Summary
Kalsiyum fosfat çökeltme kültürlenmiş hücrelerin transfeksiyonu için uygun ve ekonomik bir yöntemdir. Optimizasyonu ile, primer nöronlar gibi sert-transfect hücreleri üzerinde bu yöntemi kullanmak mümkündür. Burada astroglial hücreleri ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu için, detaylı bir protokol açıklar.
Abstract
Kalsiyum fosfat çökeltme kültürlenmiş hücrelerin transfeksiyonu için uygun ve ekonomik bir yöntemdir. Optimizasyonu ile, primer nöronlar gibi sert-transfect hücreleri üzerinde bu yöntemi kullanmak mümkündür. Burada astroglial hücreleri ile kültürlenmiş hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu için, detaylı bir protokol açıklar.
Introduction
Birincil nöronlar postmitotic ve mikro çevre değişikliklerine karşı çok hassas olarak transfekte etmek zor hücre türlerinden biridir. Bu hücrelerde 1 ekzojen genlerin ve kısa saç tokası RNA (shRNAs) ekspresyonu için yöntemler yaygın olarak kullanılan dört tipi vardır. Her biri kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır. Transfeksiyon için hücreler, küvetler içine transfer edilmelidir Örneğin, elektroporasyon, genellikle taze olarak izole edilen nöronlar 2 üzerinde gerçekleştirilir. Virüs enfeksiyonu genellikle çok yüksek verim 3 ulaşmak, ancak daha fazla emek-yoğun operatörler için ve riskli olabilir. Birçok lipid-aracılı transfeksiyon reaktifleri nöronlar ve sitotoksisite farklı düzeylerde başarı değişen derecelerde, ticari olarak temin edilebilir.
Kalsiyum fosfat transfeksiyonu, nöronlar içinde yabancı genlerin sokulması için uygun ve ekonomik bir yöntemi temsil eder. Yöntem, ilk memeli hücre içine adenovirüs DNA'nın katılması için kullanılmıştırGraham ve Van Der Eb (1973) tarafından ls 4. Transfeksiyon, bir fosfat tampon maddesi içinde rekombinant DNA ile kalsiyum klorür karıştırılarak gerçekleştirilmiştir. Bu, yavaş yavaş hücrelerin bir mono-tabakası üzerinde ayrıştırılarak DNA / kalsiyum fosfat oluşumu, hücre yüzeyine bağlı, endositoz ile içeri alınır ve son olarak da çekirdek 5 girmektedir, ki çökelir sağlar. Bu işlem, hedef hücre içine yabancı genlerin ekspresyonuna sebep olur. 0.5-5% 6-8 arasında, kalsiyum fosfat transfeksiyonu aralık tipik verimleri. Bununla birlikte, dikkatli bir optimizasyon ve deneysel protokol sürekli uygulama ile, hemen hemen% 50 bir transfeksiyon verimine ulaşmak mümkündür. Burada bir sandviç biçiminde 9 astroglial hücreleri ile kültürlenmiş primer hipokampal nöronlar, kalsiyum fosfat transfeksiyonu için, detaylı bir protokol açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Koúullanmıú Medya ve Astrosit-nöron cocultures Rat Astrosit Kültür hazırlanıyor.
- (BSS tarifi için bakınız Tablo 1) diseksiyonu tampon hazırlayın ve 4 ° C'de mağaza kullanıma hazır olana kadar.
- 500 ml beher izofluran ile yenidoğan sıçan yavrular (P0-P2) anestezisi.
- Yavrular hareketsiz olduğunda,% 70 etanol ile sprey ve başını kesmek.
- Beyin kaldırmak.
- Dumont # 5 forseps bir çift ile sıkıca kafa tutun, ve deri ve kafatası yoluyla bir orta hat kesi yapmak için ince makas kullanın.
- Yanlara kafatası yansıtarak beyin Açığa ve soğuk BSS içeren bir çanak içine beyin kaldırmak.
- Diseksiyon kapsamında diensefalon ve beyin sapından hemisferdeki ayırın. Dikkatle forseps bir çift doku stabilize ve yavaşça forseps başka bir çift ile meninks uzağa çekerek tüm meninksler kaldırmak.
- Tüm hemisferlerdir toplayın in bir 60 mm çanak. Küçük bir makas, kıyma doku gibi ince mümkün olduğunca kullanma. Daha sonra, 50 ml konik tüp kıyılmış doku aktarın.
- 1,5 1% DNase I'in ml ve 1.5 ml% 2.5 tripsin ve beyin BSS (15 ml toplam hacim) 12 ml ilave edilir. 37 ° C'de 15 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosu içinde inkübe Iyi karışmasını sağlamak için, tüp elle her 5 dakikada girdaplanır.
