Summary
Calciumphosphatpræcipitation er en praktisk og økonomisk fremgangsmåde til transfektion af dyrkede celler. Med optimering, er det muligt at anvende denne metode på svære at transficere celler som primære neuroner. Her beskriver vi vores detaljerede protokol for caiciumphosphattransfektion af hippocampus neuroner dyrket sammen med astrogliale celler.
Abstract
Calciumphosphatpræcipitation er en praktisk og økonomisk fremgangsmåde til transfektion af dyrkede celler. Med optimering, er det muligt at anvende denne metode på svære at transficere celler som primære neuroner. Her beskriver vi vores detaljerede protokol for caiciumphosphattransfektion af hippocampus neuroner dyrket sammen med astrogliale celler.
Introduction
Primære neuroner er en af de sværeste celletyper til transfektion, som de er postmitotiske og er meget følsomme over for mikro-miljø ændringer. Der er fire almindeligt anvendte typer af fremgangsmåder til ekspression af eksogene gener og short hairpin RNA (shRNAs) i disse celler 1. Hver har sine egne fordele og ulemper. For eksempel er elektroporering normalt udføres på frisk isolerede neuroner 2, som celler skal overføres til kuvetter til transfektion. Virus infektion kan normalt opnå en meget høj effektivitet 3, men er mere arbejdskrævende og risikabelt for operatører. Mange lipidmedieret transfektionsreagenser er kommercielt tilgængelige, med varierende grader af succes i neuroner og forskellige niveauer af cytotoksicitet.
Calciumphosphat-transfektion udgør en praktisk og økonomisk fremgangsmåde til indføring af fremmede gener i neuroner. Fremgangsmåden blev først anvendt til at indføre adenovirus DNA i mammale cells af Graham og Van Der Eb (1973) 4.. Transfektion blev udført ved at blande calciumchlorid med rekombinant DNA i en phosphatpuffer. Dette tillader dannelsen af DNA / calciumphosphatudfældninger som, når efterhånden faldt på et monolag af celler, holde sig til celleoverfladen, bliver taget op ved endocytose og endelig indtaste kernen 5.. Denne proces vil føre til ekspression af indførte fremmede gener i målcellen. Typiske effektiviteten af calciumphosphat-transfektion på mellem 0,5-5% 6-8. Men med omhyggelig optimering og konsekvent gennemførelse af forsøgsprotokollen, er det muligt at opnå en transfektionseffektivitet på næsten 50%. Her beskriver vi vores detaljerede protokol for caiciumphosphattransfektion af primære hippocampus neuroner, der er dyrket sammen med astrogliale celler i en sandwich-format 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse Rat astrocyte kultur for konditionerede medier og astrocyt-neuron cokulturer.
- Forbered dissektion buffer (BSS, se tabel 1 for opskrift) og opbevares ved 4 ° C, indtil klar til brug.
- Bedøver neonatale rotteunger (P0-P2) med isofluran i et 500 ml bægerglas.
- Når hvalpene er immobile, spray med 70% ethanol og halshugge.
- Fjern hjerne.
- Hold hoved fast med et par Dumont # 5 pincet og anvende fine sakse til at gøre en midtlinjeincision gennem huden og kraniet.
- Expose hjernen ved at reflektere kraniet til siderne, og fjern hjernen i en skål indeholdende kold BSS.
- Adskil de cerebrale hemisfærer fra diencephalon og hjernestammen under et dissektionsmikroskop. Fjern omhyggeligt alle meninges ved at stabilisere vævet med et par pincet og forsigtigt trække væk meninges med et andet par pincet.
- Saml alle halvkugler in en 60 mm skål. Brug en lille saks, hakkekød væv så fint som muligt. Derefter overføres det hakkede væv til en 50 ml konisk rør.
- Tilføj 1,5 ml 1% DNase I og 1,5 ml 2,5% trypsin og 12 ml BSS (samlet volumen på 15 ml) hjerner. Inkuberes i et rystevandbad i 15 minutter ved 37 ° C. For at sikre en god blanding, er rør hvirvlet ved hånden hver 5 min.
