Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gist luminometrische en Published: December 31, 2013 doi: 10.3791/50816
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

Summary

Ter aanvulling gebruikte methoden bestuderen TRPV4's worden twee methoden beschreven: De mechanische gevoeligheid kan worden bestudeerd door Ca 2 +-aequorine luminometrie in transgene gist bij hypo-osmotische uitdaging. Het kan ook in TRPV4-RNA worden onderzocht geïnjecteerd Xenopus oöcyten door whole-cell twee-elektrode voltage clamp of patch klem in op cel-of uitgeschakelde modus.

Abstract

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid familie, type 4) wordt algemeen uitgedrukt in gewervelde weefsels en wordt geactiveerd door verschillende stimuli, onder meer door mechanische krachten. Bepaalde TRPV4 mutaties veroorzaken complexe erfelijke bot of neuronale pathologieën bij de mens. Wild-type of mutant TRPV4 transgenen gewoonlijk uitgedrukt in gekweekte zoogdiercellen en Fura-2 fluorometrie en elektroden onderzocht. Wat betreft het mechanisme van mechanische gevoeligheid en de moleculaire basis van de ziekte, de huidige literatuur is verwarrend en controversieel. Ter aanvulling op bestaande methoden, beschrijven we twee extra methoden om de moleculaire eigenschappen van TRPV4 onderzoeken. (1) Ratten TRPV4 en een aequorine transgen worden omgezet in gist. Een hypo-osmtic schok van de transformant bevolking levert een luminometrische signaal door de combinatie van aequorine met Ca2 +, vrijgegeven door de TRPV4 kanaal. Hier TRPV4 wordt geïsoleerd van zijn gebruikelijke zoogdieren partner eiwittenen onthult zijn eigen mechanische gevoeligheid. (2) cRNA van TRPV4 wordt geïnjecteerd in Xenopus oocyten. Na een geschikte incubatietijd wordt de macroscopische TRPV4 huidige onderzocht met een twee-elektrodespanning klem. De huidige stijging bij verwijdering van inerte osmoticum uit de eicel bad is een indicatie van mechanische gevoeligheid. De Microampere (10 -6 tot 10 -4 A) stromen van oöcyten zijn veel groter dan de subnano-naar nano-ampère (10 -10 tot 10 -9 A) stromen van gekweekte cellen, waardoor duidelijker kwantificeringen en meer vertrouwen assessments. Microscopische stromingen als gevolg van de activiteiten van individuele kanaal eiwitten kunnen ook direct worden geregistreerd onder een patch clamp, in on-cel of uitgeschakelde modus. Dezelfde eicel biedt meerdere patch monsters analyseren, zodat betere data replicatie. Suctions toegepast op de patches kunnen TRPV4 activeren om direct mechanische gevoeligheid te beoordelen. Deze werkwijzen zouden ook nuttig in de studie van andere soorten TRP kanalen.

Introduction

TRP (transient receptor potentials) omvat zeven subfamilies van kation kanalen die zintuiglijke functies dienen 1,2. In zoogdieren, TRPV, de vanilloid onderfamilie van TRP, heeft zes varianten. TRPV4 (type 4) 3,4 reageert op warmte, bepaalde chemicaliën, osmotische zwelling of schuifspanning. De TRPV4 gen werd herhaaldelijk geïsoleerd door kandidaat-gen en / of expressieklonering 5-8. De laatste werkwijze gevolgd reactie het genproduct om hypo-osmolariteit. TRPV4 wordt uitgedrukt in bijna alle organen en functies in de ontwikkeling, fysiologie en pathologie van vele uiteenlopende celtypen 3,4.

Opvallend zijn de> 50 menselijke autosomaal dominante TRPV4 mutaties, waardoor perifere zenuwaandoeningen en / of skelet dysplasie (afwijkingen in de ontwikkeling van het skelet) 9-11. Het skelet dysplasieën variëren van mild soort brachyomia 3 (type 3 dwerggroei), spondylometaphyseal dysplasie Kozlowski type, Severe dysplasieën, wat veroorzaakt bij pasgeborenen of embryonale sterfte. Hoewel alle manieren van mechanismen mogelijk lijkt, niemand verklaart de diversiteit, complexiteit, variabiliteit, en af en toe overlappingen van deze ziekten 4.

Net als andere TRP-kanalen 1, TRPV4 is een tetrameer. In ratten of mensen TRPV4, wordt elke subeenheid bestaat uit 871 residuen. De centrale element zes transmembraan a-helices (S1-S6), die waarschijnlijk zijn aangebracht op een wijze vergelijkbaar met spanningsafhankelijke K + kanalen. Daar, S1 tot S4 vormen een perifere domein en de S5 en S6 vormen de permeatie porie domein. Tussen S5 en S6 van TRPV4 is een korte poriën helix gevolgd door de sequentie LDLFKLTIGMGDL, waarvan vier vermoedelijk samen met het kation filter vormen. De 470-residu N-eindstandige cytoplasmatische segment bevat 6 ankyrine herhalingen, bekende eiwitten of kleine liganden binden. De C-terminale 152 residuen cytoplasmatische segment omvat een calmoduline bindende sequentie onder andere mogelijke plaatsen die ot bindenhaar elementen 3.

TRPV4 een kation kanaal dat in wezen uitsluit anionen 1. Hoewel de fysiologische functie op stimuli transduceren naar Ca2 + influx is ook doorlaatbaar voor andere kationen met een Eisenman IV permeabiliteit sequentie, de voorkeur tweewaardige een P Ca: P Na ~ 7 12. Single-channel geleiding rectificeert bij ~ 90 pk naar buiten en ~ 40 pS naar binnen 6,13,14. Heteroloog tot expressie stroom (onder) kan worden geactiveerd door hypo-osmotische zwelling, afschuifspanning of warmte 15. Het wordt ook geactiveerd door meervoudig onverzadigde vetzuren 16,17 en de synthetische ester phorbal 4αPDD 18. Momenteel is de meest potente agonist GSK1016790A 19 en antagonist GSK2193874, effectief 10 -9 tot 10 -8 M 20, beide ontdekt door high-throughput, kleine moleculaire scherm.

Twee belangrijke gebieden van TRPV4 onderzoek blijft verwarrend: (1) Zelfs als TRPV4 grotendeels bestudeerd om zijn mechanische gevoeligheid, de moleculaire basis is controversieel. Een model beschrijft hypo-osmolariteit ergens activeert fosfolipase A2 (PLA2) aan meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) arachidonzuur (AA), dat wordt omgezet in zuur (EET) epoxyeicosatrienoic door een epoxygenase produceren, en de binding van EET activeert TRPV4 16, 17. Toch is TRPV4 zich aangetoond dat direct reageren membraan rek 14 (hieronder), die een eenvoudiger verklaring. (2) De TRPV4 mutant pathologieën zijn verbijsterend. Aan de basis, moet men weten of de ziekten zijn te wijten aan het verlies, de vermindering of de verhoging van het kanaal activiteiten. Zelfs hier, de literatuur is verre van duidelijk. Terwijl meerdere skelet-dysplasie allelen werden gemeld aan hogere activiteiten, (gain-of-function, GOF) 4,21, meerdere werden gemeld te hebben verminderd activiteiten (verlies-van-functie, LOF) 10,22. Een systematische studie van 14 allelen vond zeallemaal worden GOF mutaties (onder) 23. De bewering dat sommige LOF lijkt het fenotype van TRPV4-/ tegenspreken - knockout muis, die levensvatbaar of vruchtbaar zijn, met slechts kleine gebreken, ondanks een volledig verlies van TRPV4 functie.

Een deel van deze controverses heeft methodologische oorsprong. Laboratoria maken gebruik van verschillende methoden, of varianten van een methode, en maken gebruik van verschillende oordelen normen. Meestal wordt TRPV4 tijdelijk tot expressie in gekweekte zoogdiercellen (HEK, CHO, HeLa) en de opkomst van de interne [Ca 2 +] op agonist of hypotone stimulatie is geregistreerd bij de Ca 2 +-gevoelige fluorescente kleurstof, Fura-2. De over-afhankelijkheid van deze fluorometrische assay is bekritiseerd 1. Het expressieniveau in verschillende populaties, de verdeling daarin, evenals de effectieve concentratie kleurstof, moeten worden gecontroleerd en gedocumenteerd. Meer betrouwbaar is de directe elektrofysiologische onderzoeken. Zelfs dit, zoals commonly uitgeoefend, is niet zonder problemen. Omdat de expressieniveaus in individuele gekweekte cellen zijn moeilijk te beheersen, whole-cell stromingen hebben grote variaties. Verder, want de stromingen zijn klein, zal betrouwbare statistieken moeten vertrouwen op grote steekproeven vaak niet praktisch. Patch-clamp onderzoeken zijn zelden uitgevoerd. Sommige van deze opnames tonen clusters van activiteiten uitbarstingen die statistische evaluatie uitdagend 16,17 te maken.

Beter inzicht in de moleculaire mechanische gevoeligheid, hebben we twee extra systemen ontwikkeld om TRPV4 onderzoeken. (1) Om TRPV4 isoleren afstand van zijn gebruikelijke zoogdier-partners, hebben we rat TRPV4 uitgedrukt in gist 24. Functionele expressie van TRPV4 in dit evolutionair verre context bleek dat het nog zou kunnen reageren op osmotische kracht, zonder de gebruikelijke partners. Omdat gist geeft geen PUFA's zoals AA of EET, en zijn genoom heeft geen PLA2 of epoxygenase genen, dit expression blijkt ook dat ze niet nodig zijn voor TRPV4 te voelen kracht. Na TRPV4 in de moleculaire biologisch meest vatbaar eukaryoten maakt ook efficiënt vooruit-of achteruit-genetische manipulaties 25. (2) Voor uitgebreide biofysische analyses van TRPV4, we uitgedrukt TRPV4 in Xenopus oöcyten. In tegenstelling tot de gekweekte cellen, die sub-nA wijken voor nA (10 -10 tot 10 -9 A) stromen, een eicel uitdrukt stromen in uA's (10 -6 tot 10 -4 A). Veel groter signaal over ruis zorgt voor een betere kwantificering en meer vertrouwen vergelijking. TRPV4, dus uitgedrukt, kan ook worden onderzocht als individuele moleculen met behulp van een patch clamp. Een enkele eicel laat herhaalde patch sampling 'waarbij kwantificering betrouwbaarder. Deze studies toonden aan dat TRPV4 kanaal zelf direct worden geactiveerd door membraan stretch kracht 14. Analyse toonde dat 14 representatief skelet-dysplasie allelen zijn gain-of-function mutaties. Verder, de gree van deze constitutieve Ca2 + lekkage loopt parallel met de ernst van het skelet ziekten 23.

Door hun nieuwheid en het nut, worden de gedetailleerde procedures van deze twee methoden die hier bijeen om replicaties zodat in toekomstig onderzoek op TRPV4 of soortgelijke kanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gist Luminometrie Methoden

Gebruik stam BYYT van Saccharomyces cerevisiae. Het is een yvc1-tok1-derivaat van BY4741 (MATa, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1 :: HIS3, tok1 :: kanMX4). Transformeer de cellen met leu-selecteerbare aequorine tot expressie plasmide pEVP1/Aeq en ura-selecteerbare rat-TRPV4 expressie plasmide p416GPDV4 zoals beschreven in Batiza et al.. 26 en Loukin et al.. 24 gebruik van standaard werkwijzen van plasmide constructie en transformatie 27 . Stam en plasmiden gist zijn beschikbaar op aanvraag.

  1. Cultuur 2 ml van gistcellen nachts aan post-logaritmische fase in een 30 ° C shaker in leu-ura-"DCD" drop-out medium 28 (een-sulfaat uitgeput variant van de CMD-leu-ura gemiddeld 29), aangevuld met 1M sorbitol . Inoculeer 200 ul van deze kweken in 1,8 ml vers medium aangevuld met 2 uM van luciferin coelenterazine. Groeien in het donker bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 24 uur zonder schudden.
  2. Meet de osmolariteit van de kweek (typisch bij 1400 mOsM) en andere oplossingen (hieronder) met een dampdrukosmometer.
  3. Aliquot 20 ul van verse cultuur in een 12 mm luminometer buis voor een enkele buis lichtmeter.
  4. Voor de hypotone schok, voeg 200 ul van een oplossing die 25 mM NaEGTA (pH 7,2) of namen (pH 7,2) en 500-100 mM NaCl, (totale osmolariteit van 1,200-400 mOsM) afhankelijk van de mate van schok gewenst. Permanent toezicht op de luminescentie vóór en ten minste 120 seconden na de osmotische downshock, slechts onderbroken door de korte verdunning. Registreer lichtmeter uitgang op een desktop computer als relatieve luminescentie-eenheden (RUL).

Hoewel niet voor de studie van transgene TRPV4, hebben we een variant van het bovenstaande protocol in een geautomatiseerd systeem om de reacties van een groot aantal giststammen onderzoeken. Studie of de reacties op hypo-30 of hyperosmotische 31 stimuli van de gist deletome (de collectie van 4906 gist enkel gen-deletants) met behulp van een microplaat luminometer en geanalyseerd met bijbehorende software is succesvol geweest.

2. en 3. Eicel Electrofysiologie Methoden

Elektrofysiologie gebruikt basismethodes 32. PCR versterken de open reading frame van wild-type of mutant TRPV4 met behulp van high-fidelity PfuUtra polymerase en geïntegreerd in pGH19 33. Dit betekent een precieze insertie van het ORF tussen de 5 'en 3' UTR van het Xenopus-β-globine-gen en stroomafwaarts van een T7 RNA polymerase promotor. Lineariseren het construct stroomafwaarts van het 3'-UTR en gebruikt als templates in een in vitro T7 RNA polymerase reactie. Gebruik standaard moleculair-biologische technieken 34.

Gebruik stadium V-VI eicellen uit X. laevis. Veeteelt, gedeeltelijke ovariectomijn, defolliculation en vitelline envelop verwijdering volgen standaardprocedures 32,33,35. Injecteren 2-40 ng cRNA oplossing per eicel met een Drummond Nanoinject II automatische microinjector. Injecteren ~ 30 eicellen voor elke reeks experimenten. Na TRPV4 cRNA-injectie, incubeer de oöcyten in ND96 medium met gentamicine (100 ug / ml) en 1 uM ruthenium rood 14.

2. Twee elektrodespanning Clamp

  1. Trek borosilicaatglas opname pipetten van precisie wegwerp 100 ul micropipetten individueel met een pipet trekker.
  2. Trek beide voltage-meet-en stroom-injecteren pipet elektroden worden getrokken om een ​​tip opening van ~ 1 micrometer diameter hebben.
  3. Backfill elektroden 2 M KCl waardoor 0,1-0,2 mQ weerstand. Monteer ze op HS2A headstages, die samen met een VG-2Ax100 virtual-geaard bad klem, zijn aangesloten op een GeneClamp 500 versterker-interface via een Digidata 1440 digitizer. Verwerven gegevens met behulp van pClamp10 software.
  4. Plaats de eicel te worden getest in een badkuip 1 ml in een gefabriceerd plastic kamer gemonteerd op het podium van een dissectie microscoop met 20x vergroting. De badoplossing is virtueel geaard door een 3 M KCl agar brug en een gechloreerde zilverdraad geplaatst dichtbij de eicel aangesloten op een VG-2A virtuele aarde fase.
  5. Construeer de kamer voor continue perfusie met plastic buizen als oplossing-en uitlaat. Sluit de inlaatslang is aangesloten op een gefabriceerd perfusie systeem, dat een verdeelstuk zes 50 ml spuit houders, elk gevuld met een andere oplossing. Zwaartekracht tarieven van een bepaalde oplossing wordt geregeld om ~ 2-3 ml / min met behulp van "Keck" ramp klemmen op de slangen.
  6. Monteer beide elektroden met hun headstages op micromanipulators. Voer elektrode penetraties van de eicel door micromanipulatie.

3. Patch Clamp Onderzoek van Direct mechanische gevoeligheid

"> De basismethoden van patch clamp waaronder pipet voorbereiding, GQ-seal vorming, en de vorming van on-cel of weggesneden modi zijn die Hamill et al.. 36 en Conn 32.

  1. Vul borosilicaatglas pipetten met ~ 1 micrometer openingsdiameter top (bubble nummer 5-6) met 98 mM KCl, 1 mM MgCl2 en 10 mM K +-HEPES, pH 7,2.
  2. Bevestig de patch clamp pipet via een plastic slang aan een spuit 5 ml en door middel van een T-verbinding, ook voor een manometer. Gebruik een computer om zowel de elektrode en de manometer uitgangen verwerken. Verwerven van gegevens bij 10 kHz, en speel dan terug door een acht-polige Bessel-filter bij 1 kHz voor analyse.
  3. Verschillende patches kunnen worden uitgesneden uit dezelfde eicel herhaaldelijk. Deze praktijk maakt het onderzoek van de moleculaire activiteit TRPV4's efficiënter en betrouwbaarder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In een typisch luminometrie experiment wordt een scala aan 400-1,200 mOsM hypotone neer schokken bereikt door het toevoegen van 200 pi van shock oplossingen van verschillende lage osmolariteit tot 20 ul van cultuur in 1400 mOsM. De TRPV4 activiteit is duidelijk wanneer de RLU van de experimentele wordt vergeleken met die van twee negatieve controles: gistcellen getransformeerd met lege p416GPDV4 plasmide of een die de TRPV4 gen met een mutatie op de ion filter (figuur 1) 24 bevat.

In een typisch twee-elektrode voltage-clamp experiment worden de oöcyten oorspronkelijk gebaad in een vloeiende isotone badoplossing bevattende (in mM) 66 KMeSO 4, 1,8 Ba (MESO 4) 2, 5 K +-HEPES (pH 7,2) en 100 sorbitol. Piekstromen worden beoordeeld aan het einde van 100 msec testpulsen 20 mV van een bedrijf potentieel van -20 mV elke 10 sec. Hypotone reacties uitlokken stroom veranderd in een soortgelijke oplossing ontbreekt sorbitol. T zijn hypotoon reactie is reversibel na terugkeer van sorbitol en blokkeerbaar door de TRP-kanaal blokker ruthenium rood (Figuur 2A).

In een typische patch-clamp experiment wordt symmetrisch oplossing gebruikt, namelijk de oplossing baden de patch en de pipetten vuloplossing hetzelfde (98 mM KCl, 1 mM MgCl2 en 10 mM K +-HEPES, pH 7,2). Hier wordt de inside-out patch uitgesneden uit een rat-TRPV4 expressie eicel gehouden op 50 mV. Pulsen van zuiging worden gegenereerd uit de spuit. Korte suctions, honderden msec in duur, toegepast op tientallen mm Hg, ontlokken de ~ 40 pS unitaire geleiding afkomstig uit de eicel membraan 37 en de ~ 90 pS unitaire geleiding van het heteroloog tot expressie TRPV4 (Figuur 2B) 14.

les/ftp_upload/50816/50816fig2.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 1. Rat TRPV4 uitgedrukt in gist reageren op hypotone shock. (A) een diagram dat de experimentele methoden. (B) A 750 mOsM hypotone shock (pijlpunten) veroorzaakt een grote toename luminescentie (in relatieve fluorescentie-eenheden, RLU) in TRPV4 transformanten, maar niet in transformanten van een leeg plasmide of plasmide richting een TRPV4 met een mutatie in het ionenfilter (M680K). (C) Een dosis-respons relatie tussen hypotone shock en de maximale respons (gemiddelde + SD, n = 3). Afmetingen van 2,4 x 10 6 cellen per 24. Klik hier voor grotere afbeelding .

0px "/>
Figuur 2. Elektrofysiologische onderzoeken van TRPV4 activiteit heteroloog tot expressie Xenopus oöcyten. (A) Whole-eicel macroscopische-stroom reacties op hypotone stimuli onderzocht met een twee-elektrodespanning klem. Piekstromen van een oöcyt expressie zeer hoge niveaus van wildtype TRPV4 (5 dagen na injectie van 40 ng cRNA) bij 100 msec spanningsstappen (van -20 tot +20 mV elke 10 seconden) (inzet) in reactie op de verwijdering 100 mM sorbitol van 250 mOsM badoplossing (open staven) en de toevoeging van 3 uM ruthenium rood (RuR; gevulde bar). Evident zijn de herhaalde piek-stroom neemt toe na een hypotone stimuli en de dalingen op de terugkeer naar isotone oplossing of de toevoeging van het kanaal blokker (RUR). (B) Directe activatie van wild-type TRPV4 door membraan stretch gezien onder een patch clamp. Een monster van ruwe sporen van gemiddelde kwaliteit van een patch uitgesneden uit een-TRPV4 expreesssing eicel, waaruit activatie met 60 mmHg zuigkracht (onderste spoor) toegepast op een uitgesneden inside-out patch gehouden op 50 mV. Het bovenste spoor wordt weergegeven op een snellere tijd uitvalsbasis om de unitaire huidige overgang tussen gesloten (C) te laten zien en twee open niveaus (O 1 en O 2) 14. Klik hier voor grotere afbeelding .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zoals vermeld in de inleiding, de methoden vaak gebruikt om TRPV4 functies studeren soms tot inconsistenties en controverses. De twee sets van de hier beschreven methoden bieden een aantal voordelen en kan de bestaande methoden aan te vullen. Hoewel we alleen studies TRPV4 beschrijven, kan de methode worden uitgebreid tot andere ionkanalen bestuderen ook.

1. Gist Luminometrie Methoden

Gist heeft een native Ca 2 +-influx reactie op hypo-osmotische schok die wordt gesensibiliseerd door mutaties die lipidesamenstelling 30 beïnvloeden. Dit signaal kan worden gewist met externe EGTA. Deze chelator echter niet het signaal worden uit het heteroloog tot expressie TRPV4 24 geven dat het kanaal wordt uitgedrukt in een intern membraan, waarschijnlijk die van het endoplasmatisch reticulum, waar de Ca2 + vrij in het cytoplasma op het osmotische shock. Verkeer van heteroloog tot expressiekanalen is niet onderzocht in gist. Indien deze werkwijze wordt uitgebreid tot de studie van andere TRP kanalen of andere vermeende mechanosensitive kanalen, de chelatie test moet worden uitgevoerd en de aanwezigheid van het oorspronkelijke besturingssysteem worden herinnerd.

2A. Twee-elektrode Voltage Clamp

Anders dan de patch-clamp experiment wordt de twee-elektrode voltage-clamp experiment uitgevoerd op intacte eicellen uitgevoerd voor het verwijderen van de vitelline envelop. Zowel microscopisch onderzoek en capaciteit waarden geven aan dat de plasmamembraan is niet uniform bolvormige maar is hoog geïnvagineerde onder de relatief inelastische sfeer van de vitelline envelop. Zo is de mechanische stress veroorzaakt door hyponicity is niet zomaar een isotroop inflatoire spanning van een uitgebreide sferische plasmamembraan. De stress waarschijnlijk het gevolg van het persen van het membraan tegen de opsluitende vitelline enveloppe en / of van de gevestigde cytoplasmatische bijlage in the van toenemende osmotische druk.

Expressie van TRPV4 en waarschijnlijk bepaalde andere kanalen, is toxisch voor de eicel, waarschijnlijk door Ca2 + lekkage. Het is daarom belangrijk om continu incubeer de eicel na TRPV4 cRNA-injectie in aanwezigheid van het kanaal blokker, ruthenium rood. De mate van expressie TRPV4 toont variabiliteit, die niet volledig onder experimentele controle. "Gain-of-function" mutant TRPV4 kanalen, die aanzienlijke spontane opening vertonen, worden systematisch eerder na de injectie dan hun wild-type tegenhanger 23 uitgedrukt.

2B. Patch Clamp

Xenopus eicel drukt een inwoner mechanosensitive kanaal, dat rectificeert in de binnenwaartse richting (~ 50 pS naar binnen, ~ 10 pS naar buiten). Een studie suggereert dat het de expressie van TRPC1 37. Dit voortdurend uitgedrukt inheemse kanaal biedt een kalibratie voor TRPV4, de heterologous expressie die niet altijd succes worden waargenomen patches.

De waarschijnlijkheid van TRPV4 meestal hoger in eicellen na een langere incubatietijd meestal 3-4 dagen na cRNA-injectie. Een efficiënte manier om te gaan is om eerst uit te voeren de twee-elektrode-voltage-clamp experiment (boven) en zorg ervoor dat de eicel is de uiting van de spontane TRPV4 macroscopische stroom, en vervolgens overgaan tot de vitelline envelop te verwijderen alvorens monster patches van dezelfde eicel. De kans op het vastleggen van TRPV4 activiteiten kunnen ook worden verbeterd met behulp van "macropatches", gemonteerd op pipetten met grotere boringen (bubbel nummer 6-7). Brand polijsten deze pipetten 32 lijkt behulpzaam bij het ​​bereiken van de GQ afdichting. Nadat de afdichting vormen, kan de uitgesneden patch een zeer hoge weerstand vertonen, zeer weinig lawaai meestal geassocieerd met biologische membranen en niet-inheemse kanaalactiviteit. Dit waarschijnlijk infect dubbele membraan vorming. Een korte blootstelling aan lucht, door kortstondig opheffen van de pipet boven de meniscus door micromanipulatie kunnen meestal breken de ongewenste extra laag. Alternatief kan de buitenste laag worden verwijderd door voorzichtig aanraken van de pipet boring tegen een draad van gehard siliconenafdichting gesuspendeerd in het bad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij willen Andrea Kremsreiter bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Werk in ons laboratorium wordt ondersteund door NIH GM096088 en de Vilas Trust van de Universiteit van Wisconsin - Madison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vapor Pressure Osmometer Wescor Wescor 5500 Logan, UT, USA
Sirius Single Tube Luminometer  Titertek-Berhold Sirius Huntsville, LA, USA
Microplate luminometer Titertek-Berthold Mithras LB940 Huntsville, LA, USA
Luminometry software Titertek-Berthold MikroWin2000 Huntsville, LA, USA
Patch clamp and software Axon Instrument HS2A headstage, VG-2Ax100 virtual grounded bath clamp, GeneClamp 500 amplifier, digidata 1440 digitizer, pClamp10 software Union City, CA, USA
Manometer Bio-Tec Winooski, VT, USA
Pipette puller Sutter Instrument Co Model P-97 Novata, CA, USA
Microinjector Drummond Scientific Nanoinject II Broomall, PA, USA
Luciferin coelenterazine Invitrogen Carlsbad, CA, USA
T7 RNA polymerase reaction Ambion mMessage mMachine Austin, TX, USA
Gentamicin Sigma  
Ruthenium red  Sigma  
Micropipettes  Drummond 100 microliter micropipets Broomall, PA, USA
High-fidelity PfuUtra polymerase  Stratagene La Jolla, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsey, I. S., Delling, M., Clapham, D. E. An introduction to TRP channels. Annu. Rev. Physiol. 68, 619-647 (2006).
  2. Nilius, B., Owsianik, G. The transient receptor potential family of ion channels. Genome Biol. 12, 218 (2011).
  3. Everaerts, W., Nilius, B., Owsianik, G. The vallinoid transient receptor potential channel Trpv4: From structure to disease. Prog. Biophys. Mol. Biol. , (2009).
  4. Nilius, B., Voets, T. The puzzle of TRPV4 channelopathies. EMBO Rep.. , (2013).
  5. Liedtke, W., et al. Vanilloid receptor-related osmotically activated channel (VR-OAC), a candidate vertebrate osmoreceptor. Cell. 103, 525-535 (2000).
  6. Strotmann, R., Harteneck, C., Nunnenmacher, K., Schultz, G., Plant, T. D. OTRPC4, a nonselective cation channel that confers sensitivity to extracellular osmolarity. Nat. Cell Biol. 2, 695-702 (2000).
  7. Wissenbach, U., Bodding, M., Freichel, M., Flockerzi, V. Trp12, a novel Trp related protein from kidney. FEBS Lett. 485, 127-134 (2000).
  8. Delany, N. S., et al. Identification and characterization of a novel human vanilloid receptor-like protein, VRL-2. Physiol. Genomics. 4, 165-174 (2001).
  9. Rock, M. J., et al. Gain-of-function mutations in TRPV4 cause autosomal dominant brachyolmia. Nat. Genet. 40, 999-1003 (2008).
  10. Krakow, D., et al. Mutations in the gene encoding the calcium-permeable ion channel TRPV4 produce spondylometaphyseal dysplasia, Kozlowski type and metatropic dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 84, 307-315 (2009).
  11. Camacho, N., et al. Dominant TRPV4 mutations in nonlethal and lethal metatropic dysplasia. Am. J. Med. Genet. A. 152, 1169-1177 (2010).
  12. Voets, T., et al. Molecular determinants of permeation through the cation channel TRPV4. J. Biol. Chem. 277, 33704-33710 (2002).
  13. Watanabe, H., et al. Modulation of TRPV4 gating by intra- and extracellular Ca2. Cell Calcium. 33, 489-495 (2003).
  14. Loukin, S., Zhou, X., Su, Z., Saimi, Y., Kung, C. Wild-type and brachyolmia-causing mutant TRPV4 channels respond directly to stretch force. J. Biol. Chem. 285, 27176-27181 (2010).
  15. Gao, X., Wu, L., O'Neil, R. G. Temperature-modulated diversity of TRPV4 channel gating: activation by physical stresses and phorbol ester derivatives through protein kinase C-dependent and -independent pathways. J. Biol. Chem. 278, 27129-27137 (2003).
  16. Watanabe, H., et al. Anandamide and arachidonic acid use epoxyeicosatrienoic acids to activate TRPV4 channels. Nature. 424, 434-438 (2003).
  17. Vriens, J., et al. Cell swelling, heat, and chemical agonists use distinct pathways for the activation of the cation channel TRPV4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 396-401 (2004).
  18. Vincent, F., et al. Identification and characterization of novel TRPV4 modulators. Biochem. Biophys. Res. Commun. 389, 490-494 (2009).
  19. Willette, R. N., et al. Systemic activation of the transient receptor potential vanilloid subtype 4 channel causes endothelial failure and circulatory collapse: Part 2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 443-452 (2008).
  20. Thorneloe, K. S., et al. An orally active TRPV4 channel blocker prevents and resolves pulmonary edema induced by heart failure. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  21. Kang, S. S., Shin, S. H., Auh, C. K., Chun, J. Human skeletal dysplasia caused by a constitutive activated transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) cation channel mutation. Exp. Mol. Med. 44, 707-722 (2012).
  22. Lamande, S. R., et al. Mutations in TRPV4 cause an inherited arthropathy of hands and feet. Nat. Genet. 43, 1142-1146 (2011).
  23. Loukin, S., Su, Z., Kung, C. Increased Basal Activity Is a Key Determinant in the Severity of Human Skeletal Dysplasia Caused by TRPV4 Mutations. PLoS One. 6, (2011).
  24. Loukin, S. H., Su, Z., Kung, C. Hypotonic shocks activate rat TRPV4 in yeast in the absence of polyunsaturated fatty acids. FEBS Lett. 583, 754-758 (2009).
  25. Loukin, S., Su, Z., Zhou, X., Kung, C. Forward genetic analysis reveals multiple gating mechanisms of TRPV4. J. Biol. Chem. 285, 19884-19890 (2010).
  26. Batiza, A. F., Schulz, T., Masson, P. H. Yeast respond to hypotonic shock with a calcium pulse. J. Biol. Chem. 271, 23357-23362 (1996).
  27. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2005).
  28. Loukin, S., Zhou, X., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmoprotective role for vacuolar Ca2+ release in cell wall-compromised yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  29. Denis, V., Cyert, M. S. Internal Ca(2+) release in yeast is triggered by hypertonic shock and mediated by a TRP channel homologue. J. Cell. Biol. 156, 29-34 (2002).
  30. Loukin, S. H., Kung, C., Saimi, Y. Lipid perturbations sensitize osmotic down-shock activated Ca2+ influx, a yeast "deletome" analysis. FASEB J. 21, 1813-1820 (2007).
  31. Loukin, S. H., Zhou, X. -L., Kung, C., Saimi, Y. A genome-wide survey suggests an osmo-protective role for vacuolar Ca2+ release in cell-wall-compromized yeast. FASEB J. 22, 2405-2415 (2008).
  32. Conn, P. M. Methods in Enzymology. 294, Academic Press. (1999).
  33. Iverson Rudy, L. E. Methods in Enzymology. 207, Harcourt Brace Jovanovich. 279-298 (1992).
  34. Loukin, S. H., et al. Random mutagenesis reveals a region important for gating of the yeast K+ channel Ykc1. EMBO J. 16, 4817-4825 (1997).
  35. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. , (2008).
  36. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
  37. Maroto, R., et al. TRPC1 forms the stretch-activated cation channel in vertebrate cells. Nat. Cell Biol. 7, 179-185 (2005).

Tags

Basis Protocol Eukaryota Archaea Bacteriën Life Sciences (Algemeen) Mechanosensation Ionkanalen lipiden patch clamp, gist luminometrie kracht sensing voltage clamp TRPV4 elektrofysiologie
Gist luminometrische en<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Elektrofysiologische Examens van de Moleculaire mechanische gevoeligheid van TRPV4
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X.,… More

Teng, J., Loukin, S., Zhou, X., Kung, C. Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4. J. Vis. Exp. (82), e50816, doi:10.3791/50816 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter