Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية

Published: November 12, 2013 doi: 10.3791/50808
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, Rutgers University
* These authors contributed equally

Summary

هطول فوسفات الكالسيوم هو وسيلة مريحة واقتصادية لترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة. مع التحسين، وأنه من الممكن استخدام هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب بالنقل مثل الخلايا العصبية الأولية. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون cocultured مع الخلايا astroglial.

Abstract

هطول فوسفات الكالسيوم هو وسيلة مريحة واقتصادية لترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة. مع التحسين، وأنه من الممكن استخدام هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب بالنقل مثل الخلايا العصبية الأولية. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون cocultured مع الخلايا astroglial.

Introduction

الخلايا العصبية الأولية هي واحدة من أصعب أنواع الخلايا لبالنقل كما هي تالية للتفتل وحساسة جدا للتغيرات البيئية الصغرى. هناك أربعة أنواع شائعة الاستخدام من أساليب التعبير عن الجينات خارجية والرنا دبوس الشعر القصير (shRNAs) في هذه الخلايا 1. لكل منها مزاياه وعيوبه. على سبيل المثال، عادة ما يتم إجراء التثقيب الكهربائي في الخلايا العصبية معزولة طازجة 2، كما يجب أن يتم نقل الخلايا في cuvettes لترنسفكأيشن. يمكن أن عدوى فيروس عادة تحقيق كفاءة عالية جدا 3، ولكنه أكثر ومحفوفة بالمخاطر بالنسبة للمشغلين كثيفة العمالة. العديد من الكواشف ترنسفكأيشن بوساطة الدهون المتاحة تجاريا، بدرجات متفاوتة من النجاح في الخلايا العصبية ومستويات مختلفة من السمية الخلوية.

ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يمثل طريقة مريحة واقتصادية لإدخال الجينات الغريبة إلى الخلايا العصبية. كان يستخدم الأسلوب الأول لإدخال الحمض النووي اتش سل في الثديياتليرة سورية من قبل غراهام وفان دير إب (1973) 4. تم إجراء ترنسفكأيشن عن طريق خلط كلوريد الكالسيوم مع الحمض النووي المؤتلف في العازلة الفوسفات. وهذا يسمح للتشكيل الفوسفات الحمض النووي / يترسب الكالسيوم والتي، عندما انخفض تدريجيا على أحادي الطبقة من الخلايا، والتمسك سطح الخلية، ويتم تناولها من قبل الإلتقام و اخيرا يدخل في النواة 5. ومن شأن هذه العملية تؤدي إلى التعبير عن الجينات الغريبة التي أدخلت في الخلية المستهدفة. الكفاءة نموذجية من مجموعة فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن بين 0،5-5٪ 6-8. ومع ذلك، مع الحرص على التحسين والتنفيذ المتسق للبروتوكول تجريبي، فمن الممكن للوصول إلى الكفاءة ترنسفكأيشن ما يقرب من 50٪. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون الأولية، التي cocultured مع الخلايا astroglial في شكل شطيرة 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الجرذ نجمية الثقافة للإعلام مشروطة ونجمية الخلايا العصبية Cocultures.

