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Bioengineering

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

doi: 10.3791/50828 Published: January 8, 2014

Summary

우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

Abstract

우리는 스트레스 기반 환경에서 항생제 감수성 검사를 위한 신속한 미세 유체 방법을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건에서 살아남습니다. 이 방법의 뒤에 가설은 새로운: 항생제의 표적인 생화확적인 통로의 스트레스 활성화는, 항생제 감수성 시험을 가속화할 수 있습니다. 표준 항생제 감수성 검사 방법에 비해, 속도 제한 단계 - 세균 성장 - 항생제 적용 중에 생략된다. 이 방법의 기술적 구현은 표준 기술과 혁신적인 접근 방식의 조합입니다. 이 방법의 표준 부분에는 세균 배양 프로토콜, 폴리디메틸실록산(PDMS)의 미세 유체 채널 정의, 형광을 이용한 세포 생존 가능성 모니터링, 박테리아 계수에 대한 배치 이미지 처리 등이 포함됩니다. 이 방법의 혁신적인 부분은 기계적 응력 적용을 위한 배양 매체 흐름의 사용, 박테리아를 손상시키지 만 손상시키지 않는 효소의 사용, 세균 부착을 위한 미세어기 기판의 사용에 있다. 개발 된 플랫폼은 항생제 및 비 항생제 관련 약물 개발 및 테스트에 사용할 수 있습니다. 표준 세균현절 실험과 비교하여, 약물의 효과는 조절 기간 동안 반복적으로 켜고 끌 수 있다. 동일한 세균 집단의 반복적인 관찰은 동일한 실험의 과정을 통해 가능하다.

Introduction

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세균성 저항의 상승은 최후의 수단의 우리의 약을 보호하기 위하여 빠른 표현형 기지를 둔 항생제 감수성 시험에 대한 필요를 강화합니다. 표준 감수성 검사는 여러 (8-24) 시간이 걸리는 항생제의 존재에서 세균 성장 억제에 기초한다. 우리는 항생제의 작용을 가속화하기 위하여 생합성 통로의 긴장 활성화에 의존하는 미세유체 플랫폼에 새로운 항생제 감수성 시험을 개발했습니다.

미세 유체 척도에서 항생제 감수성 검사는 박테리아의 작은 숫자를 필요로하기 때문에 효과적인 샘플 사용의 이점을 수행합니다. 또한, 미세 유체 장치는 다중 조건1,2에서여러 샘플을 테스트하기 위해 멀티플렉스될 수 있다. 최근에는 항생제 감수성 검사를 위한 다수의 미세유체 방법이3-9로보고되고 있다. 이러한 방법에서, 박테리아는 나노 및 피콜리터 물방울3,7,미세 유체 채널4-6,8의전체 부피에서, 또는 채널9의바닥 표면에 전기적으로 국한된 단일 박테리아로서 재배된다. 이 시험은 미세 유체 채널에서 수행되지만, 그들은 모두 기존의 방법과 유사한 항생제의 존재와 부재에서 미생물 성장을 모니터링합니다. 성장 측정은 광학 밀도, pH 민감한 염료 또는 밝은 필드/위상 대비 또는 형광 이미지를 통해 수행됩니다. 이러한 테스트 중 일부는 전통적인 방법 보다 빠른, 그들은 각각 수동적으로 항생제 저항을 감지. 즉, 이러한 방법은 여전히 최종 판독으로 세균 성장을 기다려야 하는 사용자를 요구합니다.

대조적으로, 우리는 항생제에 민감한 생화학적 경로를 활성화하기 위해 전단과 효소 스트레스의 조합을 사용하는 방법을개발했다(10). 그 항생제로 스트레스 박테리아에 도전하는 것은 더 빠른 감수성 시험을 만듭니다. 항생제에 저항하는 박테리아는 스트레스가 많은 조건을 견딜 수 있습니다. 반면에, 민감성 박테리아는 결합된 응력에 의해 급속하게 죽습니다. 형광 죽은 세포 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 측정 된 1 시간 후에 세포 사멸의 비율은 박테리아의 표현형을 정의합니다 (저항성 대 민감성).

