Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Дрожжи люминометрическим и Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

В дополнение к часто используемые методы для изучения TRPV4 х, два метода описаны: Его mechanosensitivity можно изучать с помощью Ca 2 +-экворин luminometry в трансгенных дрожжей при гипоосмотического вызов. Она также может быть рассмотрен в TRPV4-РНК вводили Xenopus ооциты по цельноклеточной два электрода напряжения или зажима патч зажим в режиме он-клетки или вырезали режиме.

Abstract

TRPV4 (переходных рецепторов потенциалы, ваниллоидных семьи, тип 4) широко экспрессируется в позвоночных тканей и активируется несколько стимулов, в том числе с помощью механических сил. Некоторые мутации TRPV4 вызвать сложную наследственную кость или нейронные патологии у человека. Дикого типа или мутантный TRPV4 трансгены, как правило, выражается в культивируемых клетках млекопитающих и исследовали на Fura-2 флуорометрии и на электродах. С точки зрения механизма mechanosensitivity и молекулярных основ заболеваний, в современной литературе является запутанным и противоречивым. Чтобы дополнить существующие методы, мы опишем два дополнительных метода для изучения молекулярных свойств TRPV4. (1) Крыса TRPV4 и экворин трансген превращаются в почкующихся дрожжей. Гипо-osmtic шок населения трансформированного дает сигнал люминометрическим из-за комбинации экворин с Ca 2 +, выпущенный через TRPV4 канала. Здесь TRPV4 изолирован от своих обычных млекопитающих белков-партнерови показывает свой собственный mechanosensitivity. (2) кРНК из TRPV4 вводят в Xenopus ооцитах. После соответствующего периода инкубации, макроскопический ток TRPV4 рассматривается с зажимом напряжения двух электродов. Сегодняшний рост после удаления инертного осмотикум от ооцитов ванной свидетельствует о mechanosensitivity. В микроампер (10 -6 до 10 -4) токи от ооцитов гораздо больше, чем subnano к nanoAmpere (10 -10 -10 -9) токов от культивируемых клеток, уступая более четкие количественными и увереннее оценки. Микроскопические токи, отражающие деятельность отдельных белков канала также может быть непосредственно не зарегистрированы в патч зажим, в на-клетки или вырезали режиме. То же ооцитов предоставляет несколько образцов патч, позволяющий репликацию лучше данных. Всасывает, применяемые к патчей может активировать TRPV4 непосредственным образом оценить mechanosensitivity. Эти методы также должны быть полезны при изучении других типов каналов ГТО.

Introduction

TRPs (переходные потенциалы рецепторов) состоят из семи подсемейства катионных каналов, которые служат сенсорные функции 1,2. У млекопитающих TRPV, ваниллоидных подсемейство TRPs, имеет шесть разновидностей. TRPV4 (тип 4) 3,4 реагирует на тепло, некоторые химические вещества, осмотическое набухание или напряжения сдвига. Ген TRPV4 неоднократно выделяли кандидата-гена и / или экспрессии клонирования 5-8. Последний метод следуют ответа гена продукта к гипо-осмолярности. TRPV4 выражается в почти всех органов и функций в области развития, физиологии, или патологии многих разрозненных типов клеток 3,4.

Поразительные являются> 50 человеческих аутосомно-доминантных мутаций TRPV4, вызывая периферические невропатии и / или скелетной дисплазии (аномалии в развитии скелета) 9-11. Варьироваться Скелетные дисплазии от легкой типа brachyomia 3 (тип-3 карликовость), spondylometaphyseal дисплазия типа Козловски, чтобы Севповторно дисплазии, некоторые в результате чего у новорожденных или эмбриональную смерть. Хотя все манеры механизмов представляется возможным, никто не объясняет разнообразие, сложность, изменчивость, и случайные совпадения этих заболеваний 4.

Как и другие каналы ГТО 1, TRPV4 представляет собой тетрамер. В крысы или человека TRPV4, каждый субъединицы состоит из 871 остатков. Его центральным элементом является шесть трансмембранных спиралей а (S1-S6), которые, вероятно, расположенных в аналогично напряжения закрытого К + каналов. Там, S1-S4 образуют периферийную область и S5 и S6 формируют домен проникновение пор. Между S5 и S6 TRPV4 находится в нескольких минутах спираль пор следуют LDLFKLTIGMGDL последовательности, четыре из которых предположительно сходятся, чтобы сформировать катионов фильтр. 470-остаток N-концевой цитоплазматический сегмент содержит 6 повторов анкириновых, известные связывать белки или небольшие лигандов. С-терминальная 152-остаток цитоплазматический сегмент включает последовательность калмодулина связывания среди других возможных мест, которые связывают OTее элементы 3.

TRPV4 является катионом канал, который по сути исключает анионы 1. В то время как его физиологическая функция заключается в трансдукции стимулы к Са 2 + притока, это также проницаемым для других катионов с последовательностью проницаемость Эйзенман IV, в пользу двухвалентный на P Ca: P Na ~ 7 12. Одноканальный проводимость исправляет при ~ 90 л.с. наружу и ~ 40 пСм внутрь 6,13,14. Гетерологично выразил тока (см. ниже) может быть активирован гипоосмотического отек, напряжение сдвига, или тепла 15. Он также активируется полиненасыщенных жирных кислот и 16,17 синтетический эфир phorbal 4αPDD 18. В настоящее время самым мощным агонистом является GSK1016790A 19 и антагонист GSK2193874, эффективным в 10 -9 до 10 -8 М 20, как обнаружил высокой пропускной, малого молекулярного экрана.

Два ключевых направления TRPV4 исследований остаются в заблуждение: (1) В то время как TRPV4 в значительной степени изучена его mechanosensitivity, его молекулярная основа является спорным. Одна модель описывает гипо-осмолярность как-то активирует фосфолипазу А2 (PLA2), чтобы получить полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) арахидоновой кислоты (AA), которое превращают в epoxyeicosatrienoic кислоту (EET) с помощью epoxygenase, и связывание EET активирует TRPV4 16, 17. Тем не менее, сама TRPV4 было показано, что непосредственно реагировать на мембранного участка 14 (см. ниже), что обеспечивает более простое объяснение. (2) TRPV4 мутантные патологии недоумение. В основе, необходимо знать, являются ли заболевания в связи с потерей, сокращение или увеличение деятельности канала. Даже здесь, в литературе далеко не ясно. В то время как несколько аллелей скелетно-дисплазия, как сообщалось, имеют более высокие деятельность, (прибыль-из-функции, ГОФ) 4,21, несколько, как сообщалось, сократили деятельность (с потерей функции, LOF) 10,22. Систематическое изучение 14 аллелей нашел, что онивсе будет Гоф мутации (ниже) 23. Утверждение, что некоторые из них МВУ, кажется, противоречит фенотип TRPV4-/ - нокаутом мыши, которые являются жизнеспособными или плодородная, с незначительными дефектами, несмотря на полную потерю функции TRPV4.

Часть этих противоречий имеет методологическое происхождение. Лаборатории используют различные методы, или варианты одного метода, и используют различные стандарты судейства. Чаще всего, TRPV4 временно экспрессируется в культивируемых клетках млекопитающих (НЕК, СНО, HeLa) и рост внутреннего [Ca 2 +] на агониста или гипотонического стимуляции зарегистрирован в +-чувствительного флуоресцентного красителя Ca 2, Фура-2. Чрезмерная зависимость от этого флуорометрического анализа был подвергнут критике 1. Уровень экспрессии в различных популяций, распределение в нем, а также эффективная концентрация красителя, необходимо контролировать и документированы. Надежнее прямые электрофизиологические исследования. Даже это, как commonlу практикуется, тоже не без проблем. Потому что уровни экспрессии в отдельных культурах клеток трудно контролировать, цельноклеточные токи имеют большие изменения. Кроме того, поскольку токи малы, надежные статистические данные должны будут полагаться на больших выборках, часто не практические. Патч-зажим экзамены редко выполняется. Некоторые такие записи показывают кластеры всплесков активности, которые делают статистическая оценка сложной 16,17.

Чтобы лучше понять молекулярную mechanosensitivity, мы разработали два дополнительных систем для изучения TRPV4. (1) Для выделения TRPV4 от своих обычных партнеров млекопитающих, мы выразили крысы TRPV4 у почкующихся дрожжей 24. Функциональная выражение TRPV4 в этом эволюционно далеком контексте показал, что она все еще ​​может реагировать на осмотического силу без его обычных партнеров. Поскольку дрожжи не дает никаких ПНЖК, таких как АА или EET, и его геном не имеет PLA2 или epoxygenase гены, этот Expression также показывает, что они не требуются для TRPV4 ощутить силу. Имея TRPV4 в молекулярных биологически наиболее поддающихся эукариот также позволяет эффективно вперед или реверс-генетических манипуляций 25. (2) Для углубленных биофизических анализов TRPV4, мы выразили TRPV4 в Xenopus ооциты. В отличие от культивируемых клеток, которые дают суб-на Н. А. (10 -10 до 10 -9 А) токов, ооцитов выражает токи в мкА'S (10 -6 до 10 -4). Намного больше, сигнал над шумом позволяет лучше количественную и более уверенно сравнение. TRPV4, так выражены, также можно рассматривать как отдельных молекул с помощью патч-зажим. Один ооцитов позволяет выборки повторный патч, снова делая количественное надежнее. Такие исследования показали, что сама TRPV4 канал непосредственно может быть активирован мембрана эластичного силу 14. Анализ также показал, что 14 представительств аллели скелетно-дисплазия все мутации нарушающие функции мутации. Кроме того, градEE этого учредительного Са 2 + утечки параллельно тяжесть скелетных заболеваний 23.

Из-за их новизны и полезности, подробные процедуры этих двух методов собрались здесь, чтобы репликаций в будущих исследованиях на TRPV4 или аналогичных каналов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Методы Дрожжи Luminometry

Используйте деформации BYYT из Saccharomyces Cerevisiae. Это yvc1-tok1-производная BY4741 (Мата, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Трансформировать клетки с Leu выбираемых экворин-экспрессирующих плазмид pEVP1/Aeq и СУР выбираемых крысы TRPV4-экспрессирующих плазмид p416GPDV4, как описано в Batiza соавт. 26 и Loukin соавт. 24 Используйте стандартные методы строительства и трансформации плазмидной 27 . Дрожжевой штамм и плазмиды предоставляются по запросу.

  1. Культура 2 мл дрожжевых клеток в течение ночи в пост-логарифмической фазе в шейкере 30 ° C в лей-ура-"ДКД" отсева среды 28 (сульфат обедненный вариант CMD-лей-ура среды 29), с добавлением 1 М сорбит . Инокулировать 200 мкл этих культур в 1,8 мл свежей среде, дополненной 2 мкМ Luciferiн целентеразин. Растут в темноте при комнатной температуре в течение еще 24 часов без встряхивания.
  2. Измерьте осмолярность культуры (как правило, на 1400 мосм) и другие решения (см. ниже) с использованием осмометра давления паров.
  3. Аликвоты 20 мкл свежей культуры в 12 мм люминометра трубки для одного люминометра трубки.
  4. Для гипотонической, добавить 200 мкл раствора, содержащего 25 мМ NaEGTA (рН 7,2) или имена (рН 7,2) и 500-100 мМ NaCl, (общая осмолярность 1,200-400 мОсм) в зависимости от степени шока желаемого. Постоянно следить за свечение до и по крайней мере 120 сек после осмотического downshock, прерываемая лишь краткой работы разбавления. Регистрация выход люминометра на настольном компьютере в качестве относительных единицах люминесценции (RUL).

Хотя это и не для изучения трансгенных TRPV4 мы использовали вариант вышеуказанного протокола в автоматизированной системе для изучения реакции большого числа штаммов дрожжей. Исследование ое ответы на гипо-30 или гиперосмотических 31 стимулов дрожжевого deletome (коллекция 4906 дрожжей одного гена deletants) с использованием микропланшет люминометра и проанализированы с соответствующим программным обеспечением успешно.

2. и 3. Ооцитов электрофизиологии Методы

Электрофизиологии использует основные методы 32. ПЦР-амплификации открытым рамку считывания дикого типа или мутант TRPV4 Использование высококачественных PfuUtra полимеразы и интегрированы в pGH19 33 в. Это влечет за собой точную вставку ORF между 5 'и 3'-НТО этого β-глобина гена и ниже по потоку от Т7 РНК-полимеразы промотора Xenopus. Линеаризовать конструкцию ниже по потоку от UTR 3'и использованы в качестве моделей в пробирке Т7 РНК-полимеразной реакции в. Используйте стандартные молекулярно-биологические методы 34.

Используйте этап V-VI ооцитов от X. Laevis. Животноводство, частичное ovariectoмой, удаление конверт defolliculation и желточный следовать стандартным процедурам 32,33,35. Введите 2-40 нг кРНК решения на ооцит с использованием автоматического microinjector Драммонд Nanoinject II. Введите ~ 30 ооцитов для каждой серии экспериментов. После TRPV4-кРНК инъекции, инкубировать ооцитов в среде ND96 с гентамицином (100 мкг / мл) и 1 мкМ рутений красный 14.

2. Два электрода Напряжение Зажим

  1. Потяните боросиликатного записи стекло пипетки из прецизионных одноразовых 100 мкл микропипеток индивидуально с пипетки съемник.
  2. Потяните оба измерения напряжения и тока-инъекционных электроды пипеток тянут иметь наконечник апертуру ~ 1 диаметром мкм.
  3. Засыпки электроды с 2 М KCl в результате 0,1-0,2 мОм сопротивления. Установите их на HS2A головкам, которые вместе с VG-2Ax100 виртуальной обоснованным зажима ванны, подключенных к интерфейсу GeneClamp 500 усилителя через Digidata 1440 дигитайзер. Приобретать данных с помощью программного обеспечения pClamp10.
  4. Поместите яйцеклетки, которые будут проверены в ванну с 1 мл в сфабрикованному пластиковой камере, установленной на этапе вскрытии микроскопом с 20-кратным увеличением. Решение ванна виртуальной заземлен 3 М KCl агар моста и хлорированной серебряной проволоки, расположенного вблизи яйцеклетки и подключенного к виртуальной первом этапе VG-2A.
  5. Построить камеру для непрерывной перфузии с пластиковыми шлангами, как входе раствора и выходе. Подключение впускной трубопровод соединен с изготовленного перфузии системы, которая представляет собой коллектор из шести 50 мл шприц оболочек, заполненных с другим решением. Гравитация скорости подачи любого частного решения контролируется до ~ 2-3 мл / мин с использованием "Кек" рампа зажимы на насосно-компрессорных труб.
  6. Установите оба электрода с их головкам на микроманипуляторов. Выполните электродов проникновение ооцита на микроманипуляций.

3. Патч зажим Экспертиза Direct Mechanosensitivity

"> Основные методы патч зажима включая подготовку пипетки, формирование ГОм-уплотнения и формирования на-клетки или вырезанных режимов являются те, в Хэмилл и др.. 36 и Конн 32.

  1. Заполните стеклянные пипетки боросиликатного с отверстием ~ 1 мкм диаметром на конце (пузырчатая числа 5-6) с 98 мм KCl, 1 мМ MgCl 2, и 10 мМ К +-HEPES, рН 7,2.
  2. Прикрепите патч зажим пипетку через пластиковых труб до 5 мл шприц и через тройник, также с манометром. Используйте компьютер для обработки как электрод и манометр выходов. Приобретать данные на 10 кГц, а затем воспроизводить через фильтр восемь-полюсный Бесселя на частоте 1 кГц для анализа.
  3. Различные участки могут быть вырезан из одного ооцита повторно. Эта практика делает изучение молекулярной активности TRPV4 в более эффективным и надежным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В типичном эксперименте luminometry, диапазон 400-1200 мОсм гипотонических вниз потрясений достигается путем добавления 200 мкл ударных решений разного низкой осмолярности к 20 мкл культуры в 1400 мОсм. TRPV4 активность очевидна, когда RLU экспериментальных сравнивается с двух отрицательных контролей: дрожжевых клеток, трансформированных пустым p416GPDV4 плазмиды или тот, который содержит ген TRPV4 с мутацией в ионном фильтра (рис. 1) 24.