  1. إعداد تشريح العازلة (BSS، انظر الجدول 1 للصفة) وتخزينها في 4 درجات مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
  2. تخدير الفئران الوليدة حديثي الولادة (P0-P2) مع isoflurane وفي كوب 500 مل.
  3. عندما الجراء غير قادرة على الحركة، ورذاذ مع الايثانول 70٪ وقطع رأس.
  4. إزالة الدماغ.
    1. عقد رئيس بحزم مع زوج من ملقط دومون # 5، واستخدام مقص غرامة لجعل شق خط الوسط من خلال الجلد والجمجمة.
    2. فضح الدماغ عن طريق تعكس الجمجمة على الجانبين، وإزالة الدماغ في طبق يحتوي BSS الباردة.
  5. فصل نصفي الكرة المخية من الدماغ البيني وجذع الدماغ تحت نطاق تشريح. إزالة بعناية كل السحايا عن طريق تثبيت الأنسجة مع زوج واحد من ملقط وسحب بلطف بعيدا السحايا مع زوج آخر من الملقط.
  6. جمع كل من نصفي الكرة الأرضية طن واحد 60 مم طبق. باستخدام مقص صغير، وأنسجة اللحم المفروم ناعما كما ممكن. ثم نقل الأنسجة المفروم إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
  7. إضافة 1.5 مل من 1٪ الدناز الأول و1.5 مل من التربسين 2.5٪ و 12 مل من BSS (الحجم الكلي لل15ML) إلى العقول. احتضان في حمام مائي تهتز لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لضمان خلط جيدة، وملتف أنبوب باليد كل 5 دقائق.
  8. نقل طاف من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر على مدى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. إضافة 3 مل FBS لهذا طاف.
  9. إلى القطع المتبقية، إضافة 13.5 مل من BSS و 1.5 مل 2.5٪ التربسين واحتضان بالحمام المائي في الهز لمدة 15 دقيقة أخرى.
  10. نقل طاف المتبقية من خلال مصفاة الخلية وتتحد مع طاف من الخطوة 1.8.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه.
  12. الكريات resuspend في 5 مل من وسائل الإعلام الدبقية. طاف يمكن طرد مرة أخرى لخلايا بيليه المتبقية.
  13. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  14. لوحة سلليرة سورية في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 7 لكل 150 سم 2 القارورة.
  15. تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام الدبقية جديدة بعد اليوم الطلاء. بعد ذلك، وإطعام الخلايا مرتين في الأسبوع مع وسائل الاعلام الدبقية.
  16. عندما وصلت إلى الخلايا> 80٪ confluency (حوالي 10 يوما بعد الطلاء)، وتجميد الخلايا في أسفل 90٪ مصل الحصان و 10٪ DMSO والحفاظ على الاسهم في النيتروجين السائل. يتم تجميد الخلايا في 2 × 10 6 في قارورة. ما يقرب من 5 قوارير يمكن تجميد كل من القارورة.
  17. قبل حوالي 10-14 أيام إقامة ثقافة الحصين، ومطلي الخلايا الدبقية من الأسهم المجمدة. ونحن عادة لوحة خمس 6 لوحات جيدة، وهو ما يكفي لدعم نمو 90 coverslips من الخلايا العصبية قرن آمون (ثلاثة coverslips 15 ملم جولة لكل بئر). ونحن أيضا لوحة إضافية ثمانية إلى عشرة 60 ملم أطباق من الخلايا الدبقية، والذي يستخدم لوسائل الإعلام تكييف N2.1 لترنسفكأيشن. قبل يوم من ثقافة العصبية، ويجب أن تغذى الخلايا مع وسائل الاعلام NB27. يجب أن تكون الخلايا النجمية مثالي> 90٪ متكدسة في الهو النقطة. نجد أن تجميد يقلل كثيرا من عدد من الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافات astroglial. منذ لوحظ زيادة العصبية عندما الخلايا الدبقية الصغيرة موجود في الثقافات astroglial، ونحن دائما استخدام الثقافة astroglial أعدت من الأسهم المجمدة لcoculture مع الخلايا العصبية.

2. العصبية الثقافة

  1. coverslips الزجاج نظيفة قبل الشطف الأولى في milliQ 2X المياه. ثم تنقع في حمض النتريك أنها مركزة لمدة 24 ساعة، وتشطف بالماء milliQ لخمس مرات على الأقل على مدى ما مجموعه 2 ساعة. يتم تجفيفها وتعقيمها بواسطة Coverslips الخبز في الفرن على 225 درجة مئوية لمدة 6 ساعة.
  2. نقل coverslips إلى 60 ملم الأطباق بعد التعقيم. وضع أربعة نقاط من البارافين معقمة بالقرب من الحافة الخارجية من كل ساترة للحفاظ على الخلايا العصبية فصل من الخلايا الدبقية خلال coculture.
  3. coverslips معطف مع 1 ملغ / مل بولي-L-يسين في 0.1 م العازلة بورات بين عشية وضحاها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  4. في اليوم التالي، وشطف coverslips مرتين في م العقيمةilliQ الماء لمدة 15 دقيقة على الأقل لكل منهما. ثم يتم تحضين أنها بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام الطلاء في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  5. الموت ببطء الفئران الحوامل (E18) من خلال التخدير isoflurane وتليها استرواح الصدر، والموت ببطء الفئران الجنينية بواسطة قطع الرأس. إزالة العقول وتشريح من نصفي الكرة المخية كما هو موضح أعلاه.
  6. تشريح خارج الحصين من نصف الكرة المخية. إخضاع جميع الحصين في أنبوب 15 مل المخروطية، وهضم مع التربسين 0.25٪ (0.5 مل 2.5٪ التربسين، 4.5 مل BSS) في 37 ℃ لمدة 15 دقيقة.
  7. يتم شطف الحصين هضمها في BSS 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم يتم المسحوقة أنها مع ماصة باستير الزجاج، ويتم تحديد كثافة الخلية باستخدام عدادة الكريات. ثم يتم المصنفة الخلايا العصبية في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلايا لكل 60 مم طبق.
  8. حوالي 2-4 ساعة بعد الطلاء، ونقل coverslips مع الخلايا العصبية التي تعلق على الأطباق التي تحتوي على الخلايا astroglial، مع الخلايا العصبية لأسفل نحو الدبقية. في DIV3، إضافة إلى السيتوزين الأرابينوزيدالخلايا في تركيز النهائي من 5 ميكرومتر لوقف انتشار الخلايا الدبقية.