우리의 방법의 성공적인 구현을 위해, 박테리아는 미세 유체 채널의 바닥 표면에 고정되어야합니다. 이러한 방식으로 박테리아는 단일 평면에서 현미경으로 다양한 스트레스를 받고 동시에 심을 수 있습니다. 코팅 된 현미경 유리 슬라이드는 박테리아 고정에 사용됩니다. 슬라이드는 비특이적 단백질 결합을 위해 에폭화물 군을 가진 제조 업체에 의해 미리 코팅됩니다. 세균성 표면 단백질에 이러한 에산화물의 비특이적 결합은 박테리아를 슬라이드 표면에 공유합니다.

균주는 항생제의 부재 (대조군) 및 존재 (실험)에서 동일한 조건 (전단 + 효소 스트레스)에서 테스트됩니다. 각 채널의 위상 대비 및 형광 현미경 사진은 1 시간 동안 2 분마다 자동으로 촬영됩니다. 저항 지정은 그 때 대조군 채널에 있는 죽은 박테리아의 백분율을 대조채널에 있는 것과 비교하여 만들어집니다. 1 시간 후에, 세포 죽음 백분율이 1% 보다 큰 견본은 저항의 표시인 동안, 영향을 받기 쉬운 것으로 간주됩니다. 이 두 컷오프 사이에 떨어지는 백분율은 확정되지 않은 것으로 간주되며 샘플을 다시 테스트해야 합니다.

미세 유체 채널은 PDMS에 정의되며, 이는 미세 유체장치(11)에대한 선택의 재료이다. PDMS는 광범위한 파장, 생체 적합성, 불활성, 가스에 투과성이 있는 광활한 범위에서 광학적으로 투명하며 액체에 대한 투과성이 낮습니다. 따라서 이러한 실험에 적합합니다.

기계적/전단 응력은 고정된 박테리아를 통해 실온 매체의 흐름에 의해 생성됩니다. (참고: 미디어를 37°C로 온난화하는 것은 분석 결과에 큰 영향을 미치지 않습니다.) 자동 주사기 펌프는 1 ml/분의 유속으로 미세 유체 채널(200 μm x 400 μm)을 통해 미디어(사구 얼룩 +/-항생제 포함)를 강제하여 6.25kPa의 전단 력 또는 전단 속도 6,000초-1을제공합니다. 이 비율은 황색포도상구균에이전에 연구된 전단 응력과 같거나 초과합니다.

효소, 리소스타핀은 황색포도상구균 세포벽에 직접적인 손상을 일으키기 때문에 예비 실험을 위해 선택되었다. 리소스타핀(0.7 ng/ml)의 농도는 세균성 세포벽 손상을 유발하기에 충분했지만, 실험 기간 내에 항생제 없이 세균세포사멸을 유발하는 것만으로는 충분하지 않았다. Lysostaphin세균성 감수성의 정확한 지정을 위해 필요하지 않습니다 그러나 그것은 영향을 받기 쉬운 긴장에 있는 증가한 세포 죽음으로 이끌어 내는 결과를 증강않습니다. 대조적으로, 전단 응력은 분석 기능에 중요합니다. 메티실린에 민감한 황색포도상구균균이 흐름이 없는 경우 리소스타핀과 옥사실린으로 치료될 때, 실험 과정에서 세포 사멸이 기록되지 않는다.

세포 생존가능성은 형광사세포얼룩(12)으로모니터링된다. 염료의 선택은 손상된 세포만 선택적으로 얼룩지게 하는 능력, 살아있는 세포에 대한 독성, 그리고 낮은 배경 형광에 기초하여, 추가 단계없이 세포 미디어에 직접 첨가할 수 있었습니다. 0.25 μM의 형광염 염료 농도의 선택은 형광 분광광에 대한 1.6초 노출 시간 동안 허용 가능한 신호 수준을 달성하기 위한 것이었다.