В типичной два электрода напряжения зажим эксперименте, ооциты первоначально моют в изотоническом растворе, протекающей ванне, содержащей (в мм) 66 KMeSO 4, 1,8 Ba (MeSO 4) 2, 5 K +-HEPES, (рН 7,2) и 100 сорбит. Пиковые токи оценивали в конце 100 мс испытательных импульсов на 20 мВ от удерживающего потенциала -20 мВ каждые 10 сек. Чтобы вызвать реакцию гипотонические подачи изменяется на аналогичное решение не хватает сорбит. Т его гипотоническая реакция обратима после возвращения сорбита, а также блокирующийся ГТО-канала блокатор рутения красного (рис. 2А).

В типичном эксперименте патч-зажим, симметричное решение используется, т.е. раствор купание патч пипетки и заполнение решение то же самое (98 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, и 10 мМ K +-HEPES, рН 7,2). Здесь наизнанку патч вырезали из выражения яйцеклетки крыса-TRPV4 проводится в 50 мВ. Импульсы всасывания генерируются из шприца. Краткие приемные патрубки, сотни мс в продолжительности, применяется в десятки мм рт.ст., вызывает такую ​​~ 40 пс унитарное проводимости родным для ооцитов мембраны 37 и ~ 90 л.с. унитарного проводимости гетерологично выраженной TRPV4 (рис. 2В) 14.

les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 1. Крыса TRPV4 выражается в дрожжевой реагировать на гипотонической. (А)-схема, показывающая экспериментальные методы. (В) 750 мосм гипотоническая шок (наконечники стрел) вызывает значительное увеличение люминесценции (в относительных единицах люминесценции, РОС) в TRPV4 трансформантов, но не в трансформантов пустой плазмиды, или плазмиды несущий TRPV4 с мутацией в его ионного фильтра (M680K). (C) доза-ответ соотношение между гипотонического шока и максимальной чувствительностью (средний + SD, п = 3). Измерения от 2,4 х 10 6 клеток друг 24. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

0px "/>
Рисунок 2. Электрофизиологические обследования TRPV4 деятельности гетерологично выразил Xenopus ооциты. (A) Целые-ооцитов макроскопические тока ответы на гипотонических стимулов обследованных с помощью зажима напряжения двухэлектродной. Пиковые токи от ооцита, экспрессирующие очень высокие уровни дикого типа TRPV4 (5 дней после инъекции 40 нг кРНК) после 100 шагов мс напряжения (от -20 до +20 мВ через каждые 10 сек) (вставка) в ответ на удаление 100 мМ сорбита из раствора 250 мосм ванны (открытые бары) и добавлением 3 мкм рутения красного (рублей; заполненной бар). Наглядный являются повторные пикового тока увеличивается при гипотонических стимулов и ее уменьшается при возвращении в изотонический раствор или добавления канала блокатор (рублей). (В) Прямая активация дикого типа TRPV4 по мембранной участке видел под патч зажима. Образец сырья следов среднего качества из патча вырезали из TRPV4-expreesssing яйцеклетки, показывая Activation на 60 мм рт всасывания (нижний луч) применяется к подакцизным наизнанку патч состоявшейся в 50 мВ. Самый верхний след отображается более быстрыми временной базы, чтобы показать унитарное текущий переход между закрытого (C) и два открытых уровней (О 1 и О 2) 14. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как указано во введении, методы, обычно используемые для изучения функций TRPV4 иногда приводило к несогласованности и противоречия. Два набора методов, описанных здесь предлагают некоторые преимущества и могут дополнять существующие методы. В то время как мы описываем только исследования по TRPV4, методы, может быть продлен для изучения других ионных каналов, а также.

1. Методы Дрожжи Luminometry

Многообещающая дрожжей имеет родное Ca 2 +-притока ответ на гипоосмотического шока, который сенсибилизированного мутаций, которые влияют на липидный состав 30. Этот сигнал может быть стерта с внешней ЭГТА. Этот хелатор, однако, не стирает сигнал от гетерологично выраженной TRPV4 24, что указывает, что канал выражается во внутренней мембране, наиболее вероятно, что из эндоплазматического ретикулума, из которого Ca 2 + высвобождается в цитоплазму от осмотического шок. Движение гетерологично выразилканалы не изучен в дрожжах. Если этот метод быть продлен к изучению других каналов ГТО или других предполагаемых механочувствительных каналов, тест отравлений необходимо проводить и присутствие родной системой иметь в виду.

2А. Двухэлектродная Зажим Напряжение

В отличие от эксперимента патч-зажим, два электрода напряжения зажим эксперимент проводили на интактных ооцита, перед удалением желточной оболочки. Оба микроскопическое исследование и значения емкости показывают, что плазматическая мембрана не является равномерно сферические, но высока инвагинировать под относительно неупругого сфере желточной конверте. Таким образом, механическое напряжение, вызванное hyponicity не просто изотропный инфляционное напряжение расширенном сферической мембране. Стресс вероятные результаты прессования мембраны против сдерживающим желточной конверт и / или от установленного цитоплазматической вложения в гое лицо повышенной осмотического давления.

Выражение TRPV4, и, вероятно, некоторые другие каналы, является токсичным для яйцеклетки, по-видимому из-за Ca 2 + утечки. Поэтому важно, чтобы постоянно инкубировать ооцит после TRPV4-кРНК инъекции в присутствии блокатора канала, рутений красный. Степень выражения TRPV4 показывает изменчивость, которая не полностью под экспериментального контроля. "Прирост-из-функции" мутантные TRPV4 каналы, те, которые показывают значительное спонтанное открытие, систематически высказывались и раньше после инъекции, чем их дикого типа коллегой 23.

2B. Патч зажим

Xenopus ооцитов выражает нативный механочувствительных канал, который корректирует в направлении внутрь (~ 50 пс внутрь, ~ 10 пс наружу). Одно исследование показывает, что это является выражением TRPC1 37. Это постоянно выразил родным канал обеспечивает калибровку для TRPV4, гетероlogous выражение, которое может не всегда быть успешно наблюдается на отдельных участках.

Вероятность столкновения TRPV4 как правило, выше в ооцитах после длительного периода инкубации, как правило, через 3-4 дня после инъекции кРНК. Эффективный способ продолжить это в первую очередь выполните двухэлектродный напряжением зажим эксперимент (см. выше), убедившись, что яйцеклетка выражает спонтанное TRPV4 макроскопического тока, а затем принять меры для исключения желточной конверт, прежде чем принимать образцы патчи из того же ооцитов. Вероятность захвата TRPV4 деятельность также может быть повышена с помощью "macropatches", установленный на пипеток с большими отверстиями (пузырь число 6-7). Огонь полировки эти пипетки 32, кажется, чтобы быть полезным в достижении ГОм печать. После образования уплотнения, вырезали пластырь может показать очень высокое сопротивление, очень мало шума обычно связаны с биологическими мембранами, а не на родном канал активности. Это, скорее всего, вdicates образование двойного мембраны. Кратковременное воздействие воздуха, по временно поднимая выше мениска по микроманипуляций пипетку, как правило, разорвать нежелательные дополнительный слой. Кроме того, наружный слой может быть удален, осторожно касаясь пипетки отверстие против нити закаленной уплотнением силиконовой взвешенных в ванне.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Андреа Kremsreiter за отличную техническую помощь. Работа в нашей лаборатории поддерживается NIH GM096088 и Вилас Trust университета Висконсина - Мэдисон.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
  2. Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
  3. Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
  4. Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
  5. Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
  6. Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
  7. Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
  8. Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
  9. Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
  10. Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
  11. Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
  12. Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
  13. Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
  14. Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
  15. Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
  16. Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
  17. Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
  18. Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
  19. Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
  20. Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  21. Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
  22. Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
  23. Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
  24. Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
  25. Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
  26. Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
  27. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  28. Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  29. Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
  30. Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
  31. Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  32. Conn, P. M. Methods in Enzymology. 294, Academic Press. (1999).
  33. Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).
  34. Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
  35. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
  36. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  37. Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).

Tags

Основной протокол выпуск 82 Eukaryota археи бактерии науки о жизни (Общие) Mechanosensation Ионные каналы липиды патч зажим, дрожжи luminometry сила зондирование зажим напряжения TRPV4 электрофизиологии
Дрожжи люминометрическим и<em&gt; Xenopus</em&gt; ооцитов Электрофизиологические Экзамены молекулярной Mechanosensitivity из TRPV4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter