Maya lüminometrik ve<em> Xenopus</emTRPV4 Moleküler Mechanosensitivity arasında> Yumurta Elektrofizyolojik Sınavları
Summary
TRPV4 en incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemler tamamlamak için, iki yöntem tarif edilmiştir: Onun mechanosensitivity hipo-ozmotik tehdidi üzerine transgenik maya Ca 2 +-akorinden luminometri ele alınabilir. Ayrıca TRPV4-RNA incelenebilir on-hücre ya da kesilmiş modunda kelepçe bütün hücre iki elektrotlu voltaj kelepçe veya yama ile Xenopus oosit enjekte edilir.
Abstract
TRPV4 (geçici reseptör Potansiyelleri, vanilloid etti, tip 4) omurgalı dokularda yaygın olarak ifade edilir ve mekanik kuvvetlerin de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlar tarafından aktif hale gelir. Bazı insan mutasyon TRPV4 karmaşık kalıtsal kemik veya nöronal patolojiler neden olur. Vahşi tip ya da mutant TRPV4 transgenler yaygın olarak kültürlenmiş memeli hücrelerinde ifade edilir ve Fura-2 fluorometri ile ve elektrotlar ile incelenir. Mechanosensitivity ve hastalıkların moleküler bazların mekanizması açısından, mevcut literatür kafa karıştırıcı ve tartışmalıdır. Varolan yöntemler tamamlamak için, biz TRPV4 moleküler özelliklerini incelemek için iki ek yöntemleri açıklanmaktadır. (1) Rat TRPV4 ve aequorin transgen tomurcuklanma maya içine transforme edilir. Transformant nüfusunun hipo-Osmotik şok TRPV4 kanalı üzerinden serbest nedeniyle, Ca 2 + ile aequorin kombinasyonuna lüminometrik bir sinyal verir. İşte TRPV4 her zamanki memeli ortak proteinlerin izole edilirve kendi mechanosensitivity ortaya koymaktadır. (2) TRPV4 of cRNA Xenopus oositlerine enjekte edilir. Uygun bir inkübasyon süresinden sonra, makroskopik TRPV4 mevcut bir iki elektrodlu voltaj kelepçe ile incelenir. Oosit banyosundan atıl ozmotikum uzaklaştırılması üzerine akım yükselme mechanosensitivity göstergesidir. Oositlerden mikroamper (10 A -4 -6 ila 10) akımları net quantifications ve daha emin değerlendirmeler, sonuçta kültürlenmiş hücrelerden nanoAmpere subnano-to (10 -10 A -9 10) akımları çok daha büyüktür. Tek kanal proteinlerin faaliyetlerini yansıtan mikroskobik akımlar da doğrudan doğruya-hücre ya da eksize modunda, bir yama kelepçe altında kayıtlı olabilir. Aynı oosit daha iyi veri replikasyonu sağlayan, birden fazla yama örnekleri sağlar. Yamalar uygulanan emmelerde doğrudan mechanosensitivity değerlendirmek TRPV4 etkinleştirebilirsiniz. Bu yöntemler aynı zamanda TRP kanallarının diğer tip çalışmaya faydalı olmalıdır.
Introduction
TRPS (geçici reseptör potansiyeller) duyusal fonksiyonları 1,2 hizmet katyon kanallarının yedi alt familyaya oluşmaktadır. Memeliler, TRPV olarak, TRPS en vanilloid alt ailesi, altı çeşidi vardır. TRPV4 (tip 4) ısı 3,4 cevap verir, bazı kimyasallar, ozmotik şişme, ya da kayma gerilmesi. TRPV4 gen tekrar tekrar aday geni ve / veya 5-8 ifade klonlama ile izole edilmiştir. Bu ikinci yöntem, hipo-ozmolarite gen ürün tepkisini takip etti. TRPV4 çok farklı hücre tipleri 3,4 gelişimi, fizyoloji, herhangi bir patolojinin hemen hemen tüm organ ve işlevler cinsinden ifade edilir.
Çarpıcı periferal nöropatiler ve / veya iskelet displazileri (iskelet gelişiminde anormallikler) 9-11 neden> 50 insan otozomal dominant TRPV4 mutasyonlar. Iskelet displazisi aralığında hafif brachyomia tip 3 (tip-3 cücelik), spondylometaphyseal displazi Kozlowski tipi, seve dandisplaziler yeniden, bazı neonatal veya embriyonik ölüme neden olur. Mekanizmaların tüm görgü olası görünüyor olsa da, hiçbiri çeşitlilik, karmaşıklık, değişkenliği ve bu hastalıkların 4 zaman zaman çakışmalar açıklıyor.
Diğer TRP kanalları 1 gibi, TRPV4 bir tetramerdir. Sıçan ya da insan TRPV4 olarak, her bir alt birim 871 artıkları oluşmaktadır. Bu temel öğesi altı transmembran olası voltaj kapılı K + kanallarının benzer bir şekilde düzenlenmiş olan bir heliks (S1-S6) 'dir. Orada, S4 S1 çevresel bir etki oluşturur ve S5 ve S6 geçirgenlik, gözenek alanı oluşturur. S5 ve TRPV4 ve S6 arasında muhtemelen katyon filtre oluşturmak için yakınsama dört hangi dizisi LDLFKLTIGMGDL, ardından kısa bir gözenek sarmal olduğunu. 470 artıklı N-terminal segmenti sitoplazmik proteinler ya da küçük ligandların bağlandığı bilinen 6 ankirin tekrarı içerir. C-terminal 152-bakiye sitoplazmik kademeli ot bağlanan diğer olası siteler arasında bir kalmodulin-bağlayıcı sekansı içerirOnun elemanları 3.
TRPV4 esasen 1 anyonları hariç bir katyondur kanalıdır. Fizyolojik fonksiyonu Ca 2 + akınına uyaranlara transdüksiyonu için olsa da, bir P Ca iki değerli lehine, aynı zamanda bir Eisenman IV geçirgenlik sekansı ile diğer katyonlar geçirgen: P Na ~ 7 12. Tek kanallı iletkenliği ~ 90 pS dışa ve ~ 40 PS içe 6,13,14 de düzeltilir. Heterolojik ifade (aşağıda) akım hipo-ozmotik şişme, kayma gerilmesi, ya da sıcaklık 15 ile aktive edilebilir. Ayrıca, çoklu doymamış yağ asitleri 16,17 ve sentetik phorbal ester 18 4αPDD tarafından aktive edilir. Şu anda, her ikisi de, yüksek verim, küçük moleküllü ekran tarafından keşfedilen 10 -9 -8 10 M 20 etkili, en güçlü agonist GSK1016790A 19 ve antagonist olan GSK2193874.
TRPV4 araştırma iki anahtar alanlar kafa kalır: (1) TRPV4 büyük ölçüde mechanosensitivity için çalışılmıştır bile, moleküler temeli tartışmalıdır. Bir model, hipo-osmolarite herhangi bir şekilde epoksijenaz ile asit (EET) epoxyeicosatrienoic dönüştürülür çoklu doymamış yağ asidi (PUFA), arakidonik asit (AA), üretilmesi için fosfolipaz A2 (PLA2) harekete geçirir ve EET bağlanmasını TRPV4 16 aktive tarif 17. Yine de, TRPV4 kendisi doğrudan basit bir açıklama sağlamaktadır, membran streç 14 (aşağıda) yanıt gösterilmiştir. (2) TRPV4 mutant patolojileri şaşırtıcı vardır. Temel olarak, bir hastalık kaybı, azaltılması ya da kanalı faaliyetlerinin artış nedeniyle olup olmadığını bilmek gerekir. Burada bile, edebiyat çok net değil. Birden iskelet-displazi alellerin daha yüksek bir aktiviteye sahip olduğu rapor edilirken, (kazanç fonksiyon-, GOF) 4,21, çeşitli etkinlikler (kayıp-fonksiyon, LOF) 10,22 azalma olduğu bildirildi. 14 alellerin sistematik bir çalışma için onları bulduTüm GOF edilecek mutasyonlar (aşağıda) 23. TRPV4 fonksiyon tam kaybına rağmen sadece küçük kusurları ile canlı veya bereketli nakavt fare, – bazı Lofs olan iddia trpV4-/ fenotip çelişiyor gibi görünüyor.
Bu tartışmalara bir kısmı metodolojik kaynağı vardır. Laboratories farklı yöntemler, ya da bir yöntem varyantlarını kullanımı ve farklı bakarsak standartları kullanır. En sık olarak, TRPV4 geçici (HEK, CHO, HeLa) ve agonist veya hipotonik stimülasyonu üzerine iç [Ca2 +] yükselişi Ca 2 + duyarlı fluoresan boya, Fura-2 ile kayıtlıdır kültürlenmiş memeli hücrelerinde ifade edilir. Bu flüorometrik tahlil üzerinde aşırı güven 1 eleştirilmiştir. Farklı popülasyonlarda ekspresyon seviyesi, bunun içinde dağılım, hem de etkili bir boya konsantrasyonu, kontrol ve belgelenmiş gerekir. Daha güvenilir doğrudan elektrofizyolojik muayenesi olmaktır. Hatta bu gibi commonly uygulanan, sorunsuz da değildir. Kültürlenen hücrelerde ekspresyon seviyeleri kontrol edilmesi zor olduğu için, bütün hücre akımları büyük farklılıklar vardır. Akımlar küçük çünkü Ayrıca, güvenilir istatistikler genellikle pratik değil büyük çaplı, güvenmek zorunda kalacak. Patch-kelepçe muayeneler nadiren yapılmıştır. Bu tür bazı kayıtlar 16,17 istatistiksel değerlendirme zorlu hale aktivite patlamaları kümeleri göstermektedir.
Daha iyi moleküler mechanosensitivity anlamak için, biz TRPV4 incelemek için iki ek sistemleri geliştirdiler. (1) uzakta olağan memeli ortaklarından TRPV4 izole etmek için, biz maya 24 tomurcuklanma sıçan TRPV4 dile getirdiler. Bu evrimsel uzak bağlamda TRPV4 Fonksiyonel ifadesi hala olağan ortaklar olmadan ozmotik kuvvet cevap verebilecek gösterdi. Maya gibi AA veya EET hiçbir PUFAların yapar, ve genom, bu Expre hiçbir PLA2'nin veya epoksijenaz genleri Çünküsalgılanması da TRPV4 kuvveti duyacak için, gerekli olmadığını göstermektedir. Moleküler biyolojik en müsait ökariyotlarda TRPV4 olması da etkili ileri veya geri-genetik manipülasyonlar 25 verir. (2) TRPV4 derinlemesine biyofiziksel analizler için, Xenopus oositlerde TRPV4 ifade edilmiştir. NA (10 -10 10 -9 A) akımları alt-nA verim kültür hücreleri, aksine, bir oosit uA adlı (10 -6 -4 10 A) akımları ifade eder. Gürültü üzerine çok daha büyük sinyali daha iyi ölçümlerini ve daha güvenli karşılaştırılmasını sağlar. TRPV4, bu ifade, aynı zamanda bir kumanda kelepçesi kullanılarak tek tek moleküller olarak incelenebilir. Tek bir oosit tekrar ölçümü daha güvenilir hale tekrarlanan yama örnekleme sağlar. Bu tür çalışmalar TRPV4 kanal kendisi doğrudan membran germe kuvveti 14 ile aktive edilebilir olduğunu gösterdi. Analizler aynı zamanda 14 temsilci iskelet-displazi alellerin tüm kazanç fonksiyon-mutasyonlar olduğunu gösterdi. Bundan başka, degrBu yapısal Ca 2 + kaçağı ee iskelet hastalıkları 23 şiddetini paraleldir.
Çünkü onların yenilik ve kullanışlılığı, bu iki yöntemin detaylı prosedürler TRPV4 veya benzeri kanallar gelecekteki araştırmalarda çoğaltmaları izin burada toplanıyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Giriş bölümünde belirtildiği gibi, yaygın TRPV4 fonksiyonlarını incelemek için kullanılan yöntemler bazen tutarsızlıklara ve tartışmalar sonuçlandı. Burada açıklanan yöntemlerin iki set bazı avantajlar sunmaktadır ve mevcut yöntem tamamlayabilir. Biz TRPV4 sadece çalışmaları tarif ederken, bu buluşun metodları ve başka iyon kanalları incelemek için uzatılabilir.
1.. Maya luminometri Yöntemleri
Tomurcuklanan maya lipid bileşimin <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mükemmel teknik yardım için Andrea Kremsreiter teşekkür etmek istiyorum. Madison – Laboratuvarımızda çalışma NIH GM096088 ve Wisconsin Üniversitesi Vilas Trust tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
References
- Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
- Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
- Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
- Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
- Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
- Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
- Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
- Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
- Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
- Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
- Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
- Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
- Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
- Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
- Gao, X., Wu, L., O’Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
- Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
- Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
- Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
- Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
- Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
- Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
- Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
- Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
- Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
- Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
- Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
- Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Conn, P. M. . Methods in Enzymology. 294, (1999).
- Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. . Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).
- Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).