베타 락탐, 옥사실린, 우리의 예비 연구에서 사용 되었다. 메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA) 종은 옥사실린에 내성이 있으며 실험 기간 내에 상당한 세포 사멸을 나타내지 않습니다. 50 μg/ml의 농도는 예비 연구에서 결정되었다. 항생제의 낮은 농도는 저항과 영향을 받기 쉬운 긴장 사이 더 적은 분리를 주었습니다, 높은 농도는 실험 결과에 있는 감사한 다름을 일으키는 원인이 되지 않는 동안.

우리는 이전에 세포벽 생합성을 억제하는 항생제로 세균성세포벽(13)에 직접 영향을 미치는 기계적 및 효소 응력을 결합한 시험의 성공적인 개발에 대해보고하였다 14,15. 이러한 원칙 증명 실험은 MRSA 및 메티실린에 민감한 S. 아우레우스(MSSA)의 패널에서 수행되었다. 그러나, 적절 한 실험 매개 변수의 선택으로, 우리의 방법은 박테리아의 여러 종 및 항생제의 여러 클래스에 적용 해야 합니다.

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Protocol

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1. PDMS 레이어 만들기(그림 1)

  1. 10:1 비율로 PDMS 및 경화제를 적극적으로 혼합합니다. 거품을 제거하려면 실온에서 1 시간 동안 진공 챔버에서 점성 혼합물을 탈가스합니다.
  2. 스케일로 알루미늄 금형 위에 PDMS를 천천히 붓습니다. 중앙에서 붓고 금형을 수평상태로 유지합니다. 핀을 지키지 않도록 하십시오. 목표 중량이 달성되면 붓는 것을 중지합니다.
    우리의 금형에는 PDMS 4 g과 경화 시약 0.4 g가 필요합니다.
  3. 오븐 내부의 금형을 평평하게 하고 밤새 37°C에서 치료합니다.
    대체 경화 시간은 60°C에서 2시간 또는 90°C에서 1시간입니다.
  4. 경화 된 PDMS 층을 금형 가장자리를 따라 해부하고 조심스럽게 집게 한 쌍으로 금형 표면에서 벗겨냅니다. 70% 에탄올과 Q-tip으로 금형 표면을 청소합니다.

2. 그림 2에 따라 흐름 셀을 조립합니다.

유리 슬라이드를 갖춘 PDMS의 표준 조립은 두 표면의 산소 플라즈마 처리를 통해 수행되며 PDMS와 현미경 유리 슬라이드 사이의 누출없는 결합을 보장합니다. 제시된 프로토콜에서, 플라즈마 처리는 유리 슬라이드에 화학 코팅을 파괴할 것입니다. 따라서 슬라이드는 플라즈마 처리가 아닌 압력 밀봉입니다.

  1. 유리 창을 유동 셀 포켓에 넣습니다.
  2. 플로우 셀의 주머니 안쪽유리 창 위에 코팅된 유리 슬라이드를 놓고, 채널이 그 위에 내려다보이는 PDMS 층을 배치합니다. 채널 입력이 금속 판의 관통 구멍과 일치하는 방식으로 PDMS 슬라이드를 배치합니다. 레이어 사이에 공기를 부드럽게 밀어냅니다.
  3. PDMS가 유리 창을 향할 수 있도록 PDMS/유리 슬라이드 어셈블리를 뒤집습니다. PDMS 채널 입력을 금속 판의 관통 구멍과 겹칩니다.
  4. 압력 플레이트를 위에 놓고 나사를 조입니다.
  5. 조립된 유동 세포를 현미경 아래에 놓습니다. 현미경 배율을 60X로 설정하고 채널 위치를 미리 정렬합니다.

3. 로그 단계 박테리아 준비

  1. 실험 전날: 세균 성 식민지와 2 % NaCl (MH2)을 포함하는 뮬러 힌턴 국물의 50 ml를 접종. 37 °C에서 하룻밤 250 rpm에서 흔들어.
    하나 또는 두 개의 세균성 균주는 기술된 셋업을 위한 1개의 실험에서 공부될 수 있습니다.
  2. 실험 전: 하룻밤 박테리아 배양 50 μl을 MH2 배지 50ml에 섞는다. 박테리아가 로그 단계에 있는지 확인하기 위해 37 °C에서 3 시간 동안 250 rpm에서 흔들어.

4. 실험 솔루션 구성 요소가 필요 하기 최소 10 분 전에 따뜻하게

  1. 실온에서 형광염료(5mM 스톡) 및 리조스타핀(10 μg/ml 스톡)을 해동한다.
  2. 옥사실린 파우더를 실온으로 데우십시오.

5. 세균 현탁액을 준비하고 적재합니다.

  1. 3 시간 하위 문화가 끝난 후 : 2 분 동안 1,650 x g에서 박테리아 배양 및 원심 분리기 10ml를 복용하십시오.
  2. 상체를 제거하고 신선한 MH2 매체 1 ml에서 박테리아를 다시 중단하십시오.
  3. 1ml 루어 잠금 주사기에 짧은 길이의 튜빙을 부착합니다. 주사기 튜빙을 1 ml의 미디어로 플러시합니다. 세균 현탁액에 그릴 때 기포를 피하기 위해 튜브에 약간의 미디어를 남겨 둡니다.
  4. 주사기에 박테리아 타입 1의 0.7 ml를 로드합니다. 박테리아 유형 1로 유동 세포의 두 개의 채널을 채웁니다. 액체가 ca 후 채널의 반대편에 나타나는 것을 지켜보십시오. 150 μl.
    채널의 투명성은 박테리아로 채워지면서 바뀝습니다.
  5. 여러 박테리아 유형을 실험하는 경우, 유동 세포의 두 개의 나머지 채널로 박테리아 유형 2에 대한 로딩 절차를 반복한다.
  6. 인큐베이터 내부에 유동 셀을 37°C에서 45분 동안 배치하여 슬라이드 표면에 세균침착 및 부착을 허용합니다.

6. 실험 용액을 준비하고 적재합니다.

  1. 형광염 육수(5mM)의 14 μl과 MH2 매체의 126 μl을 혼합하여 0.5mM형염염액 140μl을 준비한다.
  2. 250 μg/ml 옥사실린의 최종 농도를 얻기 위해 MH2 매체의 40 ml에 옥사실린 10 mg을 희석.
  3. 최종 농도0.25 μM 형광염과 0.7 ng/ml의 리조스타핀농도로 130ml의 제어 용액을 준비하십시오. 이렇게 하려면 형광 염료(0.5mMM), 리소스타핀 재고 의 9.12 μl(10 μg/ml) 및 MH2 미디어 130ml를 혼합하십시오.
  4. 최종 농도0.25 μM 형광염, 0.7 ng/ml 의 리소스타핀 및 50 μg/ml 옥사실린의 최종 농도로 130ml의 항생제 용액을 준비하십시오. 이렇게 하려면 형광 염료(0.5mM), 리소스타핀 재고 9.12 μl(10 μg/ml), 옥사실린 26ml(250 μg/ml), MH2 미디어 104ml를 섞는다.
  5. 제어 용액으로 60ml 주사기 2개와 항생제 용액으로 60ml 주사기 2개를 채웁니다. 시약의 빛 유발 저하를 방지하기 위해 알루미늄 호일에 감싼 솔루션을 유지합니다.
    튜빙의 플러시로 인한 손실을 설명하기 위해 주사기를 과다 채웁니다.
  6. 주사기에서 기포를 제거합니다. 실험용 솔루션으로 팁에 입력 튜브를 부착하고 채웁니다.
  7. 펌프에 주사기를 장착합니다. 가장 작은 볼륨으로 주사기를 먼저 배치한 다음 플런저 위치를 잠급합니다. 나머지 주사기에 펌프에 맞고 필요에 따라 플런지를 압박합니다.
  8. 펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 60ml로 설정합니다. 모든 주사기에서 꾸준한 액체 스트림이 보일 때까지 펌프와 함께 플러시하십시오.

7. 현미경으로 유동 셀 설정

  1. 원심분리기에서 유동셀을 제거하고 현미경단계(도 3)에장착한다.
  2. 각 흐름 셀 채널(채널당 하나의 입력/1 출력)에 입력/출력 튜브를 연결합니다.
    4개의 다른 컨테이너로 출력을 수집하면 개별 채널 출력 볼륨을 측정할 수 있습니다.

8. 60분 실험 실행

  1. 2.5단계에서 미리 정렬된 위치를 확인합니다. 현미경 필드 필드가 채널에 중심이 없거나 초점이 바 절되지 않은 경우 설정을 조정하고 새 위치를 저장합니다.
    적재된 박테리아의 고밀도로 인해 흐름이 시작되기 전에 정밀한 초점 집중이 불가능할 수 있습니다.
  2. 위상 대비 획득 시간을 10msec로 설정하고 형광 획득 시간을 1,600msec로 설정합니다.
  3. 흐름을 시작하기 전에 각 위치에 대한 위상 대비 및 형광 이미지를 가져옵니다.
    이것은 로드된 세균성 조밀도의 질적 추정치를 제공합니다.
  4. 액체 흐름을 시작하고 현미경이 채널의 바닥에 초점을 맞추고 있는지 즉시 확인합니다.
  5. 흐름의 첫 번째 분 이내에 대상 영역의 위상 대비 및 형광 이미지를 가져 가라.
  6. 첫 번째 이미지 세트 가 60분까지 이미지를 수집합니다. 필요에 따라 다시 초점을 맞춥니다.

9. 흐름 셀 소독

  1. 비커(100ml)로 표백제 용액을 10% 만듭니다. 혼합물 의 10ml와 함께 4 x 20ml 주사기를 채웁니다. 주사기를 디플로우하고 유량 셀에 부착합니다.
    채널이 박테리아가 명확해지려면 ~ 1-2 분이 소요됩니다.
  2. 펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 3ml로 설정합니다. 3분 동안 실행하십시오.
  3. 4 x 60ml 주사기를 60ml의 DI 워터로 채웁니다. 주사기를 디플로우하고 유량 셀에 부착합니다.
  4. 펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 30ml로 설정합니다. 30분 동안 실행하십시오.
  5. 현미경으로 채널 청소를 모니터링합니다.
  6. 흐름 셀을 분해합니다. 사용 된 에폭시 슬라이드를 폐기하십시오. 20 분 동안 DI 물에 유동 셀 성분을 담급니다.

10. 이미지를 분석하고 데이터를 생성합니다.

  1. 각 이미지의 박테리아 수를 계산합니다.
    오픈 액세스 소프트웨어인 CellProfiler는 배치 이미지처리(16)를수행하는 데 사용됩니다. CellProfiler 루틴의 높은 수준의 윤곽선은 표 1에요약됩니다. 상 대비 영상(Np)에존재하는 박테리아의 수는 총 세균 수를 준다. 형광 이미지(Nf)에서보이는 박테리아의 수는 죽은 박테리아의 수를 준다.
  2. 시간의 함수로 정규화된 세균 세포 사멸 비율을 계산합니다.
    1. 개별 이미지에 대한 Nf 및 Np를 데이터 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
    2. t = T에서 분획(Nf/N p)에의해 주어진 특정 시점에서 각 채널의 죽은 박테리아의 분수를 계산합니다.
    3. 실험 의 시작 부분에 존재하는 죽은 박테리아의 분획을 빼는다 (t = 1 분) 대조군 및 실험 채널 모두에 대한.
    4. 다음 방정식으로 각 시점에서 실험 채널에 존재하는 것에서 제어 채널에 존재하는 죽은 박테리아의 분수를 뺍니다.

      Data Analysis Equation

    5. 실험 과정에 대한 그래프 DP규범 대 t.
      세포 사망률이 1% 이상인 샘플은 취약하다고 판단되는 반면, 0.5% 미만의 사망은 저항성을 나타냅니다. 이 두 컷오프 사이에 떨어지는 백분율은 확정되지 않은 것으로 간주되며 샘플을 다시 테스트해야 합니다.
    6. 스프레드시트를 사용하여 다양한 실험의 결과를 요약하고 분석합니다.

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Representative Results

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도 4에 제시된 데이터는 항생제 함유 미세 유체 채널에서 시간이 지남에 따라 취약한 황색포도상구균 균주의 반응을 보여줍니다. 1분에서 획득한 위상 대비 이미지는 1시간 실험의 끝에 그림 4A 및 B로 나타낸다. 분석된 1시간 데이터는 적색(5,828)으로 강조표시된 박테리아와 함께 도 4C로 도시된다. 해당 형광 이미지는 그림 4DE로표시됩니다. 분석된 1시간 데이터는 적색(174명 사망)으로 강조된 형광균을 가진 도 4F로 도시된다.

이 이미지 집합은 여러 점을 보여 줍니다. 가장 중요한 것은, 형광균의 수가 크게 증가하여 실험이 끝날 때까지 관찰된다(그림 4DE에서1분 60분에서 밝은 형광반의 수를 비교함), 이는 채널 내부의 세포 사멸을 나타낸다. 이러한 결과는 취약한 변형을 나타냅니다.

주목해야 할 또 다른 중요한 점은 위의 방정식에 사용되는 정규화의 필요성입니다. 개별 에폭시 슬라이드 코팅의 확률 불균일성으로 인해, 지속적인 전단 압력하에서 실험 전반에 걸쳐 세균세포 손실이 있을 수 있다(그림 4AB비교). 이러한 변이를 고려하기 위해, 죽은 세포 집단의 각 형광 이미지는 결합된 상 대비 영상으로 정규화되어 총 세포 집단을 동시에(1초 이내)한다.

실험 시작 시 정규화된 형광(t=1분)을 다른 모든 시간점(t=T)에서 빼서 한 번 더 정규화하게 수행한다. 1분에서 의 죽은 세포 형광은 실험의 시작 전에 세포 사멸에 해당한다. MSSA 또는 MRSA에 대한 실험의 시작 부분에서 관찰된 높은 형광은 일반적으로 세균 배양의 가난한 상태를 나타낸다. 드문 경우지만 PDMS 슬라이드의 오염을 나타냅니다.

이미지의 하단 모서리에 있는 인셋은 원시 이미지와 분석된 이미지 모두에서 박스에 있는 이미지 영역의 확대 버전입니다. 이러한 확대는 우리의 계산 알고리즘이 인구밀도가 높은 위상 대비 이미지보다 형광 이미지에서 개별 박테리아를 정확하게 세는 데 더 성공적이라는 것을 보여줍니다.

죽은 세포 얼룩은 개별 죽은 박테리아에 대한 높은 형광 대비를 제공합니다. 형광균의 수는 거의 총 수의 5 %를 능가하기 때문에, 각 박테리아는 배경에 비해 매우 밝습니다. 이러한 이유로 형광균은 높은 정확도로 쉽게 계산할 수 있다. 한편, 박테리아는 위상 대비 이미지에 조밀하게 포장된다. 더욱이, 박테리아 내의 위상 대비가 항상 균일하지는 않습니다. 이 두 가지 요소는 대략적인 크기 범위와 강도에 따라 서로 다른 영역의 임계값에 의존하기 때문에 계산 알고리즘에 대한 과제를 제시합니다.

따라서 실험 결과를 비교하려면 다른 실험에서 동일한 매개 변수를 사용하여 동일한 계수 알고리즘을 사용해야 합니다. 형광 수의 낮은 수로 인해 형광 오수에 대한 민감도가 높다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 따라서 위상 대비 이미지보다 형광 이미지를 정확하게 계산하는 것이 더 중요합니다.

마지막으로, 위의 방정식에 따라 정규화된 MSSA 및 MRSA 데이터는 세 가지 다른 실험에 대해 도 5에 도시된다. 내성 균주에 대한 예상대로, 정규화된 세포 사멸은 크기가 낮습니다(<0.5%) 실험 과정에서 변경되지 않습니다. 민감균은 실험이 끝날 때까지 세포 사멸의 꾸준한 증가와 더 높은 값을 나타낸다(>1%). 취약한 긴장에 대한 세포 죽음의 개시는 실험 사이 약간 변화합니다, 그러나 일반적으로 10-30 분 사이에서 머무릅니다.

Figure 1
그림 1. PDMS 층의 미세 유체 채널의 형상과 크기를 보여주는 사진입니다. 채널의 좁은 부분은 길이 3.7cm, 높이 200 μm, 너비 400μm입니다.

Figure 2
그림 2. 각 흐름 셀 구성 요소와 상대 위치를 설명하는 CAD 모델입니다.

Figure 3
그림 3. 현미경 및 주사기 펌프의 실험적인 설정을 보여주는 사진입니다.

Figure 4
그림 4. 항성 내의 대표적인 MSSA 균주에 대한 위상 대비(A-C) 및 형광(D-F) 이미지. Inset은 박스로 된 영역의 확대된 이미지를 표시합니다. 현미경 이미지는 60X 배율에서 획득되었습니다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5. 정규화된 세포 사망률과 시간을 나타내는 그래프입니다. 각각의 MSSA 및 MRSA 균주는 세 가지 별도 실험에서 테스트되었다.

Table 1
표 1. 자동화된 박테리아 계수를 위한 CellProfiler 루틴 성분.

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Discussion

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제시된 프로토콜은 메티실린에 민감하고 메티실린 내성 황색포도상구균 10균을가진 실험 세트에서 검증되고 최적화되었다. 따라서 수정없이이 프로토콜은 세균성 세포 벽 생합성에 영향을 미치는 작용 메커니즘을 가진 S. 아우레우스 및 기타 항생제의 다른 균주에 직접 적용해야합니다. S. 아우레우스 이외의 박테리아 유형은 스트레스 매개 변수의 변이를 요구할 수 있습니다: 수용성 (효소) 및 기계적 스트레스. 용해성 스트레스제가 포도상 구균 이외의 세균 종의 시험에서 원하는 경우 리소스타핀은 포도상구균이기때문에 다른 스트레스 에이전트가 필요합니다 - 특정 효소.

전단 응력의 양은 액체의 유량에 비례하며 채널의 크기에 반비례하므로 원칙적으로 는 값의 넓은 범위 내에서 다양할 수 있습니다. 응력의 달성된 값은 다음과 같은 실험적 요인에 의해 제한됩니다: 더 높은 유량 하에서 박테리아를 제자리에 고정하는 고정기질의 능력, 누출 없이 고압을 유지하는 미세유체 조립, 시스템 내부의 액체 유동 저항, 유량 불안정하게 만들거나 심지어 낮은 유량에서 중단할 수 있다. 결합의 강도는 S. 아우레우스 실험에 충분했지만, 세균종의 유량 또는 변화의 증가는 다른 코팅 유형을 요구할 수 있다. 에폭시 코팅 슬라이드는 통상적으로 단백질 마이크로어레이 분석에 사용되며 대형 세포 체체를 보유하도록 특별히 설계되지 않았습니다. 코팅의 제형 및 밀도가 독점적이기 때문에, 제어된 표면 코팅 증착을 가진 대체 제형의 개발은 매우 바람직하다.

우리는 최근에 세균성 배양 및 부착에 필요한 시간의 양을 크게 줄일 수 있음을 발견했다. 콜로니를 3시간 이내에 소량의 매체로 한천판에서 직접 로그 단계로 성장하여 야간 문화 단계를 제거할 수 있습니다. 또한, 부착은 1분 동안 유동 세포 내부의 박테리아를 원심분리하여 가속하여 45분 의 정착 시간을 제거할 수 있다. 우리의 실험실에 있는 실험은 현재 이 약식 프로토콜로 실행되고 있습니다.

프로토콜은 세균성 세포벽 생합성을 표적으로 하는 항생제를 위해 특별히 디자인되었지만, 최근 연구에 따르면 세균 세포에서 다른 1차 표적을 가진 항생제는 동일한 다운스트림 세균 반응 경로를 활성화한다는 것을17,18. 따라서, 우리의 방법은 세포 벽 생합성과 관련이 없는 생합성 통로를 표적으로 하는 항생제에 대한 감수성을 신속하게 식별하는 데 적용될 수 있으며, 실험실에서의 초기 연구는 이러한 가설에 대한 신빙성을 부여합니다.

