Summary
Kalciumfosfatutfällning är en praktisk och ekonomisk metod för transfektion av odlade celler. Med optimering, är det möjligt att använda denna metod på svår transfektera celler som primära neuroner. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av hippocampus nervceller samodlades med astrogliaceller.
Abstract
Kalciumfosfatutfällning är en praktisk och ekonomisk metod för transfektion av odlade celler. Med optimering, är det möjligt att använda denna metod på svår transfektera celler som primära neuroner. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av hippocampus nervceller samodlades med astrogliaceller.
Introduction
Primära nervceller är en av de svåraste celltyper för transfektion eftersom de är postmitotisk och är mycket känsliga för mikromiljöförändringar. Det finns fyra allmänt använda typer av metoder för expression av exogena gener och de korta hårnåls RNAs (shRNAs) i dessa celler 1. Var och en har sina egna fördelar och nackdelar. Till exempel är elektroporation vanligen utförs på nyisolerade neuroner 2, som celler måste överföras till kyvetter för transfektion. Virusinfektion kan oftast uppnå mycket hög verkningsgrad 3, men är mer arbetskrävande och riskabelt för operatörerna. Många lipid-medierad transfektion reagens är kommersiellt tillgängliga, med varierande grader av framgång i neuroner och olika nivåer av cytotoxicitet.
Kalciumfosfat transfektion representerar ett bekvämt och ekonomiskt sätt för att införa främmande gener i neuroner. Metoden användes först för att introducera adenovirus DNA i däggdjurs cells av Graham och van der Eb (1973) 4. Transfektion utfördes genom blandning av kalciumklorid med rekombinant-DNA i en fosfatbuffert. Detta möjliggör bildandet av DNA / kalciumfosfat utfällningar som när så småningom släpps på ett monolager av celler, hålla sig till cellytan, tas upp genom endocytos och slutligen in i kärnan 5. Denna process kommer att leda till expression av införda främmande gener i målcellen. Typiska effektivitetsvinsterna av kalciumfosfattransfektion intervall mellan 0,5-5% 6-8. Men med noggrann optimering och konsekvent genomförande av det experimentella protokollet, är det möjligt att nå en transfektionseffektivitet på nästan 50%. Här beskriver vi vår detaljerade protokoll för kalciumfosfattransfektion av primära hippocampus nervceller, vilka samodlades med astrogliaceller i en sandwich-format 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Råtta Astrocyte Kultur för konditionerat media och Astrocyte-neuron samodlingarna.
- Förbered dissektion buffert (BSS, se tabell 1 för receptet) och förvara vid 4 ° C tills produkten ska användas.
- Bedöva neonatala råttungar (P0-P2) med isofluran i en 500 ml bägare.
- När valparna är orörliga, spraya med 70% etanol och halshugga.
- Ta bort hjärnan.
- Håll huvudet stadigt med ett par Dumont # 5 pincett, och använda fina sax för att göra en mittlinjen snitt genom huden och skallen.
- Exponera hjärnan genom att reflektera skallen åt sidorna, och ta bort hjärnan i en skål med kallt BSS.
- Separera hjärnhalvorna från diencephalon och hjärnstammen under ett dissekera omfattning. Ta försiktigt bort alla hjärnhinnor genom att stabilisera vävnaden med en pincett och försiktigt dra bort hjärnhinnorna med en annan pincett.
- Samla alla halvklot in en 60 mm maträtt. Med små saxar, färs vävnad så fint som möjligt. Överför sedan det malda vävnaden till en 50 ml koniska rör.
- Lägg till 1,5 ml av 1% DNas I och 1,5 ml av 2,5% trypsin och 12 ml BSS (total volym 15 ml) till hjärnor. Inkubera i ett skakande vattenbad under 15 minuter vid 37 ° C. För att säkerställa god blandning, är röret snurras för hand var 5 min.
- Överför supernatanten genom ett 70 ìm cell sil över en ny 50 ml koniska rör. Tillsätt 3 ml FBS till denna supernatant.
- Till de återstående bitar, tillsätt 13,5 ml av BSS och 1,5 ml 2,5% trypsin och inkubera i skakande vattenbad under ytterligare 15 minuter.
- Överför återstående supernatanten genom cellen sil och kombinera med supernatanten från steg 1,8.
- Centrifugera vid 1000 RPM under 5 min för att pelletera cellerna.
- Resuspendera pellets i 5 ml gliaceller medier. Supernatant kan centrifugeras igen för att pelletera de kvarvarande cellerna.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer.
- Plansch cells vid en densitet av 1 x 10 7 per 150 cm 2 kolv.
- Ändra media till färska gliaceller medier dagen efter plätering. Efteråt, mata cellerna två gånger i veckan med gliaceller medier.
- När cellerna har nått> 80% sammanflytning (ca 10 dagar efter plätering), frysa celler i 90% hästserum och 10% DMSO och hålla lager i flytande kväve. Cellerna fryses vid 2 x 10 6 per flaska. Cirka 5 injektionsflaskor kan frysas från varje kolv.
- Ca 10-14 dagar innan du ställer in den hippocampus kulturen, är gliaceller pläterade från frysta lager. Vi tallrik brukar fem 6-brunnars plattor, vilket är tillräckligt för att stödja tillväxten av 90 täckglas av hippocampus nervceller (tre 15 mm runda täckglas per brunn). Vi tallrik även ytterligare åtta till tio 60 mm rätter av gliaceller, som används för konditione N2.1 media för transfektion. Dagen före neuronal kultur bör cellerna matas med NB27 medier. De astrocyter bör helst vara> 90% sammanflytande vid thär punkten. Vi finner att frysa kraftigt minskar antalet mikroglia i astrogliala kulturer. Eftersom ökad neurotoxicitet observeras när mikroglia är närvarande i astrogliala kulturer använder vi alltid astroglial kultur beredd från frysta bestånd för samodling med nervceller.
2. Neuronala Kultur
- Rengör täckglas av första sköljning i milliQ vatten 2x. De är då indränkt i koncentrerad salpetersyra i 24 h, och sköljas med milliQ vatten i minst fem gånger under totalt 2 timmar. Täckglas torkas och steriliseras genom bakning i en ugn vid 225 ° C under 6 timmar.
- Överför täckglas till 60 mm rätter efter sterilisering. Placera fyra punkter av steril paraffin nära den yttre kanten på varje täckglas för att hålla nervceller separera från gliaceller under samodling.
- Coat täckglas med 1 mg / ml poly-L-lysin i 0,1 M boratbuffert över natt i 37 ° C inkubator.
- Nästa dag, skölj täck två gånger i steril milliQ vatten i minst 15 minuter vardera. De inkuberades sedan över natt i bordläggningen media i 37 ° C inkubator.
- Euthanize gravid råtta (E18) genom isoflurananestesi följt av pneumothorax, och avliva embryonala råttor genom dekapitering. Ta hjärnor och dissekera ut hjärnhalvorna som beskrivits ovan.
- Dissekera ut hippocampi från hjärnhalva. Placera alla hippocampi till ett 15 ml koniskt rör, och smälta med 0,25% trypsin (0,5 ml 2,5% trypsin, 4,5 ml BSS) vid 37 ℃ i 15 min.
- Spjälkade hippocampi sköljs i BSS 3x 5 minuter vardera. De är sedan triturerades med en glas pasteurpipett och celldensiteten bestämdes genom användning av en hemocytometer. Neuroner därefter såddes vid en densitet av 2 x 10 5 celler per 60 mm skål.
- Ca 2-4 timmar efter plätering, täck överföring med bifogade nervceller till rätter som innehåller astrogliaceller, med nervceller som vetter ner mot glia. På DIV3, lägga cytosinarabinosid tillcellerna vid en slutlig koncentration av 5 | iM för att stoppa glia proliferation.
3. Kalcium Transfektion
- Skick N2.1 media på glia dagen innan transfektion.