3. ترنسفكأيشن الكالسيوم

  1. وسائل الإعلام حالة N2.1 على الدبقية اليوم قبل ترنسفكأيشن.
  2. في يوم من ترنسفكأيشن، واتخاذ وسائل الإعلام مكيفة N2.1 الخروج من الدبقية ونقل إلى طبق جديد. نقل coverslips مع الخلايا العصبية في وسائل الإعلام N2.1 مكيفة. دعونا تتوازن في الحاضنة لمدة 10-30 دقيقة.
  3. لمجموعة واحدة من أنابيب معقمة، والجمع بين 1-4 ميكروغرام من الحمض النووي، 12.5 ميكرولتر من 2 M و CaCl 2، وH 2 O معقمة لحجم ما مجموعه 100 ميكرولتر. لمجموعة الثانية من الأنابيب، إضافة 100 ميكرولتر من 2X HBS.
  4. إضافة حجم ⅛ من 2X HBS (12.5 ميكرولتر) في وقت لأنبوب يحتوي على خليط و CaCl 2 / DNA، vortexing للبضع ثوان في كل مرة. السماح للأنابيب على الجلوس لمدة 15 دقيقة.
  5. بعد 15 دقيقة الحضانة، إضافة قطرة قطرة الخليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا. احتضان لمدة 1-1.5 ساعة. هناك طبقة من الرواسب مثل الرمل يجب أن تكون مرئيةتحت المجهر باستخدام الهدف 10X.
  6. بعد الحضانة، وشطف مرتين مع coverslips الحارة HBS غسل العازلة.
  7. العودة coverslips إلى أطباق الأصلي مع الدبقية، إضافة حمض kynurenic إلى تركيز النهائي من 0.5 ملم.
  8. الخلايا العصبية Transfected يمكن تصوير الحية أو المجهزة للكيمياء سيتولوجية مناعية في وقت مبكر من اليوم التالي. يمكن البقاء على قيد الحياة الخلايا العصبية تصل إلى ثلاثة أسابيع بعد ترنسفكأيشن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما يتم تحسين المعلمات مختلفة من ترنسفكأيشن وبعناية للرقابة من تجربة إلى تجربة، فمن الممكن الحصول على الكفاءات ترنسفكأيشن تصل إلى 50٪. الشكل 1 يبين حقل من الخلايا العصبية التي يتم transfected مع GFP على DIV4. يحتوي على حقل ما مجموعه 28 الخلايا العصبية، ومنها و transfected 16. هذا يمثل كفاءة أكثر من 50٪. وأخذ العينات من الحقول الأخرى في نفس ساترة يبين الكفاءة الكلية حوالي 50٪ (لا تظهر البيانات). مع نظام coculture astroglial، تبقى الخلايا العصبية سليمة وتتطور بشكل طبيعي بعد ترنسفكأيشن. الشكل 2 يوضح الخلايا العصبية قرن آمون في DIV15، وبعد 10 يوما ترنسفكأيشن مع بناء PSD-95-GFP. وقد وضعت العديد من الخلايا العصبية على شكل فطر العمود الفقري شجيري ناضجة، مما يدل على الخلايا العصبية في صحة جيدة. كفاءة عالية ترنسفكأيشن والحد الأدنى من سمية هذا البروتوكول يجعلها أداة قيمة لدراسة وظائف الجينات في فرس النهر الرئيسيالخلايا العصبية campal. أخيرا، يمكن أن يحتمل هذا البروتوكول أن تتكيف مع الثقافات بالنقل من أنواع أخرى من الخلايا العصبية في الدماغ، فضلا عن غيرها من أنواع الخلايا التي يصعب بالنقل.

