm2 flask | NUNC | 156472 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | NUNC | 167008 | |
| CO2 Incubator | Binder | APT.line C150 | |
| Counter chamber | Marienfeld-Superior | 650030 | |
| Eppendorf vial | KARTELL | ||
| Glove box | M. Braun | ||
| Laminar flow hood | ADS LAMINAIRE | OPTIMALE 12 | |
| Microplate reader spectrophotometer | Bio-Tek | El-800 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse TS100 | |
| Pipette 20-200 μl | Finnpipette | ||
| Pipette 5-50 μl | Finnpipette | ||
References
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
- Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells. Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).
- Wang, D., Lippard, S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).
- Muggia, F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer. Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).
- Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. New trends for metal complexes with anticancer activity. Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).
- Ott, I., Gust, R. Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs. Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).
- Desoize, B. Metals and metal compounds in cancer treatment. Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).
- Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. Antitumour metal compounds: more than theme and variations. Dalton Transactions. , 183-194 (2008).
- Meléndez, E.
- Evangelou, A. M.
- Djordjevic, C.
- Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C.
- Caruso, F., Rossi, M.
- Kostova, I. Titanium and vanadium complexes as anticancer agents. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).
- Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A.
- Buettner, K. M., Valentine, A. M.
- Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species. Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).
- Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis. Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).
- Tzubery, A., Tshuva, E. Y. Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies. Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).
- Tshuva, E. Y., Peri, D. Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis. Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).
- Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands. Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays. Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).
- Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay. Journal of Visualized Experiments. (26), e1191 (2009).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability. Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).
- Alley, M. C., et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research. 48, 589-601 (1988).
- Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. A practical note on the use of cytotoxicity assays. International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).
- Chmura, A. J., et al. Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).
- Yung, W. K. A. In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas. Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).
- McCarthy, N. J., Evan, G. I. Current Topics in Developmental Biology. 36, 259-278 (1997).