- På dagen för transfektion, ta rade N2.1 media off av glia och överför till en ny skål. Överför täckglas med nervceller i den rade N2.1 media. Låt jämvikt i inkubator i 10-30 min.
- Till en uppsättning av sterila rör, kombinera 1-4 xg DNA, 12,5 ^ il av 2 M CaCl2 och sterilt H2O för en total volym av 100 | il. Till en andra uppsättning av rör, tillsätt 100 | il av 2x HBS.
- Lägg ⅛ volym 2x HBS (12,5 l) åt gången till röret med CaCl2 / DNA-blandningen, vortexa i ett par sekunder varje gång. Tillåt rören stå under 15 min.
- Efter 15 minuters inkubering, till transfektionsblandningen droppvis till cellerna. Inkubera under 1 till 1,5 timmar. Ett skikt av sand-liknande partiklar skall vara synligi mikroskop med hjälp av en 10X objektiv.
- Efter inkubation, skölj täck två gånger med varm HBS tvättbuffert.
- Återgå täck till ursprungliga rätter med glia, till kynurensyra till en slutlig koncentration av 0,5 mM.
- Transfekterade nervceller kan avbildas levande eller behandlas för immuncytokemi redan nästa dag. Nervceller kan överleva upp till tre veckor efter transfektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När de olika parametrarna för transfektion är optimerad, och kontrolleras noggrant från experiment till experiment, är det möjligt att erhålla transfektion effektivitet på upp till 50%. Figur 1 visar ett fält av neuroner som transfekteras med GFP på DIV4. Fältet innehåller totalt 28 neuroner, bland vilka 16 transfekterades. Detta motsvarar en verkningsgrad på över 50%. En sampling av andra områden på samma täckglas visar den totala effektiviteten är ca 50% (data ej visade). Med astroglial coculture system neurons förblir friska och utvecklas normalt efter transfektion. Figur 2 visar en hippocampal neuron vid DIV15, 10 dagar efter transfektion med en PSD-95-GFP-konstruktionen. Neuron har utvecklat ett stort antal mogna svampformade Dendritutskotten, vilket tyder på nervceller är friska. Den höga transfektion effektivitet och minimal toxicitet i detta protokoll gör det till ett värdefullt verktyg för att studera geners funktion i primär flodhästcampal neuroner. Slutligen kan detta protokoll potentiellt vara anpassad för att transfektera odlingar av andra typer av nervceller i hjärnan, såväl som andra som är svåra att transfektera olika celltyper.
Figur 1. Hippocampusneuroner transfekterade med GFP vid DIV4, visar hög transfektionseffektivitet. 16 av 28 neuroner i området är positiva. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Hippocampus neuron transfekterade med PSD-95-GFP vid DIV15, visar ett stort antal mogna svampformade Dendritutskotten. Klicka här för att visa en större bild .
Tabell 1. Buffert / Media recept.
| Reagens | Komponenter |
| Glial Media | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% glukos 25 ml FBS (slutlig 5%) 25 ml kalvserum (slutlig 5%) 5 ml penicillin / streptomycin |
| 0,1 M boratbuffert | 2,48 g borsyra 3,9 g natriumtetraborat (borax) 800 ml milliQ H2O pH med NaOH till 8,5 filtrera sterilisera |
| Plating Media | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml FBS |
| NB27 Media | 485 ml Neurobasal media 5 ml GlutaMAX 2 ml B27 supplement (50x) |
| Dissektion Buffer (BSS) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3 5 ml penicillin / streptomycin 440 ml H2O |
| N2.1 Media | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml natriumpyruvat, 100 mM 15 ml 20% glukos 50 ml ovalbumin, 1% i MEM 5 ml N2 tillägg |
| 2x HEPES saltlösning (HBS), steril | 274 mM NaCl 9,5 mM KCl 15 mM glukos 42 mM HEPES 1,4 mM Na 2 HPO 4 Förbered partier av 3 olika pH (7,05, 7,10, 7,15) |
| Tvättbuffert (HEPES-buffrad saltlösning) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7,3 445 ml H2O |
| 50 mM kynurensyra | Lös upp 0,473 g av kynurensyra i 1x PBS. Lägg droppar NaOH för att få in det i lösning. Använd sedan HCl för att justera pH till 7,0 |
Tabell 2. Tidsplan för kultur förberedelse.