- Yeni bir 50 ml konik tüp üzerinde 70 mikron hücre süzgecinden süpernatant aktarın. Bu yüzer 3 ml FBS ekleyin.
- Kalan parçalar için, BSS 13.5 ml ve 1.5 ml% 2.5 tripsin ekleyin ve 15 dakika boyunca çalkalama su banyosu içinde inkübe edilir.
- Hücre süzgecinden kalan süpernatan aktarın ve Aşama 1.8 'den süpernatan ile birleştirir.
- Pelet hücreleri 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj.
- Glial ortam 5 ml içinde süspanse peletler. Üst faz, geri kalan hücreler pellet haline getirmek için tekrar santrifüj edilebilir.
- Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Plaka cel1 x 10 7 cm başına 150 2 şişesi yoğunluğunda ls.
- Gün sonra kaplama taze glial medya medya değiştirin. Daha sonra, glial ortamı ile iki kez bir hafta hücreleri besleme.
- Hücreler>% 80 ortak akışkanlığa (yaklaşık 10 gün sonra kaplama) ulaştığı zaman,% 90 at serumu ve% 10 DMSO içinde hücrelerini dondurma ve sıvı azot içinde stok tutmak. Hücreler 2 flakon başına x 10 6 dondurulur. Yaklaşık olarak 5 şişeler her şişeden dondurulabilir.
- Yaklaşık 10-14 gün hipokampal kültürünü kurmadan önce, glial hücreler dondurulmuş stoklardan kaplanmıştır. Biz genellikle hipokampalinden 90 lamelleri (kuyu başına üç 15 mm yuvarlak lamelleri) büyümesini destekleyecek kadar beş 6-iyi plakaları, plaka. Ayrıca, transfeksiyon için klima N2.1 ortamı için kullanılır glial hücreler ek bir sekiz ila on 60 mm yemekler, plaka. Bir gün önce kültür nöronal hücreler, NB27 ortam ile beslenmelidir. Astrocytes ideal th de>% 90 birleşen olmalıdırnoktasıdır. Bu büyük ölçüde dondurma astroglial kültürlerde mikroglia sayısını azaltır bulabilirsiniz. Mikroglia Astroglial kültürlerde mevcut olduğunda artan nörotoksisite görülmektedir yana, biz her zaman nöronlar ile kokültür için dondurulmuş stokları hazırlanan Astroglial kültür kullanın.
2. Nöron Kültürü
- MilliQ su 2x ilk durulayarak temizleyin cam lamelleri. Daha sonra, 2 saatlik bir toplam değerin en az beş kez 24 saat için konsantre nitrik asit ile ıslatılmış ve milliQ su ile durulanır. Lameller, 6 saat boyunca 225 ° C'de bir fırın içinde pişirme ile kurutuldu ve sterilize edilir.
- Transferi sterilizasyonu sonrasında 60 mm yemekleri lamelleri. Nöronlar kokültür sırasında glial hücrelerden ayrı tutmak için her lamel dış kenarına yakın steril parafin dört nokta yerleştirin.
- 37 ° C inkübatör içinde bir gece boyunca 0.1 M borat tamponu / ml poli-L-lisin, 1 mg ile kaplayın lamelleri.
- Ertesi gün, iki kez steril m lamelleri durulamaen az 15 dakika her biri için illiQ su. Daha sonra 37 ° C kuluçka makinesi içinde kaplama ortam içinde gece boyunca inkübe edilir.
- Pnömotoraks ardından izofluran anestezi ile gebe sıçan (E18) Euthanize ve başı kesilerek embriyonik sıçan euthanize. Beyin çıkarın ve yukarıda tarif edildiği gibi serebral hemisfer teşrih.
- Serebral yarımkürede hippocampi parçalara ayır. 15 ml konik bir tüp içine tüm hipokampları yerleştirin ve 15 dakika için 37 ℃ da% 0.25 tripsin (0.5 ml% 2.5 tripsin, 4.5 ml BSS) ile sindirmek.
- Sindirilen hipokampi 5 dakika her biri için BSS 3x durulanır. Daha sonra, bir cam Pasteur pipeti ile tritüre edilir ve hücre yoğunluğu, bir hemositometre kullanılarak belirlenir. Nöronlar, daha sonra 60 mm tabak başına 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda tohumlanır.
- Yaklaşık 2-4 saat sonra kaplama, transfer nöronlar glia doğru aşağı bakacak şekilde, Astroglial hücreleri içeren yemekleri bağlı nöronlar ile lamelleri. DIV3 anda, için sitozin arabinosid ekle5 uM bir nihai konsantrasyonda hücre glia çoğalmasını durdurmak.
3. Kalsiyum Transfection
- Gliadaki transfeksiyondan önce günde Durumu N2.1 medya.
- Transfeksiyon gününde, glia kapalı durumunu N2.1 ortamı almak ve yeni bir çanak içine aktarın. Transferi klimalı N2.1 medya içine nöronlar ile lamelleri. 10-30 dakika boyunca kuluçka makinesi içinde dengeye olsun.
- Steril tüplere bir set için, 1-4 ug DNA, 100 ul toplam hacim için 2 M CaCI2 12.5 ul, ve steril H2O birleştirir. Tüpler bir ikinci dizi için, 2 x 100 ul HBS ekleyin.
- Bir kaç saniye için her girdap, CaCl2 / DNA karışımını ihtiva eden bir tüp, bir seferde 2x HBS'de ⅛ hacmi (12.5 ul) ilave edin. Tüpler 15 dakika boyunca bekletin.
- 15 dakika inkübasyondan sonra, hücrelere transfeksiyon karışımı damla damla ilave edildi. 1-1.5 saat boyunca inkübe edin. Kum gibi çökeltilerin tabakası görünür olmalıdır10X objektif kullanılarak mikroskop altında.
- İnkübasyondan sonra, sıcak HBS yıkama tamponu ile iki defa lamelleri yıkayın.
- , Glia orijinal yemeklere lamelleri Dönüş 0.5 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar Kynurenic asit ekleyin.
- Transfekte nöronların canlı görüntüsü ya da erken ertesi gün olarak İmmünositokimya için işlenebilir. Nöronlar transfeksiyonundan sonra üç hafta kadar yaşayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transfeksiyon, farklı parametreler optimize edilmiş ve dikkatli bir deney için deney kumanda edilir, bu% 50'ye kadar bir transfeksiyon verimi elde etmek mümkündür. 1 Div4 üzerine GFP ile transfekte edilir nöronların bir alanı göstermektedir. Bu alan 16 transfekte edilmiştir, bunlar arasında 28 nöron, bir toplam içerir. Bu% 50'in üzerinde bir verimlilik gösterir. Aynı lamel başka alanların bir örnekleme genel verimlilik (veriler gösterilmemiştir), yaklaşık 50% olduğu gösterir. Astroglial kokültürü sistemi ile, nöronlar sağlıklı kalır ve transfeksiyonundan sonra normal olarak gelişir. 2 10 gün PSD-95-GFP yapı ile transfeksiyondan sonra, DIV15 bir hipokampal nöron göstermektedir. Nöron nöronlar sağlıklı gösterir, çok sayıda olgun mantar şeklinde dendritik dikenler geliştirmiştir. Yüksek transfeksiyon verimliliği ve bu protokolün minimal toksisite birincil suaygırı gen fonksiyonlarını incelemek için değerli bir araç yaparCampal nöronlar. Son olarak, bu protokol, potansiyel olarak, beyindeki sinir hücrelerinin diğer türlerine kültürleri, hem de diğer zor transfekte hücre tipleri transfekte edilmesi için adapte edilebilir.
Şekil 1.. Hipokampus nöronlar alanında 28 nöronların yüksek dışarı transfeksiyon verimlilik. 16. olumlu göstererek, Div4 GFP ile transfekte. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. PSD ile transfekte hipokampal nöron-95-GFP çok sayıda olgun mantar şeklinde dendritik dikenler gösteren DIV15 de,. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Tablo 1. Tampon / Medya Tarifler.
| Reaktif | Bileşenleri |
| Glial Medya | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml sodyum piruvat, 100 mM 15 ml% 20 glukoz 25 ml FBS (son% 5) 25 ml buzağı serumu (son% 5) 5 ml Penisilin / Streptomisin |
| 0.1 M Borat Tampon | 2.48 g borik asit 3.9 g sodyum tetraborat (boraks) 800 ml H2O milliQ 8.5 NaOH ile pH sterilize |
| Kaplama Medya | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml sodyum piruvat, 100 mM 15 ml% 20 glucose 50 ml FBS |
| NB27 Medya | 485 ml Neurobasal Media 5 ml GlutaMAX 2 ml B27 takviyesi (50x) |
| Diseksiyon Tampon (BSS) | 50 ml HBSS 10x 5 ml 1 M HEPES, pH 7.3 5 ml Penisilin / Streptomisin 440 ml H2O |
| N2.1 Medya | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml sodyum piruvat, 100 mM 15 ml% 20 glukoz MEM içinde 50 ml ovalbumin,% 1 5 ml N2 takviyesi |
| 2 x HEPES tamponlu tuz (HBS) steril | 274 mM NaCl 9.5 mM KCI 15 mM glukoz 42 mM HEPES 1.4 mM Na 2 HPO 4 3 farklı pH (7.05, 7.10, 7.15) toplu halde hazırlayın |
| Yıkama Tamponu (HEPES Tamponlu Tuzu) | 50 ml HBSS 10x 5 ml 1 M HEPES, pH 7.3 445 ml H2O |
| 50 mM Kynurenic asit | 1x PBS Kynurenic asit 0.473 g çözülür. Çözeltisi içine almak için NaOH damla ekleyin. Daha sonra pH 7.0 'a geri ayarlamak için HCI kullanımı |
Tablo 2. Kültür hazırlanması için zaman çizgisi.
| Gün | Eylem |
| Başlamadan önce | Astrocyte kültürünü hazırlayın ve hücreleri aşağı dondurma. Astrosit kültürünün bir grup genellikle hipokampal kültürlerin birkaç ay destekleyebilir. |
| 1. Hafta Pazartesi | Astrositleri çözülme. |
| Hafta 1 Salı | Astrositleri besleyin. |
| Hafta 1 Cuma | Astrositleri besleyin. |
| Hafta 2 Pazartesi | Astrositleri besleyin. Daha sonra 24 saat boyunca nitrik asit emmek H, 2 O lamelleri durulayın. |
| Hafta 2 Salı | Rinse 5x lamelleri. Kuru lamelleri sterilize. |
| Hafta 2 Çarşamba | Lamelleri parafin noktalar yerleştirin. Coat poli-L-lizin ile lamelleri. |
| Hafta 2 Perşembe | Steril H2O kaplı lamelleri durulayın, sonra 37 ° C de bir gece ortam kaplama lamelleri inkübe NB27 için astrositlerden üzerine medya değiştirin. |
| Hafta 2 Cuma | Hipokampal diseksiyon ve kaplama. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dikkatle sürekli başarılı transfections 10,11 için kontrol edilmesi gereken birkaç önemli parametre vardır. Kalsiyum fosfat transfeksiyonu için en önemli parametre bizim elimizde genellikle 7,10-7,15 arasında değişmektedir 2x HBS, pH değeridir. Biz pH metre arasındaki farkı açıklamak için 0.05 artışlarla pH değerleri ile hisse senetleri üç toplu yapmanızı öneririz. Seçenek olarak ise, Clontech memeli transfeksiyon kiti sürekli iyi bir verim elde edilir 2x HBS sağlar. Dondurucuda saklanan bile çözeltinin pH değeri, zaman içinde değişecektir göz önünde bulundurun. Genellikle en fazla bir ay boyunca 4 ° C 'de 2 x HBS'de hacimde tutmak ve bir yıla kadar -20 ° C' de.
İkinci parametre kültür ortamının pH'ı. Bu tutarlı, N2.1 orta tutmak için rutin bir gecede değil, daha 24 saat Astroglial kültürler üzerinde koşuluna bağlıdır. Buna ek olarak, biz Astroglial kültürleri inci kullanmayı deneyinat konfluansa benzerdir. Glia-işlemi görmüş ortam kullanılması da transfeksiyondan sırasında nöron toksisitesini azaltır. Transfeksiyon tutarlı pH'ın tutmak için önce Koşullu ortam inkübatör içinde dengelenmiş edilir.
Kalsiyum fosfat çökeltileri boyutu ve yoğunluğu başarılı transfeksiyon anahtarıdır. Büyük, clumpy çökeltiler genellikle sitotoksisite 10 yol ise küçük çökeltiler, düşük transfeksiyon verimi yol açacaktır. DNA / CaCl 2 ve 2 x 11 HBS karıştırırken tutarlı kalsiyum fosfat çökelti oluşmasını sağlamak için, aralıklı vorteks kullanın. Karıştırma için başka sık kullanılan yöntem, bir Pasteur pipeti 12 kullanarak hava kabarcıkları üfleme geçer. Özellikle transfeksiyon karışımı küçük hacimlerde, daha tutarlı bir çökelti oluşumu vermek üzere aralıklı vorteks bulduk.
Dikkate diğer değişkenler DNA'nın kalitesi ve nöro yaşı;ns. Biz transfeksiyon nöronlar div2 ulaştığınızda sürekli çalışmaya başlamak bulmak, ancak verimlilik nöronlar DIV10 ötesinde zaman azalmaya başlar. Son olarak, nöronal kültürler kendilerini sağlık önemli bir parametreyi temsil eder. Biz kokültürü sisteminin kullanımı sağlıklı primer hipokampal kültürlerini oluşturmak için en iyi yol olarak görüyorum. Nöronlar sağlıklı değilse, bunlar uzun transfeksiyonundan sonra hayatta olmaz. Kokültürü sistemi ile, düşük yoğunluklu nöronlar uzun vadeli çalışmalar kolaylaştırır, geçiştirme, sonra 3 hafta boyunca yaşayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ilgi çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe NS065183 ve Rutgers Robert Wood Johnson Tıp Okulu'nda start-up fonları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
