Summary
Utfelling med kalsiumfosfat er en praktisk og økonomisk fremgangsmåte for transfeksjon av dyrkede celler. Med optimalisering, er det mulig å bruke denne metoden på vanskelige å transfektere celler som primære nevroner. Her beskriver vi vår detaljert protokoll for kalsiumfosfat transfeksjon av hippocampus nevroner cocultured med astroglial celler.
Abstract
Utfelling med kalsiumfosfat er en praktisk og økonomisk fremgangsmåte for transfeksjon av dyrkede celler. Med optimalisering, er det mulig å bruke denne metoden på vanskelige å transfektere celler som primære nevroner. Her beskriver vi vår detaljert protokoll for kalsiumfosfat transfeksjon av hippocampus nevroner cocultured med astroglial celler.
Introduction
Primære nevroner er en av de vanskeligste celletyper å transfektere som de er postmitotic og er svært følsomme for mikro-miljøendringer. Det er fire brukte typer av metoder for uttrykk av eksogene gener og kort hårnål RNA (shRNAs) i disse cellene en. Hver har sine egne fordeler og ulemper. For eksempel er elektroporering vanligvis utført på nylig isolerte nevroner 2, som celler må overføres inn i kyvettene for transfeksjon. Virusinfeksjon kan vanligvis oppnå svært høy virkningsgrad 3, men er mer arbeidskrevende og risikofylt for operatørene. Mange lipid-mediert transfeksjon reagenser er tilgjengelig kommersielt, med varierende grad av suksess i nerveceller og ulike nivåer av cytotoksisitet.
Kalsiumfosfat transfeksjon representerer en praktisk og økonomisk metode for innføring av fremmede gener inn i nerveceller. Metoden ble først brukt til å innføre adenovirus-DNA inn i pattedyr cells av Graham og Van Der Eb (1973) 4. Transfeksjon ble utført ved å blande kalsium klorid med rekombinant DNA i en fosfatbuffer. Dette tillater dannelsen av DNA / kalsiumfosfat utfelles som, når den gradvis slippes på et monolag av celler, holder seg til celleoverflaten, blir tatt opp av endocytose og til slutt komme inn i cellekjernen 5. Denne prosessen vil føre til ekspresjon av fremmede gener innført i målcellen. Typiske effektivitet av kalsiumfosfat transfeksjon varierer mellom 0,5-5% 6-8. Imidlertid, med forsiktig optimalisering og konsistent utførelse av den eksperimentelle protokollen, er det mulig å nå en transfeksjon virkningsgrad på nesten 50%. Her beskriver vi vår detaljert protokoll for kalsiumfosfat transfeksjon av primære hippocampus nevroner, som er cocultured med astroglial celler i en sandwich-format ni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder Rat astrocyte Kultur for kondisjonerte medie og astrocyte-nevron Cocultures.
- Forbered disseksjon buffer (BSS, se tabell 1 for oppskrift) og oppbevar ved 4 ° C til alt er klart til bruk.
- Anesthetize neonatale rotteunger (P0-P2) med isofluran i et 500 ml begerglass.
- Når valpene er immobile, spray med 70% etanol og halshogge.
- Fjern hjernen.
- Hold hodet fast med et par Dumont # 5 tang, og bruke gode saks for å lage en midtlinjen snitt gjennom huden og hodeskallen.
- Expose hjernen ved å reflektere skallen til sidene, og fjerne hjernen til en skål med kaldt BSS.
- Separer hjernehemisfærene fra diencephalon og hjernestammen under et dissekere omfang. Fjerne alle hjernehinnene nøye ved å stabilisere vev med en pinsett og forsiktig dra bort hjernehinnene med en annen pinsett.
- Samle alle halvkuler in en 60 mm fatet. Ved hjelp av små saks, kjøttdeig vev så fint som mulig. Deretter overfører hakket vevet til et 50 ml konisk rør.
- Tilsett 1,5 ml av 1% DNase I og 1,5 ml av 2,5% trypsin og 12 ml BSS (totalt volum på 15 ml) til hjernen. Inkuber i et rystende vannbad i 15 min ved 37 ° C. Å sikre god blanding, er tube virvlet hånd hver 5 min.
