एक चिप पर तनाव प्रेरित एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण
Summary
हमने तेजी से एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म विकसित किया है। तरल पदार्थ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के तल पर स्थिर बैक्टीरिया पर उच्च गति से पारित किया जाता है। तनाव और एंटीबायोटिक की उपस्थिति में, बैक्टीरिया के अतिसंवेदनशील उपभेदों तेजी से मर जाते हैं। हालांकि, प्रतिरोधी बैक्टीरिया इन तनावपूर्ण स्थितियों से बच सकते हैं।
Abstract
हमने तनाव आधारित वातावरण में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए एक रैपिड माइक्रोफ्लुइडिक विधि विकसित की है। तरल पदार्थ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के तल पर स्थिर बैक्टीरिया पर उच्च गति से पारित किया जाता है। तनाव और एंटीबायोटिक की उपस्थिति में, बैक्टीरिया के अतिसंवेदनशील उपभेदों तेजी से मर जाते हैं। हालांकि, प्रतिरोधी बैक्टीरिया इन तनावपूर्ण स्थितियों से बच जाते हैं। इस विधि के पीछे परिकल्पना नई है: जैव रासायनिक रास्तों की तनाव सक्रियता, जो एंटीबायोटिक दवाओं के लक्ष्य हैं, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण में तेजी ला सकती है। मानक एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण विधियों की तुलना में, दर-सीमित कदम – बैक्टीरियल विकास – एंटीबायोटिक आवेदन के दौरान छोड़ दिया जाता है। विधि का तकनीकी कार्यान्वयन मानक तकनीकों और अभिनव दृष्टिकोणों के संयोजन में है। विधि के मानक भागों में बैक्टीरियल कल्चर प्रोटोकॉल, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) में माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को परिभाषित करना, फ्लोरेसेंस के साथ सेल व्यवहार्यता निगरानी और बैक्टीरिया की गिनती के लिए बैच इमेज प्रोसेसिंग शामिल है। विधि के अभिनव भागों यांत्रिक तनाव आवेदन के लिए संस्कृति मीडिया प्रवाह के उपयोग में हैं, एंजाइमों के उपयोग को नुकसान लेकिन बैक्टीरिया को मारने नहीं है, और जीवाणु लगाव के लिए microarray सब्सट्रेट्स का उपयोग करें । विकसित मंच एंटीबायोटिक और गैर-antibiotic से संबंधित दवा विकास और परीक्षण में इस्तेमाल किया जा सकता है। मानक बैक्टीरियल निलंबन प्रयोगों की तुलना में, दवा के प्रभाव को नियंत्रित समय अवधि में बार-बार चालू और बंद किया जा सकता है। एक ही प्रयोग के दौरान एक ही जीवाणु आबादी का दोहराव अवलोकन संभव है।
Introduction
जीवाणु प्रतिरोध के उदय से अंतिम उपाय की हमारी दवाओं की रक्षा के लिए तेजी से फेनोटाइप आधारित एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षणों की आवश्यकता तेज हो जाती है । मानक संवेदनशीलता परीक्षण एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति में बैक्टीरियल विकास अवरोध पर आधारित होते हैं जिन्हें पूरा करने में कई (8-24) घंटे लगते हैं। हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर एक उपन्यास एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण विकसित किया है जो एंटीबायोटिक दवाओं की कार्रवाई में तेजी लाने के लिए बायोसिंथेटिक रास्तों के तनाव-सक्रियण पर निर्भर करता है।
माइक्रोफ्लुइडिक पैमाने पर एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण प्रभावी नमूना उपयोग का लाभ लेते हैं, क्योंकि उन्हें बैक्टीरिया की छोटी संख्या की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, कई शर्तों1,2के तहत कई नमूनों का परीक्षण करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। हाल ही में, एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के लिए माइक्रोफ्लुइडिक तरीकों की एक संख्या3-9की सूचना दी गई है । इन तरीकों में, बैक्टीरिया नैनो के अंदर उगाए जाते हैं- और पिकाल्टर बूंदों3,7,माइक्रोफ्लुइडिक चैनल4-6,8की पूरी मात्रा में, या चैनल9की निचली सतह पर एक बैक्टीरिया विद्युत रूप से स्थानीयकृत। हालांकि ये परीक्षण माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों में किए जाते हैं, लेकिन वे सभी पारंपरिक तरीकों के समान एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति और अनुपस्थिति में माइक्रोबियल विकास की निगरानी करते हैं। विकास मापन ऑप्टिकल घनत्व, पीएच संवेदनशील रंगों, या उज्ज्वल क्षेत्र/चरण विपरीत या फ्लोरेसेंस छवियों के माध्यम से लिया जाता है । हालांकि इन परीक्षणों में से कुछ पारंपरिक तरीकों की तुलना में तेजी से कर रहे हैं, वे प्रत्येक निष्क्रिय एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पता लगाने । दूसरे शब्दों में, इन तरीकों को अभी भी उपयोगकर्ता को अंतिम read-आउट के रूप में बैक्टीरियल विकास के लिए इंतजार करने की आवश्यकता होती है।
इसके विपरीत, हमने एक विधि विकसित की है जो एंटीबायोटिक-संवेदनशील जैव रासायनिक रास्तों को सक्रिय करने के लिए कतरनी और एंजाइमेटिक तनाव के संयोजन का उपयोग करती है10। उन एंटीबायोटिक दवाओं के साथ तनावग्रस्त बैक्टीरिया को चुनौती देने से अधिक तेजी से संवेदनशीलता परीक्षण होता है । एंटीबायोटिक के प्रतिरोधी बैक्टीरिया तनावपूर्ण स्थितियों का सामना करने में सक्षम हैं। दूसरी ओर, अतिसंवेदनशील बैक्टीरिया, संयुक्त तनाव से तेजी से मारे जाते हैं। एक घंटे के बाद सेल मृत्यु का प्रतिशत, फ्लोरोसेंट मृत कोशिका दाग का उपयोग करके माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है, बैक्टीरिया (प्रतिरोधी बनाम अतिसंवेदनशील) के फेनोटाइप को परिभाषित करता है।
हमारी विधि के सफल कार्यान्वयन के लिए, बैक्टीरिया को माइक्रोफ्लुइडिक चैनल की निचली सतह पर स्थिर किया जाना चाहिए। इस तरह, बैक्टीरिया विभिन्न तनावों के अधीन हो सकता है और साथ ही एक ही विमान में माइक्रोस्कोप के नीचे चित्रित किया जा सकता है। बैक्टीरिया स्थिरीकरण के लिए एक कोटेड माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड का उपयोग किया जाता है। स्लाइड को निर्माता द्वारा गैर-विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी के लिए एपोक्साइड समूहों के साथ प्रीकोट किया जाता है। बैक्टीरियल सतह प्रोटीन के लिए इन एपोक्साइड की गैर-विशिष्ट बाध्यकारी बैक्टीरिया को स्लाइड सतह पर जोड़ती है।
एंटीबायोटिक की अनुपस्थिति (नियंत्रण) और उपस्थिति (प्रयोग) में समान परिस्थितियों (कतरनी + एंजाइमेटिक तनाव) के तहत उपभेदों का परीक्षण किया जाता है। प्रत्येक चैनल के चरण विपरीत और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप चित्रों को एक घंटे के लिए हर दो मिनट में स्वचालित रूप से लिया जाता है। प्रतिरोध पदनाम तो नियंत्रण चैनल में मौजूद लोगों के लिए प्रयोगात्मक चैनल में मृत बैक्टीरिया के प्रतिशत की तुलना करके किया जाता है । एक घंटे के बाद, 1% से अधिक सेल मृत्यु प्रतिशत वाले नमूने को अतिसंवेदनशील माना जाता है, जबकि 0.5% से कम मृत्यु प्रतिरोध का संकेत है। प्रतिशत है कि इन दो कट-नापसंद के बीच गिर अनिश्चित माना जाता है और नमूना फिर से परीक्षण किया जाना चाहिए ।
माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों को पीडीएमएस में परिभाषित किया गया है, जो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों11के लिए पसंद की सामग्री है। पीडीएमएस तरंगदैर्ध्य, जैव संगत, निष्क्रिय, गैसों के लिए पारमशील की एक विस्तृत श्रृंखला में ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी है और तरल पदार्थों के लिए कम पारी क्षमता है; इसलिए यह इन प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
यांत्रिक/कतरनी तनाव स्थिर बैक्टीरिया पर कमरे के तापमान मीडिया के प्रवाह के द्वारा बनाया गया है । (नोट: ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया वार्मिंग परख परिणाम पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है.) स्वचालित सिरिंज पंप बल मीडिया (मृत सेल दाग +/-एंटीबायोटिक युक्त, साथ ही वैकल्पिक एंजाइमेटिक तनाव) माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों के माध्यम से (२०० माइक्रोन x ४०० माइक्रोन) 1 मिलीलीटर की प्रवाह दर पर/ यह दर स्टेफिलोकोसीपर पहले से अध्ययन किए गए कतरनी तनाव के बराबर या उससे अधिक है ।
एंजाइम, lysostaphin, प्रारंभिक प्रयोगों के लिए चुना गया था क्योंकि यह स्टेफिलोकोकस सेल दीवार को सीधे नुकसान का कारण बनता है । lysostaphin (०.७ एनजी/मिलीलीटर) की एकाग्रता बैक्टीरियल सेल दीवार क्षति का कारण पर्याप्त था, लेकिन प्रयोग की समय सीमा में एंटीबायोटिक के बिना बैक्टीरियल सेल मौत का कारण पर्याप्त नहीं है । बैक्टीरिया संवेदनशीलता के सही पदनाम के लिए Lysostaphin की आवश्यकता नहीं है, लेकिन यह परिणाम को बढ़ाता है, जिससे अतिसंवेदनशील उपभेदों में सेल की मौत बढ़ जाती है। इसके विपरीत, परख समारोह के लिए कतरनी तनाव महत्वपूर्ण है। जब मैथिसिलिन-संवेदनशील स्टेफिलोकोकस ऑरियस उपभेदों को प्रवाह के अभाव में lysostaphin और ऑक्सासिलिन के साथ इलाज किया जाता है, तो प्रयोग के दौरान कोई कोशिका मृत्यु दर्ज नहीं की जाती है।
कोशिका व्यवहार्यता की निगरानी फ्लोरोसेंट डेड सेल दाग12से की जाती है . डाई का चयन चुनिंदा रूप से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को दागने की क्षमता पर आधारित था, कोशिकाओं को जीवित करने के लिए इसकी गैर-क्षमता, और इसकी कम पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस, जो अतिरिक्त चरणों के बिना सेल मीडिया के लिए इसके प्रत्यक्ष इसके लिए अनुमति दी गई थी। 0.25 माइक्रोन की फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता का चयन फ्लोरेसेंस उत्तेजन प्रकाश के लिए 1.6 सेकंड के जोखिम समय के दौरान स्वीकार्य संकेत स्तर प्राप्त करना था।
बीटा लैक्टम, ऑक्ससिलिन, हमारे प्रारंभिक अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया था। मैथिसिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) प्रजातियां ऑक्सासिलिन के लिए प्रतिरोधी हैं और प्रयोग की समय सीमा में कोई प्रशंसनीय कोशिका मृत्यु नहीं दिखाएगी। प्रारंभिक अध्ययनों में 50 माइक्रोग्राम/एमएल की एकाग्रता निर्धारित की गई थी। एंटीबायोटिक की कम सांद्रता ने प्रतिरोधी और अतिसंवेदनशील उपभेदों के बीच कम अलगाव दिया, जबकि उच्च सांद्रता के कारण प्रायोगिक परिणामों में सराहनीय अंतर नहीं हुआ ।
हमने पहले एक परीक्षण के सफल विकास पर रिपोर्ट की है जो यांत्रिक और एंजाइमेटिक तनावों को जोड़ती है जो सीधे बैक्टीरियल सेल वॉल13 को एक एंटीबायोटिक के साथ प्रभावित करती है जो सेल वॉल बायोसिंथेसिस14,15को रोकता है। ये प्रूफ-ऑफ-सैद्धांतिक प्रयोग एमआरएसए और मैथिसिलिन के संवेदनशील एस ऑरियस (एमएसएसए) के एक पैनल पर किए गए थे । हालांकि, उचित प्रयोगात्मक मापदंडों के चयन के साथ, हमारी विधि बैक्टीरिया की कई प्रजातियों और एंटीबायोटिक दवाओं के कई वर्गों पर लागू होनी चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मैथिसिलिन-संवेदनशील और मैथिसिलिन प्रतिरोधी स्टेफिलोकोकस ऑरियस 10उपभेदों के साथ प्रयोगों के एक सेट में मान्य और अनुकूलित किया गया था। इसलिए, संशोधन के बिना यह प्रोटोकॉल ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विनिर्माण नवाचार के लिए Fraunhofer केंद्र में इंजीनियरों और छात्रों का शुक्रिया अदा करते हैं । प्रयोगात्मक प्रणाली के डिजाइन, मशीनिंग और स्वचालन में मदद करने के लिए, हम एंड्रियास प्रिंसेन, होल्गर विर्ज, डौग फॉस, डेविड चार्गिन और डॉ सुडोंग शू का धन्यवाद करते हैं। हम प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा संग्रह के परीक्षण में मदद के लिए जूलिया कुककार्ट्ज़, मेलानी ज़िमरमैन, निको क्राएत्जमार, टिम गम्बेल, जोश विल्नुएवा, मिनोरी शिमिज़ू और कैटरीना कुलिगा को धन्यवाद देते हैं। हम सेलप्रोफिलर में छवि विश्लेषण दिनचर्या के विकास के साथ मदद के लिए हार्वर्ड और एमआईटी के ब्रॉड इंस्टीट्यूट में इमेजिंग प्लेटफॉर्म के डीआरएस ऐनी ई बढ़ई और मार्क-एंथनी ब्रे को स्वीकार करते हैं। वर्णित परियोजना पुरस्कार R21AI079474 और 1R01AI101446 द्वारा भाग में राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान से समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोग संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है । इस परियोजना को फ्रानहोफर यूएसए ने भी समर्थन दिया था ।
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
