Hefe und luminometrischer<em> Xenopus</em> Eizelle Elektrophysiologische Untersuchungen des Molecular Mechanosensitivität von TRPV4
Summary
Um häufigsten verwendeten Methoden, um zu studieren TRPV4 ergänzen, werden zwei Methoden beschrieben: Seine Mechanosensitivität kann durch Ca 2 +-Aequorin Luminometrie in transgenen Hefe auf hypo-osmotischen Herausforderung untersucht werden. Es kann auch in TRPV4-RNA untersucht werden injizierten Xenopus Oocyten durch Ganzzell-Zweielektroden-Spannungsklemmen-oder Patch-Clamp in Ein-Zelle oder entfernten Modus.
Abstract
TRPV4 (Transient Receptor Potentiale, Vanilloid-Familie, Typ 4) ist weit verbreitet in Wirbel Geweben exprimiert und wird von mehreren Stimuli, unter anderem durch mechanische Kräfte aktiviert. Bestimmte Mutationen verursachen TRPV4 komplexe erbliche Knochen oder neuronalen Erkrankungen in Menschen. Wildtyp-oder mutierten TRPV4 Transgene werden üblicherweise in kultivierten Säugerzellen exprimiert und durch Fura-2-Fluorometrie und Elektroden untersucht. In Bezug auf den Mechanismus der Mechanosensitivität und der molekularen Grundlagen von Krankheiten, ist die gegenwärtige Literatur verwirrend und umstritten. Um bestehende Methoden zu ergänzen, beschreiben wir zwei zusätzliche Methoden, um die molekularen Eigenschaften des TRPV4 zu untersuchen. (1) Rat TRPV4 und ein Aequorin Transgen in Hefezellen transformiert. Ein Hypo-osmtic Schock der Trans Bevölkerung ergibt eine luminometrische Signal aufgrund der Kombination von Aequorin mit Ca 2 + durch die TRPV4 Kanal veröffentlicht. Hier TRPV4 wird von seiner üblichen Säugetierpartnerproteine isoliertund offenbart seine eigene Mechanosensitivität. (2) von TRPV4 cRNA in Xenopus-Oozyten injiziert. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die makroskopische TRPV4 Strom mit einer Zwei-Elektroden-Spannungsklemme sucht. Der aktuelle Anstieg bei der Entfernung von inerten Osmotikums aus der Eizelle Bad ist bezeichnend für Mechanosensitivität. Die Mikroampere (10 -6 bis 10 -4 A) Ströme von Oozyten sind viel größer als die subnano zu Nanoampere (10 -10 bis 10 -9 A) Ströme aus kultivierten Zellen, was zu klareren und Quantifizierungen sicherer Abschätzungen. Mikroskopische Ströme reflektieren die Aktivitäten der einzelnen Kanalproteine können auch direkt unter einer Patch-Clamp-registriert werden, auf der Zelle herausgeschnitten oder-Modus. Das gleiche Eizelle bietet mehrere Patch-Proben, die eine bessere Datenreplikation. Ansaugung zu den Patches können TRPV4 aktivieren, um direkt beurteilen Mechanosensitivität. Diese Verfahren sollten auch bei der Untersuchung anderer Arten von TRP-Kanälen sein.
Introduction
TRP (transient receptor Potenziale) aus sieben Unterfamilien der Kationenkanäle, 1,2 sensorischen Funktionen dienen. Bei Säugetieren TRPV die Vanilloid Unterfamilie der TRP, sechs Sorten. TRPV4 (Typ 4) 3,4 reagiert auf Wärme, bestimmte Chemikalien, osmotische Schwellung oder Scherbeanspruchung. Das TRPV4-Gens wurde wiederholt von Kandidaten-Gen und / oder Expression Klonen 5-8 isoliert. Die letztere Methode folgte die Antwort des Genprodukts zu Hypo-Osmolarität. TRPV4 in fast allen Organen und Funktionen in der Entwicklung, Physiologie und Pathologie von vielen unterschiedlichen Zelltypen 3,4 ausgedrückt.
Auffällig sind die> 50 menschliche autosomal dominant TRPV4 Mutationen, wodurch periphere Neuropathien und / oder Skelettdysplasien (Anomalien in der Skelettentwicklung) 11.09. Die Skelettdysplasien reichen von leichten brachyomia Typ 3 (Typ-3-Zwergwuchs), Dysplasie, spondylometaphysäre Kozlowski-Typ, um SeveWieder Dysplasien, einige verursachen neonatalen oder embryonale Tod. Obwohl alle Arten der Mechanismen möglich scheint, erklärt keiner die Vielfalt, Komplexität, Variabilität und gelegentliche Überschneidungen dieser Krankheiten 4.
Wie andere TRP-Kanäle 1, ist TRPV4 ein Tetramer. In Ratten-oder Menschen TRPV4 wird jede Untereinheit von 871 Resten bestand. Zentrales Element ist ein sechs Transmembran-Helices (S1-S6), die geeignet in einer Weise ähnlich zu spannungsabhängigen K +-Kanäle angeordnet sind. Dort S1 bis S4 bilden eine Umfangs Domäne und die S5 und S6 bilden die Permeation Porendomäne. Zwischen S5 und S6 von TRPV4 ist eine kurze Porenhelix gefolgt von der Sequenz LDLFKLTIGMGDL, von denen vier vermutlich konvergieren, um die Kationenfilter bilden. Die 470-Rest N-terminalen cytoplasmatischen Segment enthält 6 Ankyrin Wiederholungen bekannt, Proteine oder kleine Liganden zu binden. Die C-terminale 152-Rückstand cytoplasmatischen Segment eine Calmodulin-Bindungssequenz unter anderen möglichen Seiten, ot bindenihr Elemente 3.
TRPV4 ist ein Kationenkanal, der im Wesentlichen schließt Anionen ein. Während seiner physiologischen Funktion ist um Stimuli an Ca 2 +-Einstrom zu transduzieren, ist es auch durchlässig für andere Kationen mit einer Eisenman-Sequenz IV Durchlässigkeit, bei einer Begünstigung zweiwertiger P Ca: P Na ~ 7 12. Einzelkanalleitfähigkeit richtet bei ~ 90 pS nach außen und nach innen ~ 40 pS 6,13,14. Heterolog exprimiert Strom (unten) kann durch hypo-osmotischen Schwellung, Schubspannung, Wärme oder 15 aktiviert werden. Es wird auch von mehrfach ungesättigten Fettsäuren 16,17 und das synthetische Ester phorbal 4αPDD 18 aktiviert. Derzeit ist die potenter Agonist GSK1016790A 19 und Antagonist GSK2193874, wirksam bei 10 -9 bis 10 -8 M-20, die beide von Hochdurchsatz-, Kleinmolekülbild entdeckt.
Zwei Schlüsselbereiche der Forschung zu bleiben verwirrend TRPV4: (1) Schon als TRPV4 ist weitgehend für seine Mechanosensitivität studiert, ist seine molekulare Basis umstritten. Ein Modell beschreibt Hypo-Osmolarität irgendwie aktiviert Phospholipase A2 (PLA2), die mehrfach ungesättigte Fettsäure (PUFA) Arachidonsäure (AA), die umgewandelt Säure (EET) von einem Epoxygenase Epoxyeicosatrienoide ist zu produzieren, und die Bindung von EET aktiviert TRPV4 16, 17. Doch selbst TRPV4 wurde gezeigt, direkt an Membran Strecke 14 (unten) zu reagieren, um eine einfachere Erklärung. (2) Die TRPV4 Mutante Pathologien sind verwirrend. Die Grundlage, muss man wissen, ob die Erkrankungen, die durch den Verlust, der Verringerung oder die Erhöhung der Kanalaktivitäten. Auch hier ist die Literatur alles andere als klar. Während mehrere Skelett-Dysplasie-Allele wurde berichtet, dass höhere Aktivitäten haben, (Gain-of-function, GOF) 4,21, mehrere wurden gemeldet, Aktivitäten (Loss-of-function, LOF) 10,22 reduziert. Eine systematische Untersuchung von 14 Allele gefunden, sie zuAlle GOF werden Mutationen (unten) 23. Die Behauptung, dass einige sind LOFs scheint den Phänotyp des TRPV4-/ widersprechen – Knockout-Maus, die lebensfähig oder fruchtbar sind, mit nur geringfügigen Mängeln, trotz einem vollständigen Verlust des TRPV4-Funktion.
Ein Teil dieser Kontroversen methodische Herkunft. Laboratories verwenden unterschiedliche Methoden oder Varianten einer Methode und verwenden unterschiedliche Beurteilungsstandards. Am häufigsten wird TRPV4 transient in kultivierten Säugerzellen exprimiert (HEK, CHO, HeLa) und der Anstieg des Innen [Ca 2 +] auf Agonisten oder hypotonen Stimulation mit Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 eingetragen. Die übermäßige Abhängigkeit von dieser fluorimetrischen Test ist kritisiert worden, ein. Das Expressionsniveau in verschiedenen Populationen, die Verteilung darin sowie die wirksame Farbstoffkonzentration, müssen kontrolliert und dokumentiert werden. Zuverlässiger ist die direkte elektrophysiologische Untersuchungen. Auch dieser, wie commonly praktiziert wird, ist auch nicht ohne Probleme. Da die Expressionsmengen in einzelnen kultivierten Zellen sind schwierig zu steuern, Ganzzellströme großen Schwankungen. Da ferner die Ströme klein sind, werden zuverlässige Statistiken müssen auf große Stichproben, die oft nicht praktisch verlassen. Patch-Clamp-Untersuchungen nur selten durchgeführt. Einige dieser Aufnahmen zeigen Gruppen von Aktivität Bursts statistische Auswertung anspruchs 16,17 zu machen.
Um die molekularen Mechanosensitivität besser zu verstehen, haben wir zwei weitere Systeme entwickelt, um TRPV4 zu untersuchen. (1) Um TRPV4 weg von seiner üblichen Säugetier Partner zu isolieren, haben wir Ratten TRPV4 in Bäckerhefe 24 ausgedrückt. Die funktionelle Expression von TRPV4 in diesem evolutionär entfernten Zusammenhang zeigte, dass es noch osmotische Kraft zu reagieren, ohne seinen üblichen Partnern. Da Hefe macht keine PUFA wie AA oder EET, und sein Genom hat keine PLA2 oder Epoxygenase Gene, die diese expression zeigt auch, dass sie nicht erforderlich sind, um für TRPV4 Kraft zu spüren. Mit TRPV4 in den molekularbiologisch am ehesten zugänglich Eukaryonten ermöglicht auch eine effiziente zukunfts oder Reverse-25 genetische Manipulationen. (2) Für umfassende Analysen der biophysikalischen TRPV4, ausgedrückt wir TRPV4 in Xenopus-Oozyten. Anders als kultivierte Zellen, die Unter nA nA (10 -10 bis 10 -9 A) Ströme ergeben, eine Oozyte exprimiert Ströme in uA ist (10 -6 bis 10 -4 A). Viel größere Rauschsignal über eine bessere Quantifizierung und selbstbewusster Vergleich. TRPV4, so ausgedrückt, kann auch als Einzelmoleküle unter Verwendung eines Patch-Clamp sucht werden. Eine einzige Eizelle ermöglicht wiederholte Patch Probenahme, wieder machen Quantifizierung zuverlässiger. Solche Studien haben gezeigt, dass TRPV4 Kanal selbst kann direkt durch Membran Strecke Kraft 14 aktiviert werden. Die Analysen zeigten, dass 14-Dysplasie repräsentativen Skelett Allele sind alle gain-of-function-Mutationen. Ferner ist die degree des konstitutiven Ca 2 + Leck Parallelen der Schwere der Erkrankungen der Skelett 23.
Aufgrund ihrer Neuheit und Nützlichkeit sind die detaillierten Verfahren dieser beiden Methoden hier versammelt, um Wiederholungen in Zukunft Forschung auf TRPV4 oder ähnliche Kanäle ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie in der Einleitung erwähnt, die häufig verwendet, um Funktionen zu studieren TRPV4 Methoden führte manchmal in Widersprüche und Kontroversen. Die zwei Sätze von hier beschriebenen Methoden bieten einige Vorteile und kann die vorhandenen Methoden zu ergänzen. Während wir nur die Studien zu TRPV4 beschreiben, können die Verfahren auch auf andere Ionenkanäle als auch studieren.
1. Hefe Luminometrie Methoden
Angehende Hefe hat eine native Ca 2 +-Einstr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Andrea Kremsreiter für hervorragende technische Unterstützung danken. Madison – Die Arbeit in unserem Labor wird von NIH GM096088 und Vilas Vertrauen der Universität von Wisconsin unterstützt.
Materials
| Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Wescor 5500 | Logan, UT, USA |
| Sirius Single Tube Luminometer | Titertek-Berhold | Sirius | Huntsville, LA, USA |
| Microplate luminometer | Titertek-Berthold | Mithras LB940 | Huntsville, LA, USA |
| Luminometry software | Titertek-Berthold | MikroWin2000 | Huntsville, LA, USA |
| Patch clamp and software | Axon Instrument | HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software | Union City, CA, USA |
| manometer | Bio-Tec | Winooski, VT, USA | |
| Pipet puller | Sutter Instrument Co | Model P-97 | Novata, CA, USA |
| Microinjector | Drummond Scientific | Nanoinject II | Broomall, PA, USA |
| Material: | |||
| luciferin coelenterazine | Invitrogen | Carlsbad, CA, USA | |
| T7 RNA polymerase reaction | Ambion | mMessage mMachine | Austin, TX, USA |
| gentamicin | Sigma | ||
| ruthenium red | Sigma | ||
| micropipets | Drummond | 100 microliter micropipets | Broomall, PA, USA |
| high-fidelity PfuUtra polymerase | Stratagene | La Jolla, CA, USA |
References
- Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
- Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
- Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
- Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
- Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
- Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
- Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
- Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
- Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
- Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
- Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
- Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
- Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
- Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
- Gao, X., Wu, L., O’Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
- Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
- Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
- Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
- Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
- Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
- Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
- Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
- Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
- Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
- Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. . Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , (2005).
- Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
- Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
- Loukin, S. H., Zhou, X. -. L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
- Conn, P. M. . Methods in Enzymology. 294, (1999).
- Goldin, A. L., Sumikawa, K., Iverson Rudy, L. E. . Methods in Enzymology. 207, 279-298 (1992).
- Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).