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Disclosures

미세 유체 방법은 특허 출원 중입니다: 사우어-버지 A, 샤론 A, 칼라쉬니코프 M, Wirz H, 발명가; 세균성 항생제 내성/감수성 특허 PCT/US10/33523의 신속한 검출을 위한 방법 및 장치.

Acknowledgments

우리는 제조 혁신을위한 Fraunhofer 센터의 엔지니어와 학생들에게 감사드립니다. 실험 시스템의 설계, 가공 및 자동화를 돕기 위해 안드레아스 프린젠, 홀거 워스, 더그 포스, 데이비드 차긴, 수동 슈 박사에게 감사드립니다. 줄리아 쿠카르츠, 멜라니 짐머만, 니코 크라에츠마르, 팀 검벨, 조쉬 비야누에바, 미노리 시미즈, 카타르지나 쿨리가 실험 프로토콜 및 데이터 수집 테스트에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 셀 프로파일러의 이미지 분석 루틴의 개발에 도움을 하버드와 MIT의 넓은 연구소에서 이미징 플랫폼의 박사 앤 E. 목수와 마크 앤서니 브레이 박사를 인정합니다. 설명된 이 프로젝트는 국립 알레르기 및 감염증 연구소의 R21AI079474 및 1R01AI101446에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 알레르기 및 전염병 연구소 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 프로젝트는 또한 프라운호퍼 미국에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SYTOX Green Invitrogen Corporation S7020 Dead cell fluorescence stain
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich, Inc A9418-5G Used for lysostaphin storage
Sodium Acetate Sigma Aldrich, Inc S8750-500G Used for lysostaphin storage
Lysostaphin  Cell Sciences CRL309A Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml  lysostaphin for storage 
Oxacillin salt Sigma Aldrich, Inc 28221-1G Antibiotic
Mueller Hinton Broth Fisher Scientific DF0757-17-6
Sodium chloride Sigma Aldrixh S3014-500G 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving
1 ml, Luer-lock syringe  BD (Beckton, Dickinson and Comp.) 14-823-2F
2 oz, Luer-lock syringe BD (Beckton, Dickinson and Comp.) 309653 - 60 mL Overfill to ~65 ml
Microscope
Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 Cambridge Scientific 9349
60X, Fluorescence/Phase contrast objective Olympus Corp. LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-bit monochrome CCD camera QImaging RET-4000R-F-M-12-C
Microscope automation
Shutters phase contrast/fluorescence PRIOR Scientific H204/H202
X/Y Stage  PRIOR Scientific H107AENN
Focus motor PRIOR Scientific H122
Joystick for XYZ control PRIOR Scientific CS152EF
Proscan Controller PRIOR Scientific H3-XY2
Image Acquisition Software Fraunhofer CMI
Flow Cell Assembly and PDMS
Flow Cell BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI 3333-1044 Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI
Glass window Fraunhofer CMI 3333-1054 Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI
BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm Edmund Optics Inc. NT48-543
Sealing plate BU Scientific Instruments Facility 3333-1045
Epoxide glass slide Arrayit Corporation SuperEpoxy 2
PDMS master Fraunhofer CMI 3333-1053 Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)
PDMS slide design Fraunhofer CMI 3333-1053
Tubing
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green  IDEX Health Science M-644-03 Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule
Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black IDEX Health Science M-657
Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural IDEX Health Science P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow IDEX Health Science P-259 Fits Luer-lock adapter
Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green  IDEX Health Science 1520G
Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red  IDEX Health Science P-658

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References

  1. Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
  2. Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
  3. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
  4. Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
  5. Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
  6. Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
  7. Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
  8. Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
  9. Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
  10. Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
  11. McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
  12. Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
  13. Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
  14. Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
  15. Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
  16. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
  17. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
  18. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트
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Kalashnikov, M., Campbell, J., Lee, J. C., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip. J. Vis. Exp. (83), e50828, doi:10.3791/50828 (2014).More

Kalashnikov, M., Campbell, J., Lee, J. C., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip. J. Vis. Exp. (83), e50828, doi:10.3791/50828 (2014).

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