- Overfør supernatanten gennem et 70 um cellefilter over en ny 50 ml konisk rør. Tilsæt 3 ml FBS til denne supernatant.
- Til de resterende stykker, tilsættes 13,5 ml BSS og 1,5 ml 2,5% trypsin og inkuberes i rystevandbad i yderligere 15 minutter.
- Overfør den resterende supernatant gennem cellefilter og kombinere med supernatanten fra trin 1.8.
- Centrifuger ved 1000 RPM i 5 minutter for at pelletere cellerne.
- Resuspender pellets i 5 ml gliale medier. Supernatant centrifugeres igen for at pelletere de resterende celler.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer.
- Plate cells med en tæthed på 1 x 10 7 pr 150 cm2 kolbe.
- Skift medier til frisk glial medier dagen efter galvanisering. Bagefter foder cellerne to gange om ugen med glial medier.
- Når cellerne har nået> 80% konfluens (ca. 10 dage efter udpladning), fryse-celler i 90% hesteserum og 10% DMSO og holde lagrene i flydende nitrogen. Celler fryses ved 2 x 10 6 per hætteglas. Ca. 5 hætteglas kan fryses fra hver kolbe.
- Omkring 10-14 dage før opsætning af hippocampus kultur, er gliaceller forgyldt fra de frosne lagre. Vi plejer pladen fem 6-brønds plader, hvilket er nok til at understøtte væksten af 90 dækglas af hippocampus neuroner (tre 15 mm runde dækglas per brønd). Vi plade også yderligere otte til ti 60 mm retter af gliaceller, som bruges til konditionering N2.1 medier til transfektion. Dagen før neuronal kultur bør celler fodres med NB27 medier. Astrocytterne bør ideelt set være> 90% sammenflydende ved ther punkt. Vi finder, at frysning stærkt reducerer antallet af mikroglia i astrogliale kulturer. Da øget neurotoksicitet observeres når mikroglia er til stede i de astrogliale kulturer, vi altid bruge astroglial kultur fremstillet af frosne lagre for cokultur med neuroner.
2. Neuronale Kultur
- Rene dækglas ved først skylning i milliQ vand 2x. De bliver derefter lægges i blød i koncentreret salpetersyre i 24 timer, og skylles med milliQ vand i mindst fem gange i løbet af en i alt 2 timer. Dækglas tørres og steriliseres ved bagning i en ovn ved 225 ° C i 6 timer.
- Overfør dækglas til 60 mm retter efter sterilisering. Placer fire prikker steril paraffin nær den ydre kant af hver dækglasset for at holde neuroner adskilt fra gliaceller i cokultur.
- Coat dækglas med 1 mg / ml poly-L-lysin i 0,1 M borat-buffer natten over i 37 ° C inkubator.
- Den næste dag, skylles dækglas to gange i steril milliQ vand i mindst 15 minutter hver. De inkuberes derefter natten over i plating medier i 37 ° C inkubator.
- Afliv gravid rotte (E18) ved isofluran anæstesi efterfulgt af pneumothorax, og aflive embryonale rotter ved halshugning. Fjern hjerner og dissekere de hjernehalvdele, som beskrevet ovenfor.
- Dissekere ud hippocampi fra hjernehalvdel. Anbring alle Hippocampus i en 15 ml konisk rør, og fordøje med 0,25% trypsin (0,5 ml 2,5% trypsin, 4,5 ml BSS) ved 37 ℃ i 15 min.
- Fordøjet hippocampi skylles i BSS 3x i 5 min hver. De er derefter tritureret med en glas Pasteur-pipette, og celledensitet bestemmes ved anvendelse af et hæmocytometer. Neuroner podes derefter ved en densitet på 2 x 10 5 celler pr 60 mm skål.
- Om 2-4 timer efter galvanisering, overførsel dækglas med vedhæftede neuroner til de retter, der indeholder astrogliale celler med neuroner vender ned mod glia. På DIV3 tilsættes cytosinarabinosid tilceller i en endelig koncentration på 5 uM at stoppe glia proliferation.
3. Calcium Transfection
- Betingelse N2.1 medier på glia dagen før transfektion.
- På dagen for transfektion, tage betinget N2.1 medier off af glia og overføres til en ny skål. Overførsel dækglas med neuroner i det konditionerede N2.1 medier. Lad ligevægt i kuvøse i 10-30 min.
- Ét sæt sterile rør, kombinere 1-4 ug af DNA, 12,5 pi 2 M CaCl2 og sterilt H2O til et samlet volumen på 100 ul. Til et andet sæt af rør, tilsættes 100 ul 2x HBS.
- Tilføj ⅛ volumen 2x HBS (12,5 ul) på et tidspunkt, til rør indeholdende CaCl2 / DNA-blandingen, hvirvelbehandling i et par sekunder hver gang. Lad rørene til at sidde i 15 minutter.
- Efter 15 minutters inkubation tilsættes dråbevis transfektionsblandingen til cellerne. Inkuber i 1-1,5 timer. Et lag af sand-lignende bundfald skal være synligunder mikroskop under anvendelse af et 10X objektiv.
- Efter inkubation skylles dækglas to gange med varm HBS vaskebuffer.
- Retur dækglas til originale retter med glia tilsættes kynurensyre til en endelig koncentration på 0,5 mM.
- Transfekterede neuroner kan afbildes live eller forarbejdet til immunocytokemi så tidligt som den næste dag. Neuroner kan overleve i op til tre uger efter transfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når de forskellige parametre for transfektion optimeres og kontrolleres omhyggeligt fra eksperiment til eksperiment, er det muligt at finde transfektionseffektiviteten på op til 50%. Figur 1 viser et felt af neuroner, der er transficeret med GFP på DIV4. Feltet indeholder i alt 28 neuroner, hvoraf 16 blev transfekteret. Dette svarer til en virkningsgrad på over 50%. Et udsnit af andre felter på samme dækglas viser den samlede effektivitet er omkring 50% (data ikke vist). Med astroglial cokultur system neuroner forbliver sunde og udvikle sig normalt efter transfektion. Figur 2 viser et hippocampus neuron på DIV15, 10 dage efter transfektion med en PSD-95-GFP-konstruktion. Neuron har udviklet en lang række modne champignon-formet dendritiske Torner, der angiver de neuroner er sunde. Den høje transfektion effektivitet og minimal toksicitet denne protokol gør det til et værdifuldt værktøj til at studere genfunktioner i primær flodhestcampal neuroner. Endelig kan denne protokol potentielt være indrettet til at transficere kulturer af andre typer af neuroner i hjernen, såvel som andre svære at transficere celletyper.
Figur 1.. Hippocampusneuroner transficeret med GFP ved DIV4, viser høj transfektionseffektivitet. 16 ud af 28 neuroner i området er positive. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Hippocampus neuron transficeret med PSD-95-GFP ved DIV15, viser talrige modne champignon-formet dendritiske pigge. Klik her for at se større billede .
Tabel 1. Buffer / Media opskrifter.
| Reagens | Komponenter |
| Glial Media | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% glucose 25 ml FBS (endelig 5%) 25 ml kalveserum (endelig 5%) 5 ml Penicillin / Streptomycin |
| 0,1 M boratpuffer | 2,48 g borsyre 3,9 g natrium (borax) 800 ml milliQ H2O pH med NaOH til 8,5 Filtersteriliser |
| Belægning Media | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml FBS |
| NB27 Media | 485 ml Neurobasal Media 5 ml Glutamax 2 ml B27 supplement (50x) |
| Dissektion Buffer (BSS) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3 5 ml Penicillin / Streptomycin 440 ml H2O |
| N2.1 Media | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml ovalbumin, 1% MEM 5 ml N2 supplement |
| 2x HEPES saltvand (HBS), steril | 274 mM NaCI 9,5 mM KCl 15 mM glucose 42 mM HEPES 1,4 mM Na 2 HPO 4 Forbered partier af 3 forskellige pH (7,05, 7,10, 7,15) |
| Wash Buffer (HEPES saltvand) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3 445 ml H2O |
| 50 mM kynurensyre | 0,473 g af kynurensyre i 1x PBS opløses. Tilføj dråber NaOH for at få det ind i løsningen. Så brug HCI for at indstille pH tilbage til 7,0 |
Tabel 2. Tidslinje for forberedelse kultur.
| Dag | Action |
| Før du starter | Forbered astrocyt kultur og fryse cellerne ned. Et parti af astrocyt kultur kan normalt understøtte flere måneders hippocampus kulturer. |
| Uge 1 Mandag | Tø astrocytter. |
| Uge 1 Tirsdag | Feed astrocytter. |
| Uge 1 Fredag | Feed astrocytter. |
| Uge 2 Mandag | Feed astrocytter. Skyl dækglas i H 2 O, derefter suge i salpetersyre i 24 timer. |
| Uge 2 Tirsdag | RinSE dækglas 5x. Tør sterilisere dækglas. |
| Uge 2 Onsdag | Placer paraffin prikker på dækglas. Coat dækglas med poly-L-lysin. |
| Uge 2 Torsdag | Skyl overtrukne dækglas i sterilt H2O, inkubér derefter dækglas i udpladning medier natten over ved 37 ° C. Skift medier på astrocytter til NB27. |
| Uge 2 Fredag | Hippocampus dissektion og plettering. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere vigtige parametre, der skal kontrolleres omhyggeligt for konsekvent succesfulde transfektioner 10,11. Den mest kritiske parameter for calciumphosphat-transfektion er pH-værdien af 2x HBS, som i vore hænder normalt varierer mellem 7,10-7,15. Vi anbefaler at tre partier af aktier med pH-værdier på 0,05 intervaller at tage højde for forskellen mellem pH meter. Alternativt Ciontech pattedyr transfektion kit giver 2x HBS, der konsekvent giver god effektivitet. Husk på, at pH-værdien i opløsningen vil ændre sig over tid, selv når de opbevares i fryseren. Vi generelt holde portioner af 2x HBS ved 4 ° C i op til en måned, og ved -20 ° C i op til et år.
Den anden parameter er pH-værdien af dyrkningsmediet. For at holde denne konsekvent, N2.1 medium rutinemæssigt betinget af astrogliale kulturer natten over, men ikke mere end 24 timer. Derudover forsøger vi at bruge astrogliale kulturer thpå er ens i konfluens. Brugen af glia-condition medier hjælper også reducere toksicitet for neuroner i løbet af transfektion. Konditionerede medier ækvilibreres i inkubatoren før transfektion at holde pH konsekvent.
Størrelsen og densitet af calciumphosphatudfældninger er nøglen til en vellykket transfektion. Små bundfald ville føre til lav transfektion effektivitet, mens store, clumpy bundfald normalt føre til cytotoksicitet 10. For at sikre en ensartet calciumphosphatpræcipitat dannelse, vi bruger intermitterende vortex når blande DNA / CaCl2 og 2x HBS 11. En anden almindeligt anvendt fremgangsmåde til blanding er ved at blæse luftbobler ved hjælp af en Pasteur-pipette 12. Vi har fundet den intermitterende omhvirvling til opnåelse af en mere ensartet præcipitatdannelse, især for små mængder af transfektion blanding.
Andre variabler til at overveje omfatter kvaliteten af DNA og alder neurons. Vi finder, at transfektion begynder at arbejde konsekvent, når neuroner nå DIV2, men effektiviteten begynder at falde, når neuroner er uden DIV10. Endelig sundheden for neuronkulturer selv repræsenterer en anden vigtig parameter. Vi finder brugen af cokultur systemet for at være den bedste måde at generere sunde primære hippocampus kulturer. Hvis neuroner er ikke sundt, vil de ikke overleve længe efter transfektion. Med cokultur system, kan lav densitet neuroner overlever i op til 3 uger efter transfektion, hvilket letter langtidsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konflikter interesseret deklareres.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af NIH tilskud NS065183 og startfonde fra Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