| Dag | Åtgärd |
| Före start | Förbered astrocyternas kultur och frysa celler nedåt. Ett parti av astrocyternas kultur kan vanligtvis stödja flera månader av hippocampus kulturer. |
| Vecka 1 Måndag | Tina astrocyter. |
| Vecka 1 tisdag | Feed astrocyter. |
| Vecka 1 Fredag | Feed astrocyter. |
| Vecka 2 Måndag | Feed astrocyter. Skölj täckglas i H2O, sedan suga i salpetersyra under 24 timmar. |
| Vecka 2 Tisdag | RinSE täck 5x. Torr sterilisera täckglas. |
| Vecka 2 Onsdag | Placera paraffin prickar på täckglas. Coat täckglas med poly-L-lysin. |
| Vecka 2 Torsdag | Skölj belagda täckglas i steril H2O, sedan inkubera täckglas i plätering media över natten vid 37 ° C. Ändra media på astrocyter till NB27. |
| Vecka 2 fredag | Hippocampus dissektion och plätering. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga parametrar som måste kontrolleras noggrant för konsekvent framgångsrika transfektioner 10,11. Den mest kritiska parametern för kalciumfosfat-transfektion är det pH-värde av 2x HBS, som i våra händer vanligen varierar mellan 7,10 till 7,15. Vi rekommenderar att tre partier av lager med pH-värden i 0.05 steg till svars för skillnaden mellan pH-mätare. Alternativt tillhandahåller Clontech däggdjurs transfektionskit 2x HBS som konsekvent ger god effektivitet. Tänk på att pH-värdet hos lösningen kommer att förändras över tiden, även när det lagras i frysen. Vi håller generellt portioner av 2x HBS vid 4 ° C i upp till en månad, och vid -20 ° C i upp till ett år.
Den andra parametern är pH i odlingsmediet. För att hålla detta konsekvent, N2.1 mediet rutinmässigt förutsättning astroglial kulturer över en natt, men inte mer än 24 timmar. Dessutom försöker vi använda astrogliala kulturer thpå är liknande i sammanflyt. Användningen av glia-rade media bidrar också minska toxicitet för nervceller under transfektion. Konditionerade media jämviktas i inkubatorn före transfektion för att hålla pH konsekvent.
Storleken och densiteten för de kalciumfosfat fällningar är nyckeln till lyckad transfektion. Små fällningar skulle leda till låg transfektion effektivitet, medan stora, klumpiga fällningar brukar leda till cytotoxicitet 10. För att säkerställa en jämn kalciumfosfat fällning bildas, använder vi intermittent virvelbildning vid blandning av DNA / CaCl2 och 2x HBS 11. En annan ofta använd metod för blandning är genom att blåsa luftbubblor med användning av en Pasteur-pipett 12. Vi har hittat den intermittenta vortex för att ge jämnare fällning bildas, särskilt för små volymer av transfektion blandning.
Andra variabler att beakta inkluderar kvaliteten på DNA, och åldern av den neuralans. Vi finner att den transfektion börja arbeta konsekvent när nervceller når DIV2, men börjar effektiviteten sjunka när nervceller är bortom DIV10. Slutligen hälsan hos neuronala kulturer själva utgör en annan viktig parameter. Vi finner användandet av coculture systemet vara det bästa sättet att generera friska primära hippocampus kulturer. Om nervceller är inte hälsosamt, kommer de inte att överleva länge efter transfektion. Med coculture systemet, kan låga nervceller densitet överleva i upp till 3 veckor efter transfektion, vilket underlättar långtidsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga konflikter intresserade deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH bidrag NS065183 och startmedel från Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