الشكل 1
الشكل 1. الخلايا العصبية الحصين transfected مع GFP في DIV4، والتي تبين ارتفاع كفاءة ترنسفكأيشن 16 من 28 الخلايا العصبية في مجال إيجابية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. الخلايا العصبية قرن آمون transfected مع مديرية الأمن العام-95-GFP في DIV15، والتي تبين العديد من فطر على شكل العمود الفقري شجيري ناضجة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الجدول 1. العازلة / وصفات وسائل الإعلام.

كاشف مكونات
الدبقية وسائل الإعلام 425 مل MEM
5 مل GlutaMAX
5 مل البيروفات الصوديوم، و 100 ملي
15 مل 20٪ غلوكوز
25 مل FBS (5٪ النهائي)
المصل 25 مل العجل (النهائي 5٪)
5 مل البنسلين / الستربتوميسين
0.1M بورات العازلة 2.48 غ حمض البوريك
3.9 ز بورات الصوديوم (البوراكس)
800 مل milliQ H2O
درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 8.5
فلتر تعقيم
الطلاء وسائل الإعلام 425 مل MEM
5 مل GlutaMAX
5 مل البيروفات الصوديوم، و 100 ملي
15 مل 20٪ زlucose
50 مل FBS
NB27 وسائل الإعلام 485 مل Neurobasal وسائل الإعلام
5 مل GlutaMAX
2 مل B27 تكملة (50X)
تشريح العازلة (BSS) 50 مل 10X HBSS
5 مل 1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.3
5 مل البنسلين / الستربتوميسين
440 مل H 2 O
N2.1 وسائل الإعلام 425 مل MEM
5 مل GlutaMAX
5 مل البيروفات الصوديوم، و 100 ملي
15 مل 20٪ غلوكوز
50 مل ألبومين البيض، 1٪ في MEM
5 مل تكملة N2
2X HEPES مخزنة المالحة (HBS)، عقيمة 274 ملي مول كلوريد الصوديوم
9.5 ملي بوكل
15 ملي الجلوكوز
42 ملي HEPES
1.4 ملي نا 2 هبو 4
إعداد دفعات من 3 درجة الحموضة مختلفة (7.05، 7.10، 7.15)
غسل العازلة (HEPES مخزنة المالحة) 50 مل 10X HBSS
5 مل 1 M HEPES، ودرجة الحموضة 7.3
445 مل H 2 O
50 ملي Kynurenic حمض حل 0.473 غرام من حمض kynurenic في برنامج تلفزيوني 1X. إضافة قطرات من هيدروكسيد الصوديوم للحصول عليه في الحل. ثم استخدام حمض الهيدروكلوريك لضبط درجة الحموضة إلى 7.0

الجدول 2. خط الزمن لإعداد الثقافة.

يوم عمل
قبل البدء إعداد نجمية الثقافة وتجميد الخلايا إلى أسفل. واحدة دفعة من الثقافة نجمية يمكن أن تدعم عادة عدة أشهر من الثقافات الحصين.
الأسبوع 1 الاثنين ذوبان الجليد الخلايا النجمية.
الأسبوع 1 الثلاثاء تغذية الخلايا النجمية.
الأسبوع 1 الجمعه تغذية الخلايا النجمية.
الأسبوع 2 الأثنين تغذية الخلايا النجمية. شطف coverslips في H 2 O، ثم نقع في حامض النيتريك لمدة 24 ساعة.
الأسبوع 2 الثلاثاء رينحد ذاتها coverslips 5X. تعقيم coverslips الجافة.
الأسبوع 2 الأربعاء وضع النقاط البارافين coverslips على. معطف coverslips مع بولي-L-يسين.
الأسبوع الخميس 2 شطف coverslips المغلفة في H2O معقمة، ثم احتضان coverslips في الطلاء وسائل الإعلام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. تغيير وسائل الإعلام على الخلايا النجمية لNB27.
أسبوع 2 الجمعة تشريح الحصين والطلاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك العديد من المعايير الأساسية التي يجب أن تسيطر عليها بعناية لtransfections ناجحة على الدوام 10،11. المعلمة الأكثر أهمية بالنسبة لترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم هي قيمة الرقم الهيدروجيني لل2X HBS، والتي تختلف في أيدينا عادة ما بين 7،10-7،15. نوصي جعل ثلاث دفعات من الأسهم مع قيم درجة الحموضة في 0.05 زيادات لحساب الفرق بين درجة الحموضة متر. بدلا من ذلك، يوفر Clontech عدة ترنسفكأيشن الثدييات 2X HBS أن ينتج باستمرار كفاءة جيدة. نضع في اعتبارنا أن الرقم الهيدروجيني من الحل سوف تتغير مع مرور الوقت، حتى عند تخزينها في الثلاجة. علينا أن نحافظ عموما مأخوذة من 2X HBS في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد، وعند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة سنة واحدة.

