Summary
Precipitación con fosfato de calcio es un método conveniente y económico para la transfección de células cultivadas. Con la optimización, es posible utilizar este método en las células difíciles de transfectar tales como neuronas primarias. A continuación se describe el protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo cocultured con células astroglial.
Abstract
Precipitación con fosfato de calcio es un método conveniente y económico para la transfección de células cultivadas. Con la optimización, es posible utilizar este método en las células difíciles de transfectar tales como neuronas primarias. A continuación se describe el protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo cocultured con células astroglial.
Introduction
Neuronas primarias son uno de los tipos de células más difíciles de transfectar ya que son postmitotic y son muy sensibles a los cambios micro-ambiental. Hay cuatro tipos de uso común de los métodos para la expresión de genes exógenos y los ARN corto horquilla (shRNAs) en estas células 1. Cada uno tiene sus propias ventajas y desventajas. Por ejemplo, electroporación se realiza generalmente en las neuronas recién aisladas 2, como las células deben ser transferidos en las cubetas para la transfección. Infección por el virus generalmente se puede lograr una eficiencia muy alta 3, pero es y arriesgado para los operadores más intensivos en mano de obra. Muchos reactivos de transfección mediadas por lípidos están disponibles comercialmente, con diversos grados de éxito en las neuronas y diferentes niveles de citotoxicidad.
Transfección con fosfato de calcio representa un método conveniente y económico para la introducción de genes extraños en las neuronas. El método fue utilizado por primera vez para introducir ADN adenovirus en cel mamíferosls por Graham y Van Der Eb (1973) 4. La transfección se realizó mediante la mezcla de cloruro de calcio con el ADN recombinante en un tampón de fosfato. Esto permite la formación de fosfato de ADN / calcio precipitados que, cuando se deja caer poco a poco sobre una monocapa de células, se adhieren a la superficie celular, son absorbidos por endocitosis y finalmente entrar en el núcleo 5. Este proceso daría lugar a la expresión de genes extraños introducidos en la célula diana. Eficiencias típicas de calcio gama transfección con fosfato de entre 0,5-5% 6-8. Sin embargo, con la optimización cuidadosa y ejecución consistente del protocolo experimental, es posible llegar a una eficacia de transfección de casi el 50%. Aquí describimos nuestro protocolo detallado para la transfección de fosfato de calcio de las neuronas del hipocampo primarias, que se co-cultivaron con células astroglial en un formato sándwich 9.
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Protocol
1. Preparación Rata Astrocyte la cultura para el medio condicionado y astrocitos-neuronas cocultivos.
- Prepare el tampón de disección (BSS, véase la Tabla 1 para la receta) y se almacena a 4 ° C hasta que esté listo para su uso.
- Anestesie crías de ratas neonatales (P0-P2) con isoflurano en un vaso de 500 ml.
- Cuando los cachorros son inmóviles, rocíe con etanol al 70% y decapitar.
- Retire el cerebro.
- Sostenga firmemente la cabeza con un par de Dumont # 5 pinzas, y utilizar tijeras finas para hacer una incisión en la línea media a través de la piel y el cráneo.
- Exponer el cerebro al reflejar el cráneo a los lados, y retire el cerebro en un recipiente lleno de frío BSS.
- Separar los hemisferios cerebrales desde el diencéfalo y el tronco cerebral bajo un microscopio de disección. Retire con cuidado todas las meninges al estabilizar el tejido con un par de pinzas y tirando suavemente las meninges con otro par de pinzas.
- Recoge todos los hemisferios in una placa de 60 mm. Utilizando unas tijeras pequeñas, tejido picada lo más fino posible. A continuación, transferir el tejido picado a un tubo cónico de 50 ml.
- Añadir 1,5 ml de 1% de DNasa I y 1,5 ml de 2,5% de tripsina y 12 ml de BSS (volumen total de 15 ml) a los cerebros. Incubar en un baño de agua en agitación durante 15 min a 37 ° C. Para asegurar una buena mezcla, el tubo se agita manualmente cada 5 minutos.
- Transferir el sobrenadante a través de un filtro de 70 micras de células en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Añadir 3 ml de FBS a este sobrenadante.
- Para las piezas restantes, añadir 13,5 ml de BSS y 1,5 ml de 2,5% de tripsina y se incuba en un baño de agua agitando durante otros 15 min.
- Transferir el sobrenadante restante a través del filtro celular y combinar con el sobrenadante de la Etapa 1.8.
- Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min para sedimentar las células.
- Volver a suspender las pellas en 5 ml de medio gliales. El sobrenadante se puede centrifugar de nuevo para sedimentar las células restantes.
- Contar las células utilizando un hemocitómetro.
- Cel PlateLS a una densidad de 2 matraz de 1 x 10 7 por 150 cm.
- Cambie medios de comunicación para medios gliales frescas del día después de la siembra. Después, las células alimentar dos veces por semana con los medios de comunicación de la glía.
- Cuando las células han alcanzado> 80% de confluencia (aproximadamente 10 días después de la siembra), congelar las células en 90% de suero de caballo y 10% de DMSO y mantener las existencias en nitrógeno líquido. Las células se congelaron a 2 x 10 6 por vial. Aproximadamente 5 viales se pueden congelar de cada matraz.
- Acerca de 10-14 días antes de la creación de la cultura del hipocampo, las células gliales se siembran de las existencias congeladas. Por lo general, la placa de cinco placas de 6 pocillos, lo cual es suficiente para apoyar el crecimiento de 90 cubreobjetos de las neuronas del hipocampo (tres cubreobjetos de 15 mm redondo por pocillo). También PLACA un adicional de ocho a diez platos de 60 mm de las células gliales, que se utiliza para medios acondicionado N2.1 para la transfección. El día antes del cultivo neuronal, las células deben ser alimentados con medios NB27. Los astrocitos idealmente deben ser> 90% de confluencia en el thes el punto. Encontramos que la congelación reduce en gran medida el número de microglia en las culturas astroglial. Dado que se observa una mayor neurotoxicidad cuando microglia está presente en las culturas astrogliales, siempre utilizamos la cultura astroglial preparado a partir de material congelado por cocultivo con las neuronas.
2. Cultivos neuronales
- Limpie cubreobjetos de vidrio por primera enjuague en agua 2x milliQ. A continuación, se sumergen en ácido nítrico concentrado durante 24 horas, y se aclararon con agua MilliQ durante al menos cinco veces durante un total de 2 horas. Los cubreobjetos se secan y se esterilizan por cocción en un horno a 225 ° C durante 6 horas.
- Transferencia cubreobjetos de 60 mm platos después de la esterilización. Coloque cuatro puntos de parafina estéril cerca del borde exterior de cada cubreobjetos para mantener las neuronas se separan a partir de células gliales durante cocultivo.
- Cubreobjetos capa con 1 mg / ml de poli-L-lisina en tampón de borato 0,1 M durante la noche en 37 ° C incubadora.
- El día siguiente, enjuague cubreobjetos dos veces en m estérililliQ agua durante al menos 15 minutos cada uno. A continuación, se incubaron durante la noche en medio de siembra en un 37 ° C incubadora.
- La eutanasia a ratas preñadas (E18) por la anestesia isoflurano seguido de neumotórax, y la eutanasia a las ratas embrionarias por decapitación. Eliminar cerebros y diseccionar los hemisferios cerebrales, como se describe más arriba.
- Diseccionar los hipocampos del hemisferio cerebral. Coloque todos los hipocampos en un tubo cónico de 15 ml, y digerir con tripsina al 0,25% (0,5 ml de 2,5% de tripsina, 4,5 ml de BSS) a 37 ℃ durante 15 min.
- Hipocampos digeridos se enjuagan en BSS 3x durante 5 minutos cada uno. A continuación, se trituró con una pipeta Pasteur de vidrio, y la densidad celular se determina usando un hemocitómetro. Las neuronas se sembraron a continuación a una densidad de 2 x 10 5 células por placa de 60 mm.
- Acerca de 2-4 horas después de la siembra, la transferencia cubreobjetos con las neuronas asociadas a las placas que contienen células astroglial, con las neuronas hacia abajo hacia la glía. En DIV3, añadir arabinósido de citosina a lacélulas a una concentración final de 5 mM para detener la proliferación de células gliales.
3. La transfección de calcio
- Medios N2.1 Condición de glia el día antes de la transfección.
- En el día de la transfección, los medios de comunicación tomar N2.1 acondicionado fuera de la glía y transferir a un nuevo plato. Transferencia cubreobjetos con las neuronas en los medios de comunicación N2.1 acondicionado. Deje que equilibre en incubadora durante 10 a 30 min.
- Para un conjunto de tubos estériles, combine 1-4 g de ADN, 12,5 l de 2 M de CaCl 2 y H 2 O estéril para un volumen total de 100 l. Para un segundo conjunto de tubos, añadir 100 ml de 2x HBS.
- Añadir un volumen ⅛ de 2x HBS (12,5 l) a la vez para el tubo que contiene la mezcla de CaCl 2 / ADN, vórtice durante unos pocos segundos cada vez. Dejar que los tubos para sentarse durante 15 minutos.
- Después de 15 min de incubación, añadir gota a gota la mezcla de transfección a las células. Incubar durante 1 a 1,5 horas. Una capa de precipitados como la arena debe ser visiblebajo el microscopio utilizando un objetivo de 10X.
- Después de la incubación, enjuague cubreobjetos dos veces con tampón de lavado caliente HBS.
- Cubreobjetos Volver a platos originales con glía, añadir ácido quinurénico a una concentración final de 0,5 mM.
- Neuronas transfectadas se pueden obtener imágenes en vivo o procesadas para la inmunocitoquímica tan pronto como al día siguiente. Las neuronas pueden sobrevivir hasta tres semanas después de la transfección.
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Representative Results
Cuando los diferentes parámetros de la transfección se optimizan y controlan cuidadosamente de experimento a experimento, es posible obtener eficiencias de transfección de hasta el 50%. La Figura 1 muestra un campo de neuronas que están transfectadas con GFP en DIV4. El campo contiene un total de 28 neuronas, entre los cuales 16 fueron transfectadas. Esto representa un rendimiento de más del 50%. Un muestreo de otros campos de la misma cubreobjetos muestra la eficiencia global es de alrededor de 50% (datos no mostrados). Con el sistema de cocultivo astroglial, las neuronas permanecen sanos y desarrollarse normalmente después de la transfección. Figura 2 muestra una neurona del hipocampo en DIV15, 10 días después de la transfección con una construcción de PSD-95-GFP. La neurona ha desarrollado numerosas espinas dendríticas maduras en forma de hongo, lo que indica que las neuronas son saludables. La alta eficiencia de transfección y mínima toxicidad de este protocolo hace que sea una herramienta valiosa para el estudio de las funciones de genes en hipopótamo primarianeuronas Campal. Finalmente, este protocolo puede ser potencialmente adaptada para transfectar cultivos de otros tipos de neuronas en el cerebro, así como otros tipos de células difíciles de transfectar.
Figura 1. Las neuronas del hipocampo transfectadas con GFP en DIV4, mostrando una alta eficiencia de transfección. 16 de 28 neuronas en el campo son positivas. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Neurona del hipocampo transfectadas con el PSD-95-GFP en DIV15, mostrando numerosas espinas dendríticas maduras en forma de hongo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Tabla 1. Buffer / Recetas Medios.
| Reactivo | Componentes |
| Glial Medios | 425 ml de MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml de piruvato de sodio, 100 mM 15 ml de 20% de glucosa 25 ml de FBS (5% final) Suero de 25 ml de ternera (5% final) 5 ml de penicilina / estreptomicina |
| 0,1 M tampón borato | 2,48 g de ácido bórico 3,9 g de tetraborato de sodio (bórax) 800 ml de H2O milliQ pH con NaOH a 8,5 Se esteriliza con filtro |
| Plating Medios | 425 ml de MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml de piruvato de sodio, 100 mM 15 ml de 20% glucose FBS 50 ml |
| NB27 Medios | 485 ml Neurobasal Medios 5 ml GlutaMAX 2 ml de suplemento B27 (50x) |
| Disección Buffer (BSS) | 50 ml de HBSS 10x 5 ml de HEPES 1 M, pH 7,3 5 ml de penicilina / estreptomicina 440 ml de H2O |
| N2.1 Medios | 425 ml de MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml de piruvato de sodio, 100 mM 15 ml de 20% de glucosa 50 ml de ovoalbúmina, 1% en MEM 5 ml de suplemento de N2 |
| 2x HEPES Buffered Saline (HBS), estéril | NaCl 274 mM 9,5 mM KCl 15 mM de glucosa 42 mM HEPES 1,4 mM Na 2 HPO 4 Preparar lotes de 3 pH diferentes (7,05, 7,10, 7,15) |
| Tampón de lavado (HEPES Buffered Saline) | 50 ml de HBSS 10x 5 ml de HEPES 1 M, pH 7,3 445 ml de H2O |
| 50 mM de ácido quinurénico | Disolver 0,473 g de ácido quinurénico en 1x PBS. Añadir gotas de NaOH conseguirlo en la solución. A continuación, utilice HCl para ajustar de nuevo el pH a 7,0 |
Tabla 2. Línea de tiempo para la preparación de la cultura.
| Día | Acción |
| Antes de iniciar | Preparar la cultura de astrocitos y congelar las células hacia abajo. Un lote de la cultura general de los astrocitos puede soportar varios meses de cultivos de hipocampo. |
| Semana 1 Lunes | Descongele los astrocitos. |
| Semana 1 Martes | Alimente astrocitos. |
| Semana 1 Viernes | Alimente astrocitos. |
| Semana 2 Lunes | Alimente astrocitos. Enjuague cubreobjetos en H 2 O, y luego sumergirse en ácido nítrico durante 24 horas. |
| Semana 2 Martes | RinSE cubreobjetos 5x. Esterilizar seco cubreobjetos. |
| Semana 2 Miércoles | Coloque los puntos de parafina en cubreobjetos. Escudo cubreobjetos con poli-L-lisina. |
| Semana 2 Jueves | Enjuague cubreobjetos recubiertos en H2O estéril, luego incubar cubreobjetos en chapado de medios durante la noche a 37 ° C. Cambie los medios en los astrocitos a NB27. |
| Semana 2 Viernes | Disección y galjanoplastia del hipocampo. |
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Discussion
Hay varios parámetros clave que deben ser cuidadosamente controlada para transfecciones consistentemente exitosos 10,11. El parámetro más crítico para la transfección de fosfato de calcio es el valor de pH de 2x HBS, que en nuestras manos por lo general varía entre 7.10 hasta 7.15. Se recomienda hacer tres lotes de acciones con valores de pH en incrementos de 0.05 para dar cuenta de la diferencia entre los medidores de pH. Alternativamente, el kit de transfección de mamíferos Clontech proporciona 2x HBS que produce consistentemente buena eficiencia. Tenga en cuenta que el pH de la solución cambiará con el tiempo, incluso cuando se almacenan en el congelador. Generalmente Mantenemos alícuotas de 2x HBS a 4 ° C durante un máximo de un mes, ya -20 ° C durante un máximo de un año.
El segundo parámetro es el pH del medio de cultivo. Para mantener este, medio N2.1 consistentes están condicionados de manera rutinaria en las culturas astrogliales noche a la mañana, pero no más de 24 horas. Además, tratamos de utilizar las culturas astrogliales ªa son similares en confluencia. El uso de los medios de comunicación glía acondicionado también ayuda a reducir la toxicidad a las neuronas durante la transfección. Los medios condicionados se equilibran en la incubadora antes de la transfección para mantener el pH constante.
El tamaño y la densidad de los precipitados de fosfato de calcio es la clave para la transfección con éxito. Precipitados pequeños podrían conducir a una baja eficiencia de transfección, mientras que las grandes precipitados, aglutinadas por lo general conducen a citotoxicidad 10. Para asegurar la formación de fosfato de calcio precipitado coherente, utilizamos vórtice intermitente al mezclar el ADN / CaCl 2 y 2x HBS 11. Otro método comúnmente utilizado para la mezcla es a través de soplado de burbujas de aire utilizando una pipeta Pasteur 12. Hemos encontrado el vórtice intermitente para producir la formación de precipitado más consistente, especialmente para pequeños volúmenes de mezcla de transfección.
Otras variables a considerar incluyen la calidad del ADN, y la edad de la neurons. Nos encontramos con que la transfección empezar a trabajar constantemente cuando las neuronas llegan DIV2, sin embargo, la eficiencia empieza a disminuir cuando las neuronas están más allá DIV10. Finalmente, la salud de los propios cultivos neuronales representa otro parámetro importante. Nos encontramos con el uso del sistema de co-cultivo que es la mejor manera de generar cultivos de hipocampo primaria saludables. Si las neuronas no son saludables, no van a sobrevivir mucho tiempo después de la transfección. Con el sistema de co-cultivo, las neuronas de baja densidad pueden sobrevivir por hasta 3 semanas después de la transfección, lo que facilita los estudios a largo plazo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por el NIH subvención NS065183 y los fondos de puesta en marcha de la Escuela de Medicina Robert Wood Johnson de Rutgers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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