- Overfør supernatanten gjennom en 70 mikrometer celle sil over en ny 50 ml konisk tube. Legg 3 ml FBS til denne supernatant.
- Til de gjenværende biter, tilsett 13,5 ml med BSS og 1,5 ml 2,5% trypsin og inkuberes i riste vannbad i 15 min.
- Overfør den gjenværende supernatant gjennom cellen silen og kombinere med supernatanten fra trinn 1.8.
- Sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min for å pelletere cellene.
- Suspender pellets i 5 ml av gliacellene medier. Supernatant kan sentrifugeres på nytt for å pelletere den gjenværende celler.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Plate cells ved en tetthet på 1 x 10 7 pr 150 cm 2-kolbe.
- Endre media til ferske glial media dagen etter plating. Etterpå mate cellene to ganger i uken med glial medier.
- Når cellene har nådd> 80% konfluens (ca. 10 dager etter plating), frysecellene ned i 90% hesteserum og 10% DMSO, og ha et lager i flytende nitrogen. Celler frosset ved 2 x 10 6 per ampulle. Ca 5 hetteglass kan fryses fra hver kolbe.
- Ca 10-14 dager før du setter opp hippocampus kultur, er gliaceller belagt fra frosne bestander. Vi plate vanligvis fem seks-brønns plater, noe som er nok til å støtte veksten av 90 Dekk av hippocampus nevroner (tre 15 mm runde Dekk per brønn). Vi plate også ytterligere åtte til ti 60 mm retter av gliaceller, som brukes for condition N2.1 media for transfeksjon. Dagen før neuronal kultur, bør cellene mates med NB27 media. De astrocytter bør ideelt sett være> 90% konfluent på ther poenget. Vi finner at frysing reduserer antall microglia i astroglial kulturer. Siden økt nevrotoksisitet er observert når microglia er til stede i de astroglial kulturer, vi bruker alltid astroglial kultur fremstilt fra frosne bestander for coculture med nerveceller.
2. Neuronal Kultur
- Rengjør glassDekk etter første skylling i MilliQ vann 2x. De blir deretter fuktet med konsentrert salpetersyre i 24 timer, og skylt med MilliQ vann i minst fem ganger i løpet av totalt 2 timer. Dekkglass blir tørket og sterilisert ved baking i en ovn ved 225 ° C i 6 timer.
- Transfer Dekk til 60 mm retter etter sterilisering. Plasser fire prikker av sterile parafin nær ytterkanten av hver dekk å holde nevroner atskilt fra gliacellene under coculture.
- Belegge dekkglass med 1 mg / ml poly-L-lysin i 0,1 M boratbuffer over natten i 37 ° C inkubator.
- Den neste dagen, skyll Dekk to ganger i sterile milliQ vann i minst 15 minutter hver. De blir deretter inkubert over natten i pletteringsmateriale i 37 ° C inkubator.
- Avlive gravid rotte (E18) ved isoflurananestesi fulgt av pneumothorax, og avlive embryonale rotter ved halshogging. Fjern hjerner og dissekere ut hjernehemisfærene som beskrevet ovenfor.
- Dissekere ut hippocampi fra cerebral halvkule. Legg alle hippocampi inn i et 15 ml konisk rør og fordøye med 0,25% trypsin (0,5 ml 2,5% trypsin, 4,5 ml BSS) ved 37 ℃ i 15 min.
- Fordøyd hippocampi skylles i BSS 3x for 5 min hver. De blir deretter triturert med en glass Pasteur-pipette, og celletettheten blir bestemt ved hjelp av et hemocytometer. Neuroner blir deretter sådd ved en densitet på 2 x 10 5 celler pr 60 mm fatet.
- Om 2-4 timer etter plating, dekk overføring med vedlagt nevroner til rettene inneholder astroglial celler, med nevroner som vender ned mot gliaceller. På Div3, legge cytosine arabinoside tilcellene ved en sluttkonsentrasjon på 5 mM for å stoppe gliaceller spredning.
Tre. Kalsium Transfection
- Tilstand N2.1 media på gliaceller dagen før transfeksjon.
- På dagen for transfeksjon, ta betinget N2.1 media ut av gliaceller og overføre til en ny rett. Transfer Dekk med nerveceller i den betingede N2.1 media. La likevekt i inkubator for 10-30 min.
- For ett sett av sterile rør, kombinere 1-4 pg av DNA, 12,5 pl av 2 M CaCl 2 og sterilt H 2 O i et totalt volum på 100 ul. Til et ekstra sett med rør, tilsett 100 mL av 2x HBS.
- Legg ⅛ volum av 2x HBS (12,5 ul) av gangen til røret inneholdende CaCl 2 / DNA-blandingen, vortex-blanding i noen få sekunder hver gang. Tillat rørene for å stå i 15 min.
- Etter 15 min inkubering tilsett transfeksjon blandingen dråpevis til cellene. Inkuber i 1-1,5 time. Et lag av sand-aktig bunnfall som skal være synligeunder mikroskopet ved hjelp av en 10X objektiv.
- Etter inkubasjon, skyll Dekk to ganger med varm HBS vaskebuffer.
- Returner Dekk til originale retter med gliaceller, legge kynurenic syre til en endelig konsentrasjon på 0,5 mM.
- Transfekterte nevroner kan avbildes direkte eller behandles for immunocytochemistry så tidlig som neste dag. Nerveceller kan overleve opp til tre uker etter transfeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når de forskjellige parametre for transfeksjon er optimalisert og nøye kontrollert fra eksperiment til eksperiment, er det mulig å oppnå transfeksjon virkningsgrader på opp til 50%. Figur 1 viser et felt av nerveceller som er transfektert med GFP on DIV4. Feltet inneholder totalt 28 nevroner, hvorav 16 ble transfektert. Dette representerer en effektivitet på over 50%. Et utvalg av andre felt i den samme dekk viser den totale virkningsgraden er omtrent 50% (data ikke vist). Med astroglial coculture system, nerveceller forblir friske og utvikler seg normalt etter transfeksjon. Figur 2 viser en hippocampus nevron på DIV15, 10 dager etter transfeksjon med en PSD-95-GFP konstruere. Den nevron har utviklet en rekke modne soppformede dendrittutløperne, noe som indikerer nervecellene er friske. Den høye transfeksjon effektivitet og minimal toksisitet av denne protokollen gjør det til et verdifullt verktøy for å studere genfunksjoner i primær flodhestcampal nevroner. Endelig kan denne protokoll potensielt bli tilpasset til å transfektere kulturer av andre typer av neuroner i hjernen, samt andre som er vanskelige å transfektere celletyper.
Figur 1. Hippocampus nevroner tilført med GFP på DIV4, som viser høy transfeksjon effektivitet. 16 av 28 nevroner i feltet er positive. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. Hippocampus nevron tilført med PSD-95-GFP på DIV15, viser mange modne soppformede dendrittutløperne. Klikk her for å se større bilde .
Tabell 1. Buffer / Media oppskrifter.
| Reagens | Komponenter |
| Glial Media | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml natrium-pyruvat, 100 mM 15 ml 20% glukose 25 ml FBS (siste 5%) 25 ml kalveserum (siste 5%) 5 ml Penicillin / streptomycin |
| 0.1M boratpuffer | 2.48 g borsyre 3,9 g natrium tetraborate (Borax) 800 ml MilliQ H2O pH-verdien med NaOH til 8,5 filter sterilisere |
| Plating Media | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml natrium-pyruvat, 100 mM 15 ml 20% glucose 50 ml FBS |
| NB27 Media | 485 ml Neurobasal Media 5 ml Glutamax 2 ml B27 supplement (50x) |
| Disseksjon Buffer (BSS) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7.3 5 ml Penicillin / streptomycin 440 ml H 2 O |
| N2.1 Media | 425 ml MEM 5 ml Glutamax 5 ml natrium-pyruvat, 100 mM 15 ml 20% glukose 50 ml ovalbumin, 1% i MEM 5 ml N2 supplement |
| 2x HEPES bufret saltvann (HBS), sterile | 274 mM NaCl 9,5 mM KCl 15 mM glukose 42 mMHEPES 1,4 mM Na 2 HPO 4 Forbered grupper av tre forskjellige pH (7.05, 7.10, 7.15) |
| Wash Buffer (HEPES Buffered Saline) | 50 ml 10x HBSS 5 ml 1 M HEPES, pH 7.3 445 ml H 2 O |
| 50 mM Kynurenic syre | Løs opp 0.473 g kynurenic syre i 1x PBS. Legg dråper NaOH for å få den inn i løsningen. Deretter bruker HCl for å justere pH-verdien tilbake til 7,0 |
Tabell 2. Tidslinje for forberedelse kultur.
| Dag | Handling |
| Før du starter | Forbered astrocyte kultur og fryse celler ned. En batch av astrocyte kultur kan vanligvis støtter flere måneder med hippocampus kulturer. |
| Uke 1 mandag | Tine astrocytter. |
| Uke 1 Tirsdag | Strøm astrocytter. |
| Uke 1 Fredag | Strøm astrocytter. |
| Uke 2 mandag | Strøm astrocytter. Skyll Dekk i H 2 O, deretter suge i salpetersyre for 24 hr. |
| Uke 2 tirsdag | RinSE Dekk 5x. Kles sterilisere Dekk. |
| Uke 2 onsdag | Plasser parafin prikker på dekkglass. Coat Dekk med poly-L-lysin. |
| Uke 2 torsdag | Skyll belagt Dekk i sterile H2O, deretter inkuberes Dekk i plating media over natten ved 37 ° C. Endre media på astrocytter til NB27. |
| Uke 2 fredag | Hippocampus disseksjon og platekledning. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere viktige parametre som må kontrolleres nøye for konsekvent vellykkede transfections 10,11. Den mest kritiske parameter for kalsium fosfat transfeksjon er pH-verdien av 2x HBS, som i våre hender varierer vanligvis mellom 7,10 til 7,15. Vi anbefaler å lage tre grupper av aksjer med pH-verdier i 0,05 trinn å gjøre rede for forskjellen mellom pH-meter. Alternativt kan Clontech pattedyr transfeksjon kit gir 2x HBS som konsekvent gir god effektivitet. Vær oppmerksom på at pH-verdien i løsningen vil endre seg over tid, selv når den lagres i fryseren. Vi har generelt holde alikvoter av 2x HBS ved 4 ° C i opp til en måned, og ved -20 ° C i opp til ett år.
Den andre parameteren er pH i kulturmediet. For å holde dette konsekvent, N2.1 medium blir rutinemessig forutsetning av astroglial kulturer over natten, men ikke mer enn 24 timer. I tillegg prøver vi å bruke astroglial kulturer thpå er like i confluency. Bruken av gliaceller kondisjonerte media bidrar også redusere toksisitet til nerveceller i løpet transfeksjon. Kondisjonert medium blir ekvilibrert i inkubatoren før transfeksjon for å holde pH-verdien i overensstemmelse.
Størrelsen og tettheten av kalsiumfosfatbunnfall er nøkkelen til vellykket transfeksjon. Små utfellinger ville føre til lav transfeksjon effektivitet, mens store, klumpete utfellinger vanligvis føre til cytotoksisitet 10. For å sikre konsekvent kalsiumfosfat bunnfall formasjon, bruker vi periodisk virvling når blande DNA / CaCl 2 og 2x HBS 11. En annen mye brukt metode for miksing er gjennom blåser luftbobler ved hjelp av en Pasteur pipette 12. Vi har funnet at intermitterende virvling til å gi mer konsekvent presipitat dannelse, spesielt for små volumer av transfeksjon blandingen.
Andre variabler å vurdere omfatter kvaliteten på DNA, og alderen på nevrons. Vi finner at transfeksjon begynne å jobbe konsekvent når nevronene nå DIV2, men begynner effektiviteten å avta når nevronene er hinsides DIV10. Til slutt, helsen til nevrale kulturer selv representerer en annen viktig parameter. Vi finner bruken av coculture systemet for å være den beste måten å generere friske primære hippocampal kulturer. Hvis nervecellene er ikke sunt, vil de ikke overleve lenge etter transfeksjon. Med coculture system, kan lav tetthet neuroner overleve i opp til 3 uker etter transfeksjon, som muliggjør langtidsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen konflikter interessert erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NIH stipend NS065183 og oppstart midler fra Rutgers Robert Wood Johnson Medical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