المعلمة الثانية هو الرقم الهيدروجيني للثقافة المتوسط. للحفاظ على هذا تتفق والمتوسطة N2.1 هي مشروطة بشكل روتيني على الثقافات astroglial بين عشية وضحاها ولكن ليس أكثر من 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نحاول استخدام الثقافات astroglial عشرهي في مماثلة في confluency. استخدام وسائل الإعلام مكيفة الدبقية يساعد أيضا تقليل سمية للخلايا العصبية أثناء ترنسفكأيشن. يتم معايرتها وسائل الإعلام مكيفة في الحاضنة قبل ترنسفكأيشن للحفاظ على درجة الحموضة متسقة.

حجم وكثافة رواسب الفوسفات الكالسيوم هو المفتاح لترنسفكأيشن ناجحة. سوف رواسب صغيرة تؤدي إلى انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن، في حين كبيرة، رواسب ملتف عادة ما تؤدي إلى سمية الخلايا 10. لضمان تشكيل راسب الفوسفات الكالسيوم متسقة، ونحن نستخدم vortexing لالمتقطع عند خلط الحمض النووي / و CaCl 2 و 2x HBS 11. آخر طريقة تستخدم عادة لخلط من خلال تهب فقاعات الهواء باستخدام ماصة باستور 12. وقد وجدنا في vortexing لفترات متقطعة لانتاج تشكيل راسب أكثر اتساقا، وخاصة بالنسبة للكميات صغيرة من خليط ترنسفكأيشن.

وتشمل المتغيرات الأخرى للنظر في نوعية الحمض النووي، وعمر العصبيةنانوثانية. نجد أن ترنسفكأيشن بدء العمل باستمرار عندما تصل الخلايا العصبية DIV2، ومع ذلك، يبدأ في الانخفاض كفاءة الخلايا العصبية عندما تتجاوز DIV10. أخيرا، صحة الثقافات العصبية أنفسهم يمثل المعلمة هامة أخرى. نجد استخدام نظام coculture ليكون أفضل وسيلة لتوليد الثقافات الحصين الابتدائية صحية. إذا كانت الخلايا العصبية ليست صحية، فإنها لن البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة بعد ترنسفكأيشن. مع نظام coculture، يمكن أن الخلايا العصبية منخفض الكثافة البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 3 أسابيع بعد ترنسفكأيشن، مما يسهل دراسات على المدى الطويل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المهتمة.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS065183 وأموال بدء من كلية روتجرز روبرت وود جونسون الطبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-20
Fine scissors Fine Science Tools 14090-09 straight / sharp 8.5 cm
Vannas-Tubinger spring scissors Fine Science Tools 15008-08 angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-16
Student surgical scissors Fine Science Tools 91401-14 blunt / 14.5 cm
Spring scissors Fine Science Tools 15006-09 angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge
Isoflurane Webster Veterinary 14043-225-06
Poly-L-lysine Sigma P2636
MEM Sigma M2279
100 mM Sodium pyruvate Sigma S8636
Glucose Sigma G8270
10x HBSS Sigma H4385
1 M HEPES, pH 7.3 Gibco/Invitrogen 15630-080
GlutaMAX Gibco/Invitrogen 35050-061
Neurobasal Media Gibco/Invitrogen 21130-049
B27 Supplement (50x) Gibco/Invitrogen 17504-044
N2 Supplement Gibco/Invitrogen 17502-048
Ovalbumin Sigma A5503
Penicillin/Streptomycin Gibco/Invitrogen 15070-063
2.5% Trypsin Gibco/Invitrogen 15090-046
DNase I Sigma DN-25
Cytosine arabinoside Calbiochem/EMD Millipore 251010
Kynurenic acid Sigma K3375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
  2. Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
  3. Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
  4. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  5. Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  6. Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
  7. Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
  8. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
  9. Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
  10. Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
  11. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
  12. Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).

Tags

علم الأعصاب، العدد 81، الخلايا العصبية قرن آمون الابتدائية والكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن، Coculture، وخلايا astroglial، الحمض النووي
الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, M., Bernard, L. P., DiBona, V.… More

Sun, M., Bernard, L. P., DiBona, V. L., Wu, Q., Zhang, H. Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (81), e50808, doi:10.3791/50808 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter