Summary
précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.
Abstract
précipitation au phosphate de calcium est une méthode pratique et économique pour la transfection de cellules en culture. Avec l'optimisation, il est possible d'utiliser cette méthode sur des cellules difficiles à transfecter comme les neurones primaires. Ici, nous décrivons notre protocole détaillé pour le phosphate de calcium transfection de neurones de l'hippocampe co-cultivés avec des cellules astrocytes.
Introduction
Neurones primaires sont l'un des types cellulaires les plus difficiles à transfecter car ils sont post-mitotiques et sont très sensibles aux changements des micro-environnement. Il existe quatre types de méthodes pour l'expression de gènes exogènes et ARN court en épingle à cheveux (shRNA) dans ces cellules une couramment utilisés. Chacun a ses propres avantages et inconvénients. Par exemple, l'électroporation est généralement effectuée sur les neurones fraîchement isolés 2, les cellules doivent être transférés dans des cuvettes pour la transfection. infection par le virus peut généralement atteindre un rendement très élevé 3, mais il est plus de main-d'œuvre et risqué pour les opérateurs. Beaucoup de réactifs de transfection médiée par un lipide sont disponibles dans le commerce, avec des degrés variables de succès dans les neurones et les différents niveaux de cytotoxicité.
la transfection au phosphate de calcium représente une méthode pratique et économique pour l'introduction de gènes étrangers dans les neurones. La méthode a été utilisée pour la première à introduire de l'ADN de l'adénovirus dans cel mammifèresls par Graham et Van Der Eb (1973) 4. La transfection a été réalisée en mélangeant du chlorure de calcium avec de l'ADN recombinant dans un tampon de phosphate. Ceci permet la formation de phosphate de l'ADN / de calcium précipite, qui, en cas de chute progressivement sur une monocouche de cellules, d'adhérer à la surface de la cellule, sont repris par endocytose et finalement pénétrer dans le noyau 5. Ce processus conduirait à l'expression de gènes étrangers introduits dans la cellule cible. Efficacité typiques de calcium gamme de transfection de phosphate entre 0,5-5% 6-8. Cependant, avec une optimisation soigneuse et constante de l'exécution du protocole expérimental, il est possible d'atteindre une efficacité de transfection de près de 50%. Nous décrivons ici notre protocole détaillé pour la transfection au phosphate de calcium de neurones hippocampiques primaires, qui sont co-cultivées avec des cellules astrogliales dans un format en sandwich 9.
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Protocol
Une. Préparation Rat Astrocyte Culture pour les milieux conditionnés et astrocyte-neurone co-cultures.
- Préparer dissection tampon (BSS, voir le tableau 1 pour la recette) et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Anesthésier les ratons nouveau-nés (P0-P2) avec de l'isoflurane dans un bécher de 500 ml.
- Lorsque les chiots sont immobiles, pulvériser avec 70% d'éthanol et décapiter.
- Retirez le cerveau.
- Tenez fermement la tête avec une paire de Dumont # 5 forceps, et utiliser des ciseaux fins de faire une incision médiane à travers la peau et le crâne.
- Exposer le cerveau en réfléchissant le crâne sur les côtés, et retirer le cerveau dans un plat contenant BSS froid.
- Séparer les hémisphères cérébraux du diencéphale et le tronc cérébral sous un microscope à dissection. Retirez soigneusement toutes les méninges en stabilisant le tissu avec une paire de pinces et en tirant doucement les méninges avec une autre paire de pinces.
- Recueillir tous les hémisphères in une boîte de 60 mm. L'utilisation de petits ciseaux, tissu mince aussi finement que possible. Puis transférer le tissu haché dans un tube conique de 50 ml.
- Ajouter 1,5 ml de 1% DNase I et 1,5 ml de 2,5% de trypsine et 12 ml de BSS (volume total de 15 ml) de cerveau. Incuber dans un bain d'eau agité pendant 15 min à 37 ° C. Pour assurer un bon mélange, le tube est tourbillonné à la main toutes les 5 min.
- Transférer le surnageant dans une passoire 70 um de cellule sur un nouveau 50 ml tube conique. Ajouter 3 ml de FBS à ce surnageant.
- Pour les morceaux restants, ajouter 13,5 ml de BSS et 1,5 ml 2,5% de trypsine et incuber au bain-marie en agitant pendant encore 15 minutes.
- Transférer le surnageant restant à travers le tamis de la cellule et de combiner avec le surnageant de l'étape 1.8.
- Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min pour sédimenter les cellules.
- Remettre en suspension les pastilles dans 5 ml de milieu gliales. Le surnageant peut être de nouveau centrifugé pour sédimenter les cellules restantes.
- Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
- Plaque cells à une densité de 1 x 10 7 par cm 2 flacon 150.
- Changer de support aux médias gliales frais le jour après l'étalement. Ensuite, nourrir les cellules deux fois par semaine avec les médias gliales.
- Lorsque les cellules ont atteint> 80% de confluence (environ 10 jours après placage), geler les cellules dans 90% de sérum de cheval et 10% de DMSO et maintenir les stocks dans l'azote liquide. Les cellules sont congelées à 2 x 10 6 par flacon. Environ 5 flacons peuvent être congelés dans chaque flacon.
- Environ 10-14 jours avant la mise en place de la culture de l'hippocampe, les cellules gliales sont étalées dans les stocks surgelés. Nous plaquons habituellement cinq plaques de 6 puits, ce qui est suffisant pour soutenir la croissance de 90 lamelles de neurones de l'hippocampe (trois lamelles couvre 15 mm rondes par puits). Nous plaquons également une huit à dix plats de 60 mm supplémentaires de cellules gliales, qui est utilisé pour le conditionnement de médias N2.1 pour la transfection. La veille de culture neuronale, les cellules doivent être nourris avec les médias NB27. Les astrocytes devraient idéalement être> 90% de confluence à eest le point. Nous constatons que la congélation réduit considérablement le nombre de cellules microgliales dans des cultures astrocytaires. Etant donné que l'augmentation neurotoxicité est observée lorsque la microglie est présent dans les cultures astrocytaires, on utilise toujours la culture astroglial préparé à partir de stocks congelés de co-culture avec les neurones.
2. Neuronale Culture
- Nettoyer les lamelles de verre de premier rinçage dans milliQ 2x de l'eau. Elles sont ensuite trempées dans de l'acide nitrique concentré pendant 24 heures, et on les rince avec de l'eau milliQ pendant au moins cinq fois au cours d'un total de 2 heures. Lamelles sont séchées et stérilisées par cuisson dans un four à 225 ° C pendant 6 heures.
- Transfert des lamelles couvre 60 mm plats après la stérilisation. Placer quatre points de paraffine stérile à proximité du bord extérieur de chaque lamelle afin de maintenir séparés des neurones au cours de la co-culture des cellules gliales.
- Enduire les lamelles de 1 mg / ml de poly-L-lysine dans un tampon borate 0,1 M pendant une nuit à 37 ° C incubateur.
- Le lendemain, rincez deux fois en lamelles m stérileilliQ eau pendant au moins 15 minutes à chaque fois. Ils sont ensuite incubés pendant la nuit dans les médias de placage à 37 ° C incubateur.
- Euthanasier rat enceinte (E18) par l'anesthésie isoflurane suivie par un pneumothorax, et euthanasier les rats embryonnaires par décapitation. Retirer le cerveau et disséquer les hémisphères cérébraux, comme décrit ci-dessus.
- Disséquer l'hippocampe de l'hémisphère cérébral. Placez tous les hippocampes dans un tube conique de 15 ml, et digérer avec 0,25% de trypsine (0,5 ml 2,5% de trypsine, 4,5 ml BSS) à 37 ℃ pendant 15 min.
- Hippocampes digérés sont rincées dans BSS 3x pendant 5 minutes chacun. Ils sont ensuite triturés avec une pipette Pasteur en verre, et la densité cellulaire est déterminée en utilisant un hématimètre. Les neurones sont ensuite ensemencées à une densité de 2 x 10 5 cellules par boîte de 60 mm.
- Environ 2-4 heures après le placage, le transfert des lamelles couvre avec les neurones attachés aux plats contenant des cellules astrocytes, avec les neurones vers le bas vers la glie. Au DIV3, ajouter la cytosine arabinoside à lales cellules à une concentration finale de 5 uM pour arrêter la prolifération des cellules gliales.
3. Calcium transfection
- Médias condition de N2.1 sur la glie le jour avant la transfection.
- Le jour de la transfection, les représentants des médias de N2.1 conditionné hors de la glie et transférer dans un nouveau plat. Transfert des lamelles couvre avec les neurones dans les médias de N2.1 conditionné. Laissez s'équilibrer dans l'incubateur pour 10-30 min.
- Pour une série de tubes stériles, combiner 1-4 ug d'ADN, 12,5 ul de 2 M de CaCl 2, et H 2 O stérile pour un volume total de 100 pl. À un second ensemble de tubes, ajouter 100 ul de HBS 2x.
- Ajouter le volume ⅛ de HBS 2x (12,5 pi) à la fois dans le tube contenant le mélange de CaCl2 / d'ADN, vortex pendant quelques secondes, à chaque fois. Laisser les tubes reposer pendant 15 min.
- Après 15 min d'incubation, ajouter goutte à goutte le mélange de transfection aux cellules. Incuber pendant 1-1,5 heures. Une couche de précipités de sable-comme doit être visiblesous le microscope en utilisant un objectif 10X.
- Après incubation, rincer lamelles fois avec du tampon de lavage chaud HBS.
- Retour à lamelles plats originaux avec des cellules gliales, ajouter de l'acide kynurénique à une concentration finale de 0,5 mM.
- Neurones transfectées peuvent être visualisés en direct ou traitées pour immunocytochimie dès le lendemain. Les neurones peuvent survivre jusqu'à trois semaines après la transfection.
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Representative Results
Lorsque les différents paramètres de transfection sont optimisés et contrôlés soigneusement de expérience à l'autre, il est possible d'obtenir des efficacités de transfection allant jusqu'à 50%. Figure 1 montre un domaine de neurones qui sont transfectées avec la GFP sur DIV4. Le champ contient un total de 28 neurones, parmi lesquels 16 ont été transfectées. Cela représente un rendement de plus de 50%. Un échantillon des autres champs de la même lamelle montre le rendement global est d'environ 50% (données non présentées). Avec le système de co-culture astroglial, les neurones demeurent en bonne santé et se développent normalement après la transfection. Figure 2 montre un neurone de l'hippocampe à DIV15, 10 jours après la transfection avec une construction PSD-95-GFP. Le neurone a développé de nombreuses épines dendritiques matures en forme de champignon, qui indique que les neurones sont en bonne santé. L'efficacité de transfection élevée et une toxicité minimale de ce protocole, il est un outil précieux pour l'étude des fonctions des gènes dans hippopotame primaireCampal neurones. Enfin, ce protocole peut potentiellement être adapté pour transfecter des cultures d'autres types de neurones dans le cerveau, ainsi que d'autres types de cellules difficiles à transfecter.
Figure 1. Neurones hippocampiques transfectées avec GFP à DIV4, montrent une grande efficacité de la transfection. 16 sur 28 neurones dans le domaine sont positifs. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Neurone hippocampique transfectées avec PSD-95-GFP à DIV15, montrant de nombreuses épines dendritiques matures en forme de champignon. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Tableau 1. Tampons / médias Recettes.
| Réactif | Composants |
| Gliale médias | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml de pyruvate de sodium, 100 mM 15 ml de 20% de glucose 25 ml de FBS (finale 5%) Sérum 25 ml de veau (finale 5%) 5 ml de pénicilline / streptomycine |
| 0,1 M tampon borate | 2,48 g d'acide borique 3,9 g de tétraborate de sodium (borax) 800 ml H2O milliQ pH avec du NaOH à 8,5 stériliser par filtration |
| Plaquage médias | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml de pyruvate de sodium, 100 mM 15 ml de 20% glucose 50 ml de FBS |
| NB27 médias | 485 ml Neurobasal médias 5 ml GlutaMAX 2 ml supplément de B27 (50x) |
| Dissection tampon (BSS) | 50 ml de HBSS 10x 5 ml de HEPES 1 M, pH 7,3 5 ml de pénicilline / streptomycine 440 ml H 2 O |
| N2.1 médias | 425 ml MEM 5 ml GlutaMAX 5 ml de pyruvate de sodium, 100 mM 15 ml de 20% de glucose 50 ml d'ovalbumine à 1% dans du MEM 5 ml supplément N2 |
| 2x solution saline tamponnée HEPES (HBS), stérile | 274 mM NaCl 9,5 mM KCl 15 mM de glucose 42 mM d'HEPES 1,4 mM Na 2 HPO 4 Préparer des lots de 3 différents pH (7.05, 7.10, 7.15) |
| Tampon de lavage (HEPES solution saline tamponnée) | 50 ml de HBSS 10x 5 ml de HEPES 1 M, pH 7,3 445 ml H 2 O |
| 50 mM d'acide Kynurenic | Dissoudre 0,473 g d'acide kynurénique en 1x PBS. Ajouter quelques gouttes de NaOH à obtenir dans la solution. Ensuite, utilisez HCl pour ajuster le pH à 7,0 dos |
Tableau 2. Ligne du temps pour la préparation de la culture.
| Jour | Action |
| Avant de commencer | Préparer la culture des astrocytes et des cellules geler vers le bas. Un lot de la culture des astrocytes peut généralement supporter plusieurs mois de cultures hippocampiques. |
| Semaine 1 Lundi | Décongeler les astrocytes. |
| Semaine 1 Mardi | Nourrir les astrocytes. |
| Semaine 1 vendredi | Nourrir les astrocytes. |
| Semaine 2 Lundi | Nourrir les astrocytes. Rincer lamelles en H 2 O, puis faire tremper dans de l'acide nitrique pendant 24 heures. |
| Semaine 2 Mardi | Rinsoi lamelles couvre-5x. Stériliser sec lamelles. |
| Semaine 2 mercredi | Placez des points de paraffine sur des lamelles. Manteau de lamelles couvre-objet avec de la poly-L-lysine. |
| Semaine 2 jeudi | Rincer lamelles recouvertes de H2O stérile, puis incuber lamelles en placage médias nuit à 37 ° C. Changer de support sur les astrocytes à NB27. |
| Semaine 2 Vendredi | Dissection de l'hippocampe et le placage. |
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Discussion
Il ya plusieurs paramètres clés qui doivent être soigneusement contrôlée pour transfections toujours réussies 10,11. Le paramètre le plus critique pour la transfection au phosphate de calcium est la valeur de pH de 2 x HBS, qui dans nos mains varie habituellement entre 7.10 à 7.15. Nous vous conseillons d'effectuer trois lots de stocks avec des valeurs de pH par pas de 0,05 pour tenir compte de la différence entre les pH-mètres. Autrement, le kit de transfection mammifère Clontech fournit 2x HBS qui donne toujours un bon rendement. Gardez à l'esprit que le pH de la solution va changer au fil du temps, même lorsqu'ils sont stockés dans le congélateur. Nous conservons généralement aliquotes de 2x HBS à 4 ° C pendant un mois, et à -20 ° C pendant jusqu'à un an.
Le second paramètre est le pH du milieu de culture. Pour garder ce, milieu de N2.1 cohérente sont systématiquement conditionné sur les cultures astrocytes nuit mais pas plus de 24 h. En outre, nous essayons d'utiliser des cultures astrocytes esont semblables à de la confluence. L'utilisation des médias gliales conditionné permet également de réduire la toxicité pour les neurones pendant la transfection. Les milieux conditionnés sont équilibrées dans l'incubateur avant la transfection pour maintenir le pH constant.
La taille et la densité des précipités de phosphate de calcium est essentiel pour une transfection réussie. Petits précipités conduirait à une faible efficacité de transfection, alors que les grandes, précipités clumpy conduisent généralement à la cytotoxicité 10. Pour assurer la formation de phosphate de calcium précipité cohérent, nous utilisons vortex intermittente lors du mélange de l'ADN / CaCl2 et 2x HBS 11. Une autre méthode couramment utilisée pour le mélange se fait par soufflage des bulles d'air à l'aide d'une pipette Pasteur 12. Nous avons trouvé le vortex intermittent pour obtenir la formation de précipité plus cohérente, en particulier pour les petits volumes de mélange de transfection.
D'autres variables à prendre en considération comprennent la qualité de l'ADN, et l'âge de la neurons. Nous constatons que la transfection de commencer à travailler systématiquement lorsque les neurones atteignent DIV2, mais l'efficacité commence à diminuer lorsque les neurones sont au-delà DIV10. Enfin, la santé des cultures de neurones eux-mêmes constitue un autre paramètre important. Nous trouvons l'utilisation du système de co-culture pour être le meilleur moyen de générer des cultures d'hippocampe primaire sains. Si les neurones ne sont pas en bonne santé, ils ne survivront pas longtemps après transfection. Avec le système de co-culture, les neurones de basse densité peuvent survivre pendant jusqu'à 3 semaines après la transfection, ce qui facilite les études de longue durée.
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Disclosures
Aucun conflit d'intéressé déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par NIH NS065183 et des fonds de démarrage de l'École de médecine de Rutgers Robert Wood Johnson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
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