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Immunology and Infection

प्राकृतिक ट्रांसमिशन पर क्षय रोग मलेरिया coinfection अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग और प्लाज्मोडियम berghei Published: February 17, 2014 doi: 10.3791/50829
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Infectious Diseases, Parasitology Unit, University Hospital Heidelberg, 2Priority Area Infections, Research Center Borstel

Summary

टीबी और मलेरिया मानव और उष्णकटिबंधीय में गरीब आबादी में रुग्णता और मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में सबसे अधिक प्रचलित संक्रमण के दो हैं. हम संक्रमण के अपने प्राकृतिक मार्ग के माध्यम से दोनों रोगजनकों के साथ चुनौती के बाद चूहों में मलेरिया तपेदिक coinfection के परिणाम का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल प्रणाली की स्थापना की.

Abstract

Coinfections स्वाभाविक रूप से होने के कारण रोगजनक जीवों के विशिष्ट प्रकार की भौगोलिक ओवरलैप करने के लिए होते हैं. समवर्ती संक्रमण सबसे अधिक संभावना प्रत्येक एकल रोगाणु संबंधित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मिलाना और इस तरह रोगजनन और रोग परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. Coinfected रोगियों को भी विरोधी संक्रामक हस्तक्षेप करने के लिए विभिन्न प्रकार से प्रतिक्रिया हो सकती है. माइक्रोबैक्टीरिया और उप सहारा अफ्रीका के कई हिस्सों में coendemic हैं जो दोनों मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम,, के कारण के रूप में तपेदिक के बीच coinfection विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया है. वैज्ञानिक और मलेरिया तपेदिक coinfection न्यूनाधिक मेजबान उन्मुक्ति और प्रत्येक रोग के पाठ्यक्रम, हम हमारे coinfected मेजबान में दोनों रोगजनकों को हासिल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया काटना करने की अनुमति देता है कि एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल की स्थापना कैसे चिकित्सकीय अत्यधिक प्रासंगिक सवाल चुनौतीपूर्ण लेकिन दृष्टिकोण करने के लिए आदेश में . ध्यान से, बहुत सटीक नकल स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया मानव संक्रमण के क्रम में, हम प्रयोगात्मक प्रदर्शनक्रमश: संक्रमण के अपने प्राकृतिक मार्गों, यानी एयरोसोल और मच्छर के काटने, द्वारा दोनों रोगजनकों के साथ चूहों के संक्रमण.

Introduction

मानव आबादी मुश्किल से ही केवल एक रोगज़नक़ के संपर्क में हैं. विशेष रूप से उप सहारा अफ्रीका के रूप में संक्रमण के उच्च घटना के साथ क्षेत्रों में, coinfections एक प्रमुख लेकिन अत्यधिक underappreciated सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. टीबी और मलेरिया क्रमशः मनुष्यों में सबसे अधिक प्रचलित जीवाणु और परजीवी के संक्रमण हैं और उष्णकटिबंधीय में गरीब आबादी में रुग्णता और मृत्यु दर के प्रमुख कारणों में बने हुए हैं. Coinfection के जोखिम में तपेदिक और मलेरिया और व्यक्तियों की एक बड़ी संख्या के बीच व्यापक भौगोलिक ओवरलैप के बावजूद, बहुत कम एक साथ coinfected व्यक्तियों में मलेरिया परजीवी और tubercle बेसिली के खिलाफ हासिल विभिन्न और अक्सर प्रतिकार प्रतिरक्षा नियामकों और effectors के बीच बातचीत के बारे में जाना जाता है.

मिश्रित संक्रमण के कृंतक मॉडल इस प्रकार आपसी असर पर प्रकाश डालने वाली एक मेजबान में अलग रोगजनकों के खिलाफ अंतर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं निस्र्पक की अनुमतियह भी उपचार और रोकथाम के लिए नई सिफारिशें की पहचान करने में मदद मिलेगी जो नियमन करने वाली विकृति और व्यक्तिगत रोग के नैदानिक ​​परिणाम, ences. हम एक ही मेजबान 1 भीतर माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग (एमटीबी) के साथ समवर्ती संक्रमण की वजह से नतीजों और कृंतक प्लाज्मोडियम प्रजातियों की जांच करने के लिए सक्षम बनाता है, जो एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल की स्थापना की है. महत्वपूर्ण बात है, यथासंभव स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया मानव संक्रमण का अनुकरण करने के लिए, हमारे मॉडल दोनों रोगजनकों द्वारा इस्तेमाल किया संक्रमण का प्राकृतिक मार्गों लागू करता है. क्षय रोग इसलिए मुख्य रूप से फेफड़ों में प्रकट होता है जो एक हवाई संक्रमण है. वे खांसने या छींकने के दौरान संक्रामक एयरोसोल बूंदों निष्कासित जब प्रेरणा का एजेंट, एमटीबी एयरोसोल ट्रेन के माध्यम से सक्रिय रोग के साथ लोगों के द्वारा फैलता है. इस प्रकार, एयरोसोल संक्रमण प्राकृतिक संक्रमण की नकल करने के लिए पसंद की विधि है. एमटीबी होते हैं कि हवाई कणों की पीढ़ी का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता हैएक साँस लेना जोखिम प्रणाली की. यह पूरे शरीर जोखिम कक्ष संक्रामक एयरोसोल बूंदों संक्रमण 2 शुरू की है जहां फेफड़ों के अलवियोली में साँस रहे हैं जो चित्रा (1) एमटीबी युक्त करने के लिए प्रायोगिक पशुओं को प्रकाश में लाने की अनुमति देता है.

दूसरी ओर मलेरिया स्वाभाविक रूप से एक महिला Anopheline मच्छर के काटने से फैलता है कि प्रोटोजोआ, Apicomplexan परजीवी प्लाज्मोडियम की वजह से एक वेक्टर जनित रोग है. रक्त भोजन के दौरान संक्रामक बिजाणुज मेजबान त्वचा के नीचे जमा कर रहे हैं और बाद में रक्त प्रवाह के माध्यम से जिगर तक पहुँचने. Hepatocytes के भीतर ही वे विकास और तेजी से जिगर चरण schizonts में गुणा. आखिरकार, परिपक्व schizonts टूटना और वे लाल सेल आक्रमण, प्रतिकृति, लाल सेल टूटना, और reinvasion 3 के एक प्रगतिशील चक्र आरंभ जहां रक्त प्रवाह में रोगजनक पहली पीढ़ी खंडजाणु के हजारों जारी. प्लाज्मोडियम जीवन चक्र Continकुछ खंडजाणु रूप ues, यौन परजीवी चरणों में रक्त भोजन के दौरान मच्छरों द्वारा उठाया जा सकता है, जो पुरुष और महिला gametocytes, विकास. मच्छर में, प्लाज्मोडियम स्पोरोजोएट्स मच्छर आद्यमध्यांत्र में रहने oocysts के भीतर विकसित करने और अंत में एक और मेजबान 3,4 में आगे भेजने के लिए लार ग्रंथियों की ओर पलायन.

प्रयोगात्मक पशु मॉडल में एयरोसोल और इस तरह सबसे अधिक प्रासंगिक मार्ग के माध्यम से एमटीबी की डिलीवरी बहुत आम है, वहीं मलेरिया तपेदिक coinfection 5-7 पर अध्ययन सहित कई प्रयोगात्मक कृंतक प्लाज्मोडियम संक्रमण पढ़ाई जन्म दे रही है, parasitized एरिथ्रोसाइट्स के साथ चूहों से संक्रमण से बाहर किया गया है चिकित्सकीय चुप जिगर चरण चरण को छोड़कर, जबकि रक्त चरण मलेरिया संक्रमण के लिए. हालांकि, जिगर चरण विरोधी plasmodial उन्मुक्ति 8-11 के लिए संक्रमण और प्रासंगिक दौरान एक अनिवार्य कदम है. हम यकृत पीएच शामिल करने के लिए यह इसलिए महत्वपूर्ण है पर विचारमलेरिया संचरण और क्रमशः मलेरिया और मलेरिया तपेदिक coinfection, दोनों की पढ़ाई में रखरखाव के एएसई. इसके अलावा, यह स्वाभाविक रूप से प्रेषित बिजाणुज बजाय पृथक लार ग्रंथि व्युत्पन्न बिजाणुज इंजेक्शन लगाने के काटने मच्छर से मलेरिया संक्रमण की स्थापना के लिए हमें प्रेरित जो सुई संक्रमण 12, के माध्यम से प्रेषित उन लोगों से ज्यादा संक्रामक है कि दिखाया गया है. मलेरिया परजीवी के प्राकृतिक प्रसारण के लिए संक्रामक मच्छरों को प्राप्त करने का एकमात्र तरीका हड्डीवाला मेजबान (यहाँ माउस) और मच्छर वेक्टर दोनों में परजीवी के पूरे जीवन चक्र को बनाए रखने की है. इस प्रकार, परजीवी के रखरखाव के लिए एक कीटपालन के लिए उपयोग काटने से प्राकृतिक संचरण प्रदर्शन करने के क्रम में अपरिहार्य है.

यहाँ बताया हमारे प्रोटोकॉल प्लाज्मोडियम साथ coinfection पुरानी तपेदिक 1 पर प्रभाव डालता है बिजाणुज जांच के लिए कैसे विकसित किया गया था. ऐसा करने के लिए, चूहों एयरोसोल एम. से संक्रमित होते हैं तपेदिक और 40 दिन बाद, जब एम. तपेदिक संक्रमण चूहों मलेरिया संक्रामक मच्छरों को उजागर कर रहे हैं, पुरानी चरण तक पहुँच गया है. coinfected पशुओं में मलेरिया और तपेदिक दोनों के परिणाम क्रमश: ऊतकों में रक्त पेरासाइटिमिया और जीवाणु लोड की निगरानी के द्वारा पीछा किया जा सकता. हमारे प्रोटोकॉल में, हम उनके प्राकृतिक संक्रमण मार्ग और कैसे सफल रोगज़नक़ संचरण पुष्टि करने के लिए के माध्यम से दोनों रोगजनकों के साथ चूहों को संक्रमित करने के लिए कैसे विस्तार से वर्णन करेंगे. हमारे हाथ में, दोनों प्रयोगात्मक संक्रमण के लिए आमतौर पर हासिल की संक्रमण दर 100% है. इन प्रोटोकॉल सबसे चुनौतीपूर्ण मानव संक्रामक रोगों की दोनों के बीच coinfection मॉडल और अध्ययन करने के लिए हम क्या कर के रूप में अलग से संक्रमण या, दोनों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है. यह मॉडल इस प्रोटोकॉल में वर्णित लोगों परे अन्य माइकोबैक्टीरियम और कृंतक प्लाज्मोडियम प्रजातियों के लिए लागू है.

Protocol

सुरक्षा उपायों और नीतिशास्त्र विवरण

प्रस्तुत अध्ययन के साथ साथ मानव रोगज़नक़ एमटीबी और कृंतक मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम berghei (पी. berghei) के साथ काम शामिल है. एमटीबी (तनाव H37Rv) और पी. के साथ प्रयोग berghei उपयुक्त जैव सुरक्षा शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. जैवसुरक्षा स्तर (बीएसएल) 2 प्रयोगशालाओं ऐसे पी. के रूप में कृंतक मलेरिया परजीवी के लिए आवश्यक हैं इसलिए berghei और एमटीबी के लिए बीएसएल 3 और सभी coinfection पढ़ाई के लिए यहाँ बताया. नोट: एमटीबी से संक्रमित चूहों तत्काल आसपास के क्षेत्र के भीतर अन्य चूहों को (अपने स्वयं के अवलोकन) संक्रमण नहीं फैला है. प्रयोगकर्ता में फैल इसलिए बाहर रखा जा सकता है, लेकिन उचित सुरक्षात्मक कपड़े हर समय बीएसएल 3 प्रयोगशाला के अंदर पहना होना चाहिए. हमारे नियमों के अनुसार, प्रयोगकर्ताओं बाहरी एक कभी भी खारिज कर दिया है जिनमें से शल्य चिकित्सा scrubs, बाल जाल, डिस्पोजेबल respirators, और दस्ताने के दो जोड़े, पहननेआरएमएस कैबिनेट से वापस ले रहे हैं. नए लोगों को फिर से कैबिनेट में प्रवेश करने से पहले पर डाल रहे हैं. दो कंटेनरों, 2% Buraton साथ एक (नोट: एमटीबी निष्क्रिय करने के लिए मंजूरी दे दी अन्य disinfectants अनुमोदित एकाग्रता में इस्तेमाल किया जा सकता है) तरल और संक्रामक अपशिष्ट पदार्थ के लिए और सतह परिशोधन के लिए एक, प्रयोग से पहले तैयार किया है और मंत्रिमंडल के अंदर रखा जाता है. इसके अलावा, प्लास्टिक की थैलियों ठोस noninfectious कचरे के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. जर्मन नियमों के अनुसार, एमटीबी से व्युत्पन्न एमटीबी संस्कृतियों या ऊतक की हैंडलिंग और प्रसंस्करण से जुड़े सभी काम चूहों एक BSL3 प्रयोगशाला के भीतर एक वर्ग 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट में बाहर किया जाना चाहिए संक्रमित. माइक्रोबैक्टीरिया से निपटने वहीं उपायों को हर समय एयरोसौल्ज़ की पीढ़ी से बचने के लिए लिया जाना है.

6-8 सप्ताह के बीच वृद्ध महिला C57BL 6 / चूहों (चार्ल्स नदी) सभी coinfection प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया और बीएसएल में विशिष्ट बाधा की स्थिति में 3 सुविधाओं के तहत बनाए रखा गया. पशु की देखभाल और प्रयोग पीई थेकृषि, पर्यावरण, और Schleswig-Holstein के राज्य के ग्रामीण क्षेत्रों के लिए मंत्रालय के पशु प्रयोगों के लिए आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार rformed

मलेरिया मच्छर चरणों प्राप्त करने के लिए, NMRI चूहों चार्ल्स नदी प्रयोगशाला, Sulzfeld, जर्मनी से खरीदे गए थे और विश्वविद्यालय के हीडलबर्ग जानवरों की सुविधा (आईबीएफ) के भीतर विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में रखा. सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया और Baden-Württemberg (Regierungspräsidium कार्लज़ूए) की राज्य के अधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. एक Glas कर्नल एयरोसोल कक्ष का उपयोग एमटीबी के साथ चूहों के एयरोसोल संक्रमण

एमटीबी साथ प्रायोगिक पशुओं की एयरोसोल संक्रमण मानकीकृत करने के लिए सबसे अच्छा तरीका ज्ञात CFU titers के साथ जमे हुए शेयरों से माइक्रोबैक्टीरिया उपयोग करने के लिए है. शेयर संस्कृतियों तैयार करते हैं, Middlebrook 7H9 शोरबा में संस्कृति एमटीबी OADC (oleic के साथ पूरकएसिड, albumin, dextrose, Catalase) संवर्धन मध्यम और 0.05% के बीच 80, माइक्रोबैक्टीरिया के लिए एक कार्बन स्रोत और एक ही समय में बैक्टीरियल clumping से बचने के उपाय. संस्कृति फसल के समय में एक आयुध डिपो ≤ 1 होना चाहिए. उच्च आयुध डिपो में बैक्टीरियल clumping बढ़ जाती है और व्यवहार्यता कम हो जाती है. सेल्सियस -80 पर स्टोर 1 मिलीलीटर aliquots 0.5% ग्लिसरॉल, 1 जी / एल asparagine के साथ पूरक 7H11 अगर प्लेटों पर तीन स्वतंत्र शीशियों का 10 गुना dilutions की एक श्रृंखला चढ़ाना द्वारा जमी शेयरों में इकाइयों (CFU) के गठन व्यवहार्य कॉलोनी की संख्या, और OADC निर्धारण और 4 के बाद कालोनियों गिनना 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के सप्ताह नीचे वर्णित के रूप में एयरोसोल संक्रमण प्रदर्शन करना.

  1. ध्यान से पिघलना एमटीबी ज्ञात CFU अनुमापांक के शेयरों और एक 27 जी सुई के साथ लगे एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग बैक्टीरियल clumps फैलाने के निलंबन पांच बार मिश्रण. एयरोसौल्ज़ का उत्पादन करने से बचें.
  2. वांछित संक्रमण खुराक पर निर्भर करता है, में माइक्रोबैक्टीरियल स्टॉक की मात्रा स्थानांतरणबाँझ पीबीएस युक्त एक 50 मिलीलीटर ट्यूब. अंतिम मात्रा 6 मिलीग्राम है. नोट: इस निलंबन में सूक्ष्मजीव की संख्या से अलग, एयरोसोल बूंदों असर बैक्टीरिया के अनुपात में विविध है. हम आम तौर पर फेफड़ों (कम खुराक संक्रमण) प्रति 100 व्यवहार्य बेसिली की एक तेज करना है. हमारे अनुभव में, इस 5.5 मिलीलीटर nebulized कर रहे हैं, जिनमें से 6 मिलीलीटर की कुल मात्रा में चारों ओर 1-2 एक्स 10 6 एमटीबी / एमएल (देखें नीचे) की आवश्यकता है. यह अपने संक्रमण के लिए आदर्श स्थिति को खोजने के लिए बैक्टीरिया के विभिन्न सांद्रता के साथ प्रयोगात्मक एयरोसोल चुनौतियों की एक श्रृंखला कर सिफारिश की है. अप करने के लिए 5,000 माइक्रोबैक्टीरिया साथ उच्च खुराक संक्रमण 5 जीवाणु के रूप में कुछ सफलतापूर्वक एयरोसोल द्वारा चूहों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में संक्रामक प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए किया जा सकता है जबकि. संक्रमण की दर आमतौर पर 100% है.
  3. Inoculum अनुमापांक निर्धारित करने के लिए चढ़ाना के लिए (आवश्यक अंतिम मात्रा से अधिक में तैयार) पर्याप्त मात्रा निकालें, हम आम तौर पर तकनीकी triplicates थाली करने के लिए 500 μl हटा दें.
  4. में जानवरों रखेंएक compartmented जाल परिपत्र एयरोसोल कक्ष के भीतर टोकरी (टोकरी प्रति एक माउस) और एयरोसोल चैम्बर के ढक्कन बंद करें. नोट: अन्य मॉडल 20 चूहों को समायोजित कर सकते हैं, जिनमें से प्रत्येक पांच व्यक्ति डिब्बों से बना एक पाई के आकार टोकरी से सुसज्जित हैं.
  5. तीन स्टेनलेस स्टील सॉकेट जोड़ों को Venturi-छिटकानेवाला इकाई संलग्न.
  6. एक 18 जी कुंद सुई के साथ लगे एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूब से माइक्रोबैक्टीरियल निलंबन निकालें और एक बंद परिवहन बॉक्स में एयरोसोल चैम्बर के लिए सिरिंज ले.
  7. छिटकानेवाला इकाई के पेंच टोपी निकालें और ध्यान छिटकानेवाला में माइक्रोबैक्टीरिया निलंबन इंजेक्षन. एयरोसौल्ज़ की पीढ़ी से बचें. 2% Buraton युक्त एक sharps कंटेनर में सिरिंज त्यागें. पेंच टोपी के साथ छिटकानेवाला सील.
  8. मुख्य बिजली स्विच और यूवी लैंप पर स्विच करें. नियंत्रण कीपैड पर प्रदर्शन "Glas कर्नल उपकरण सह" से पता चलता है.
  9. कार्यक्रम स्विच ऑन करें. प्रदर्शित करेगाशो "छिटकानेवाला तैयार है?" "टोकरी भरी हुई है?" जब तैयार प्रेस दर्ज करें ". प्रेस दर्ज करें.
  10. प्रदर्शन "पहले से गरम समय 900 दर्ज" से पता चलता है, यह 900 सेकंड है (निकास हवा decontaminates जो) क्रीमेटोरिअम के लिए पहले से गरम समय का मतलब है. प्रेस दर्ज करें.
  11. प्रदर्शन दिखाने "Nebulizing समय 1,800 दर्ज" जाएगा, यह nebulizing समय डिफ़ॉल्ट रूप में 1,800 सेकंड के लिए निर्धारित है इसका मतलब है. Nebulizing समय का विस्तार करने के लिए, "2400" दर्ज करें और प्रेस दर्ज करें. नोट: nebulizing चक्र के दौरान दबाव में हवा जिससे माइक्रोबैक्टीरिया युक्त छोटे एयरोसोल बूंदों पैदा करने, निलंबन atomizes. मुख्य वायु प्रवाह के साथ, इन बूंदों (आकार में लगभग 2-5 माइक्रोन) एयरोसोल चेंबर में किया जाता है.
  12. प्रदर्शन दिखाने "सीडी समय 1,800 दर्ज" जाएगा, यह क्षय चक्र 1,800 सेकंड लेता है कि इसका मतलब है. "2400" और प्रेस दर्ज करने के लिए सेट करें. नोट: इस चक्र के दौरान, बादल जो यू बनाया गया हैnebulizing चक्र के दौरान एयरोसोल कक्ष में पी क्षय कर सकते हैं. छोटी बूंदों प्रायोगिक पशुओं से साँस रहे हैं.
  13. प्रदर्शन "दिसम्बर समय 900 दर्ज" दिखाएगा, यह यूवी प्रकाश परिशोधन चक्र 900 सेकंड ले जाएगा. प्रेस दर्ज करें. मशीन पहले से गरम, nebulizing, बादल क्षय और यूवी परिशोधन के माध्यम से साइकिल चालन शुरू कर देंगे.
    चेतावनी:; और चक्र शुरू होता है nebulizing जब संकुचित वायु प्रवाह मीटर 10 घन फीट / घंटा (जाँच, उसके अनुसार हवाई नियंत्रण वाल्व समायोजित वैक्यूम फ्लो मीटर (यदि आवश्यक निर्वात नियंत्रण वाल्व समायोजित पहले से गरम चक्र शुरू होता है जब जांच) 60 घन फीट / घंटा संकेत चाहिए ).
  14. चक्र पूरा हो गया है, कीपैड "इस प्रक्रिया को पूरा - नमूना हटाओ" दिखाएगा. कार्यक्रम, यूवी और मुख्य बिजली स्विच बंद कर दें.
  15. माइक्रोबैक्टीरियल निलंबन पूरी तरह से nebulized और यदि नहीं, तो ध्यान से सज्जित के साथ एक उपयुक्त सिरिंज के साथ निलंबन निकाल कर शेष मात्रा रिकॉर्ड किया गया है की जाँच करेंएक 18 जी कुंद सुई. शेष मात्रा से अधिक 1 मिलीलीटर नहीं होना चाहिए.
  16. जोड़ों से छिटकानेवाला निकालें और 2 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 2% Buraton युक्त एक पैन में जगह है, आमतौर पर कीटाणुशोधन हे / एन किया जाता है बाद में, एक ताजा पैन को छिटकानेवाला हस्तांतरण और पानी से अच्छी तरह कुल्ला. हवा शुष्क छिटकानेवाला छोड़ दें.
  17. एयरोसोल कक्ष खोलें और अपने पिंजरों को जानवरों के लौटने. आटोक्लेव बैग और आटोक्लेव में थैला टोकरी. . सुरक्षा कारणों के लिए, एक शक्ति शुद्ध हवा श्वासयंत्र इस प्रक्रिया के दौरान पहना जाना चाहिए: 2% Buraton नोट के साथ एयरोसोल चैंबर के अंदर की सतहों को साफ साफ कर लें.
  18. 7H11 अगर प्लेटों पर एक तकनीकी तीन प्रतियों (3 x 100 μl) की थाली 10 गुना dilutions (1.3 चरण देखें) माइक्रोबैक्टीरियल निलंबन की शेष 500 μl का उपयोग करना.

2. फेफड़ों में वांछित CFU की तेज सत्यापित करें

प्रायोगिक पशुओं की एयरोसोल संक्रमण के बाद एक दिन बैक्टीरियल लो निर्धारणवांछित CFU के तेज सत्यापित करने के क्रम में नामित नियंत्रण जानवरों के फेफड़ों में विज्ञापन. नोट: हम आम तौर पर दिन 1 CFU निर्धारण के लिए 3-5 चूहों के एक अतिरिक्त समूह को नामित.

समय के साथ एमटीबी संक्रमण के पाठ्यक्रम पर नजर रखने के लिए, माइक्रोबैक्टीरियल ऊतक बोझ CFU निर्धारण के लिए पूरे अंग homogenates के धारावाहिक dilutions चढ़ाना द्वारा जांच की जा सकती. फेफड़ों के क्षयरोग में रोग अभिव्यक्ति के लिए प्राथमिक साइट हालांकि तिल्ली, जिगर और लिम्फ नोड्स आमतौर पर तदनुसार विश्लेषण कर रहे है. चढ़ाया जा करने dilutions के ऊतकों में, साथ ही अंग और समय बिंदु पर विभिन्न बैक्टीरियल भार को जन्म देता है जो प्रारंभिक inoculum (उच्च खुराक बनाम कम खुराक) पर निर्भर करती है, जो अंगों में उम्मीद माइक्रोबैक्टीरियल लोड पर निर्भर विश्लेषण किया. कम खुराक संक्रमण पर, फेफड़ों में एमटीबी H37Rv के जीवाणु लोड आमतौर पर सुबह 25-30 के बीच एक पठार तक पहुँच जाता है.

  1. सीओ 2 asphyxiation या: euthanized जानवर (इच्छामृत्यु रखेंटर्मिनल एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक विदारक बोर्ड पर शोषक कागज पर संज्ञाहरण) और 70% इथेनॉल के साथ चूहों कीटाणुरहित. नोट: 70% शराब केवल सतह परिशोधन के लिए है और एमटीबी मार नहीं होगा.
  2. पेट के बीच में एक छोटा सा चीरा और सिर के ऊपर माउस त्वचा वापस लेना.
  3. शल्य कैंची से पेट और वक्ष पिंजरे खोलें और फेफड़ों पहुंच रहे हैं कि इतनी वक्ष दीवार हटा दें.
  4. फेफड़ों निकालें और homogenization बफर (बाँझ पानी / 1% v / v बीच 80/1% w / वी एल्बुमिन) के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण.
  5. एक छोटा सा पेट्री डिश में 100 माइक्रोन चलनी के माध्यम से एक 5 मिलीलीटर सिरिंज तनाव फेफड़ों के सवार का प्रयोग.
  6. फ्लश sieves कई बार एक बाधा टिप से सुसज्जित एक 1 एमएल पिपेट का उपयोग और 8 अगर प्लेटों के बीच फेफड़ों homogenate वितरित (सीए 250 μl / प्लेट;. यकीन है कि वे एक अच्छी तरह से सूखे सतह बनाने के लिए).
  7. ध्यान से 2% में खारिज कर रहे हैं, जो डिस्पोजेबल स्प्रेडर्स का उपयोग कर नमूने थालीBuraton.
  8. कैबिनेट के अंदर शुष्क करने के लिए अगर प्लेटें छोड़ दें. , Parafilm के साथ हर एक थाली सील एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटो और कम से कम 4 हफ्तों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ईमानदार सेते हैं.

3. भागने के सबूत मच्छर पिंजरों का निर्माण

कृंतक प्लाज्मोडियम उपभेदों मनुष्य के लिए हानिकारक नहीं हैं. हालांकि, एमटीबी संक्रमित चूहों परजीवी और काम के प्राप्तकर्ताओं के बाद से बीएसएल 3 शर्तों के तहत किया जाता है, सावधानियों उनके पिंजरों भागने से मच्छरों को रोकने के लिए आवश्यक हैं. योजना बनाई संक्रमण आहार पर निर्भर करता है, autoclavable और धातु फ्रेम पिंजरों या स्वयं बनाया डिस्पोजेबल पिंजरों पुन: प्रयोज्य इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रायोगिक पशुओं के काटने संक्रमण से माउस के अनुसार मच्छरों का एक निर्धारित संख्या से बाहर ले जाने के लिए आवश्यक है, तो बाद वाले सिफारिश कर रहे हैं. स्वयं बनाया पिंजरों की आवश्यकता है, मच्छरों और प्रयोगशाला की सुरक्षा के स्वास्थ्य के रूप में सटीक विनिर्देशों के लिए पिंजरों तैयार उनके Sou पर निर्भर करता हैएन डी निर्माण (चित्रा 2).

  1. इस तरह के एक आधा पिंट आइसक्रीम गत्ते का डिब्बा या कागज कॉफी कप (चित्रा 2) के रूप में एक गत्ते का डिब्बा ले लो.
  2. दफ़्ती के पक्ष में एक छोटे से खोलने में कटौती और मच्छरों के लिए एक सुरक्षित प्रवेश द्वार बनाने के लिए प्रत्येक टुकड़ा में कटौती एक भट्ठा के साथ लेटेक्स के एक डबल परत के साथ कवर किया. नोट: उद्घाटन 2 सेमी x 2 सेमी की एक समग्र आकार की है, हम में लाने के लिए और / या ले आउट मच्छरों जिसका उपयोग ट्यूबिंग (वातशोषक डिवाइस) एक वैक्यूम पंप से जुड़ी एक संशोधित 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब है और इसलिए के रूप में कार्य करता है 1.5 सेमी की एक व्यास के साथ एक Aspirator.
  3. भरी सोख करने के लिए गत्ते का डिब्बा के अंदर तल पर फिल्टर पेपर के एक टुकड़े टेप.
  4. जाल (नायलॉन जाल की दोहरी परत, आकार 1 मिमी x 1 मिमी) के साथ आइसक्रीम कप बंद और टेप और लोचदार बैंड द्वारा दफ़्ती के लिए तय कर लो.
  5. माउस प्रति मच्छरों की परिभाषित संख्या आवश्यक हैं जहां संक्रमण प्रयोगों के लिए, 10-15 संक्रमित मच्छरों के साथ पिंजरों तैयार करते हैं, जिनमें से प्रत्येक आदर्श एक ए वी शामिल10,000 जंगली प्रकार लार ग्रंथि पी. के erage berghei बिजाणुज.
  6. आदर्श रूप में, पूर्व रक्त भोजन प्रदर्शन करने के लिए 24 घंटे के लिए मच्छरों को भूखा.

4. मच्छर के काटने से चूहों की मलेरिया संक्रमण

इसमें प्रयोग कृंतक मलेरिया परजीवी पी. है berghei हालांकि ब्याज की किसी भी अन्य कृंतक प्लाज्मोडियम तनाव इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्रामक मच्छरों को प्राप्त करने के बीजाणुज प्रसारण के लिए परजीवी के पूरे जीवन चक्र हड्डीवाला मेजबान (माउस) और मच्छर वेक्टर दोनों में बनाए रखा है. परजीवी रखरखाव एक insectary में किया जाता है. प्राकृतिक प्रसारण प्रयोगों के लिए, लार ग्रंथि प्रति स्पोरोजोएट्स की न्यूनतम संख्या भी कम नहीं 10,000 से अधिक होना चाहिए. विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए परजीवी रखरखाव पर हम रंडी एट अल द्वारा मलेरिया अनुसंधान के तरीके को देखें., 2013.

  1. भोले चूहों या Ketamine साथ एमटीबी के साथ 40 दिनों के लिए preinfected जानवरों बेहोश करना (100 मिलीग्राम / किग्रा)intraperitoneal इंजेक्शन (200 μl / माउस) द्वारा और xylazine (7 मिलीग्राम / किग्रा) समाधान. नोट: एमटीबी और प्लाज्मोडियम संक्रमण के बीच समय अंतर्निहित अनुसंधान प्रश्न के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. इसी तरह, रोगज़नक़ चुनौतियों का क्रम उलट हो सकता है, यानी चूहों पूर्व एमटीबी संक्रमण को संक्रामक मच्छर के काटने से अवगत कराया जा सकता है.
  2. मच्छर पिंजरों (माउस अनुपात को परिभाषित मच्छर के लिए मच्छर पिंजरे प्रति एक माउस) के जाल पर anaesthetized चूहों प्लेस और मच्छरों 10-15 मिनट के लिए झिल्ली के माध्यम से फ़ीड करने के लिए अनुमति देते हैं. नोट: मच्छर हिम्मत में रक्त की उपस्थिति खिलाने और इस प्रकार, बीजाणुज प्रसारण निकलता है.
  3. वापस अपने पिंजरों में चूहों स्थानांतरण और वे संज्ञाहरण से जगा जब तक लगातार निगरानी. कागज तौलिया पर और नहीं बिस्तर (घुटन का जोखिम) पर प्लेस चूहों और (एक साथ मिलकर जगह और कागज तौलिए से शरीर को कवर) गर्म रखें: ध्यान दें.
  4. NETT के माध्यम से 70% इथेनॉल या अन्य disinfectants के साथ छिड़काव से मच्छरों को मारनेपिंजरे के आईएनजी. डिस्पोजेबल लोगों को इस्तेमाल किया गया है अगर आटोक्लेव पिंजरों और त्यागें.

5. निगरानी पेरासाइटिमिया

  1. पंचर पूंछ बहुत एक सुई के साथ खत्म होती है और एक स्लाइड के प्रत्येक के अंत में रक्त की एक बूंद इकट्ठा में नसों.
  2. स्लाइड की लंबाई के आधे से अधिक रक्त की एक बूंद खींचने के लिए एक और स्लाइड का प्रयोग करें. दूसरी स्मीयर के लिए अन्य में बढ़त का उपयोग करने के लिए स्प्रेडर पर पलटें. शुष्क हवा की स्लाइड्स छोड़ दें.
  3. Giemsa दाग
    1. स्लाइड धारकों में स्लाइड्स प्लेस और निरपेक्ष मेथनॉल में संक्षिप्त विसर्जन द्वारा रक्त स्मीयरों तय कर लो. नोट: कांच के बर्तन का उपयोग हम सभी के समाधान के लिए polypropylene cuvettes उपयोग बीएसएल 3 में कम से कम रखा जाना चाहिए.
    2. Giemsa में स्मीयरों (विआयनीकृत पानी में 1:10) विसर्जित कर दिया. 10 मिनट के बाद, अतिरिक्त दाग दूर कुल्ला करने विआयनीकृत पानी के साथ कई बार भरा धुंधला cuvettes के अंदर और बाहर स्लाइड डुबकी.
    3. अंत में, एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में शुष्क हवा स्लाइड.
  4. वैकल्पिक दाग: राइट & #180, एस दाग
    1. मेथनॉल में 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में राइट के दाग भंग.
    2. उपयोग करने के लिए पूर्व मुड़ा फिल्टर के माध्यम से फिल्टर.
    3. धुंधला समाधान में रक्त स्मीयरों विसर्जित कर दिया और 4 मिनट के लिए सेते (नोट: धुंधला समाधान आधारित मेथनॉल के रूप में स्मीयरों की मेथनॉल निर्धारण आवश्यक नहीं है).
    4. जैसा कि ऊपर वर्णित विआयनीकृत पानी में rinsing स्लाइड्स से धो और सूखी हवा स्लाइड छोड़ दें.
    5. Giemsa / राइट दाग पूरा हो जाने पर, धीरे से एक Buraton युक्त निपटान बर्तन में उपयोग किए गए सभी अभिकर्मकों हस्तांतरण.
  5. रक्त धब्बा विश्लेषण
    1. तेल विसर्जन के साथ एक 100 गुना बढ़ाई प्रकाश माइक्रोस्कोपी से सना हुआ रक्त स्मीयर का विश्लेषण करें.
    2. एरिथ्रोसाइट्स एक monolayer में व्यवस्थित होते हैं जहां रक्त स्मीयर के एक क्षेत्र में असंक्रमित और संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स गणना.
    3. एक अच्छी तरह से परिभाषित पेरासाइटिमिया को प्राप्त करने के लिए, एक एरिथ्रोसाइट monolayer प्रदर्शित देखने के लिए कम से कम 10 अलग अलग क्षेत्रों गिनती.
    4. Calculएरिथ्रोसाइट्स की संख्या से parasitized एरिथ्रोसाइट्स की संख्या में विभाजित है और 100 से गुणा करके (में%) रिश्तेदार पेरासाइटिमिया खा लिया.

Representative Results

एमटीबी और पी. के साथ चूहों के संक्रमण प्राकृतिक मार्ग, यानी एयरोसोल और मच्छर के काटने, क्रमशः, सभी जानवरों (तालिका 1) के अनुरूप और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण में परिणाम के माध्यम से berghei 1. हम सफल संक्रमण और रक्त क्रमशः (पी. berghei पेरासाइटिमिया) और विभिन्न अंगों में एमटीबी के बोझ में प्रारंभिक घटना (prepatency) और परजीवियों की संख्या निर्धारित करने से मलेरिया और तपेदिक दोनों बेशक निगरानी कर सकते हैं. संक्रामक मच्छर काटने से सफल मलेरिया परजीवी संचरण का एक उदाहरण तालिका 1 और 3 चित्र में दिखाया गया है. 4-5 दिन बाद (1 टेबल और चित्रा 3) रक्त चरण परजीवी की उपस्थिति से इस बात की पुष्टि के रूप में प्रत्येक माउस पर 10 बीजाणुज संक्रमित मच्छरों का दूध पिलाने की एक 100% संक्रमण दर में हुई. महत्वपूर्ण बात है, हम एक ही प्रयोगात्मक जीआर के व्यक्तिगत चूहों के रक्त में भी इसी तरह का परजीवी नंबर मिलओयूपी, एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण में मच्छर के काटने के परिणाम से कि बीजाणुज प्रसारण का संकेत है. एमटीबी-coinfected पशुओं में उस के साथ भोले नियंत्रण चूहों में prepatency की तुलना करके, हम उस prepatency थोड़ा एमटीबी (तालिका 1, चित्रा 3 बी) के साथ preinfected गया था कि चूहों में देरी हो रही है देख सकते हैं 1. हम पहले से 1 की सूचना दी है के रूप में चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, हम Giemsa से सना हुआ रक्त स्मीयरों में दैनिक निगरानी पेरासाइटिमिया द्वारा मलेरिया के पाठ्यक्रम पर एमटीबी coinfection के प्रभाव को निर्धारित कर सकते हैं.

व्यक्तिगत चूहों (चित्रा -4 ए) के बीच अपेक्षाकृत कम परिवर्तनशीलता के साथ फेफड़ों में बैक्टीरिया की सफल बयान में एक साँस लेना जोखिम प्रणाली के परिणाम के उपयोग द्वारा एमटीबी के साथ चूहों के संक्रमण. हम फेफड़े और CFU दृढ़ संकल्प से समय के साथ हित के अन्य अंगों में माइक्रोबैक्टीरियल भार का पालन कर सकते हैं. के फेफड़ों में माइक्रोबैक्टीरियल लोड करने के लिए एक उदाहरणएमटीबी पी. के अभाव या उपस्थिति में C57BL 6 / चूहों संक्रमित berghei 4B चित्रा में दिखाया गया है.

तालिका 1. Prepatency मच्छर काटने से बीजाणुज प्रसारण के बाद. सभी चूहों पी. के प्राकृतिक प्रसारण के बाद रक्त चरण संक्रमण विकसित berghei मच्छर काटने से स्पोरोजोएट्स. 1 एक PLoS, अनुमति के साथ 7 (10), e48110 से अनुकूलित.

प्रयोगात्मक माउस समूह (C57BL / 6) 10 संक्रामक मच्छरों के काटने से चुनौती समूह के अनुसार पशुओं के रक्त चरण सकारात्मक जानवरों / सं की संख्या मीन prepatency [डी]
भोले पी. berghei 7/7 4,4
एमटीबी संक्रमित पी. berghei 7/7 5,5 डी>

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रयोगात्मक प्रक्रिया की समग्र योजना. C57BL 6 / चूहों एक Glas कर्नल एयरोसोल कक्ष में एमटीबी युक्त एयरोसोल बूंदों के संपर्क में हैं. एक दिन एयरोसोल संक्रमण के बाद, एमटीबी के तेज फेफड़ों की CFU विश्लेषण द्वारा सत्यापित है. (तपेदिक से संक्रमित चूहों में पुराना हो गया है) एमटीबी चुनौती, जानवरों पी. के संपर्क में रहे 40 दिनों के बाद berghei मच्छरों संक्रमित. सफल बीजाणुज प्रसारण पुष्टि करने के लिए और प्लाज्मोडियम संक्रमण के पाठ्यक्रम का पालन करने के लिए, पेरासाइटिमिया मच्छर के काटने के बाद 3 दिन की शुरुआत के Giemsa से सना हुआ रक्त स्मीयरों में दैनिक नजर रखी है.

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चित्रा 2. एक मच्छर पिंजरे के स्केच. संक्रामक मच्छरों इस तरह के एक आधा पिंट आइसक्रीम दफ़्ती के रूप में एक गत्ते का डिब्बा अंदर समाहित कर रहे हैं. एक छोटी सी शुरुआत दफ़्ती के पक्ष में कटौती और मच्छरों के लिए एक सुरक्षित प्रवेश द्वार बनाने के लिए प्रत्येक टुकड़ा में कटौती एक भट्ठा के साथ लेटेक्स के एक डबल परत के साथ कवर किया जाता है. फिल्टर पेपर के एक टुकड़े भरी सोख करने के लिए गत्ते का डिब्बा के अंदर तल पर टेप है. आइसक्रीम कप टेप और लोचदार बैंड द्वारा दफ़्ती के लिए तय हो गई है, जो (नायलॉन जाल) फंसाना साथ बंद बंद हो जाती हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. Parasitized एरिथ्रोसाइट्स (स्केल बार, 20 और # दिखा एक राइट `s दाग ​​रक्त धब्बा के रक्त पेरासाइटिमिया. एक) उदाहरण181;. माउस रक्त में एम) बी) पेरासाइटिमिया दैनिक Giemsa से सना हुआ रक्त स्मीयर का विश्लेषण करके नजर रखी थी. Coinfected चूहों प्लाज्मोडियम एकल संक्रमित चूहों (n = 10) की तुलना में एक कम पेरासाइटिमिया है, परिणाम एसडी ± का मतलब है के रूप में दिखाए जाते हैं; *** पी <0,001. 1 एक PLoS, अनुमति के साथ 7 (10), e48110 से पुनर्प्रकाशित.

चित्रा 4
चित्रा 4. फेफड़ों में एमटीबी की जांच. C57BL 6 / चूहों एयरोसोल एमटीबी की 100 CFU के साथ चुनौती दी थी और पी. के साथ 40 दिन बाद, coinfected berghei मच्छर काटने से. ए) एक दिन एयरोसोल संक्रमण के बाद एमटीबी की वांछित संख्या के तेज CFU निर्धारण के लिए पूरे फेफड़ों homogenates चढ़ाना द्वारा सत्यापित किया गया था. बी) जीवाणुcoinfection के समय में एल भार CFU विश्लेषण (एमटीबी d40/d0) के माध्यम से 3 चूहों के फेफड़ों lysates में निर्धारित किया गया है. 12 दिनों coinfection के बाद, फेफड़ों lysates एमटीबी नियंत्रण पर प्लाज्मोडियम coinfection के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए CFU विश्लेषण के लिए चढ़ाया गया. फेफड़ों में एमटीबी संख्या पी. के साथ coinfection दौरान वृद्धि हुई है, ध्यान दें berghei NK65. एक्स अक्ष लेबलिंग: coinfection के बाद एमटीबी -infection/time के बाद समय. 1 एक PLoS, अनुमति के साथ 7 (10), e48110 से अनुकूलित.

Discussion

हम चूहों उत्पादकता एमटीबी और पी. से संक्रमित हो सकता है कि कैसे वर्णित संक्रमण के अपने प्राकृतिक मार्गों के माध्यम से berghei. हम प्रयोगात्मक तपेदिक 13 या मलेरिया के 12 अध्ययन करने के लिए संक्रमण प्रोटोकॉल स्थापित है और हाल ही में माउस मॉडल 1 में एमटीबी और प्लाज्मोडियम के बीच coinfection अध्ययन करने के लिए उन्हें अपनाया लागू होते हैं.

सफल संक्रमण के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम वांछित संख्या में दोनों रोगजनकों का प्रसारण कर रहे हैं. वे समय के साथ व्यवहार्यता खो देंगे क्योंकि mycobacterial शेयरों में 2 साल से अधिक उम्र नहीं होना चाहिए, और शेयरों की मूल निर्धारित अनुमापांक सबसे अधिक संभावना अब नहीं सही हो जाएगा. नतीजतन, संक्रमण खुराक उम्मीद से काफी कम होगा. इसलिए, शेयर संस्कृतियों का CFU titers हर कुछ महीने निर्धारित किया जाना चाहिए. समान रूप से महत्वपूर्ण पहली जगह में मानकीकृत खेती और एमटीबी शेयरों की पीढ़ी है. जैसे संस्कृति की स्थितिमध्यम, पूरक, समय, और मात्रा एमटीबी की विभिन्न कंपनियों के शेयरों का उपयोग कर प्रयोगों से डेटा की तुलना करने में सक्षम होने के लिए तय की जानी चाहिए. माइक्रोबैक्टीरिया इसलिए यह फसल बैक्टीरिया एक ही विकास के चरण में, मानकीकृत संस्कृति की स्थिति रखने के लिए और aliquoting के दौरान अक्सर resuspend करने के लिए महत्वपूर्ण है, संस्कृति दौरान पेड़ों का झुरमुट के लिए करते हैं. अन्यथा CFU titers और संक्रमण के परिणाम में एक व्यापक बदलाव हो सकता है.

एक ही ढंग से संक्रमित मच्छर बैचों की पीढ़ी में एक और महत्वपूर्ण कदम है. अलग मच्छरों प्रत्येक व्यक्ति माउस पर खिलाऊँगी के बाद से, यह एक संक्रमण प्रयोग के लिए इस्तेमाल मच्छरों के सभी एक ही बैच से आते हैं और मच्छरों की 90% से अधिक संक्रमित हैं जहां केवल उन बैचों उपयोग किया जाता है कि महत्वपूर्ण है.

मौजूदा मॉडल ही संक्रमित मेजबान में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए यह तुलना द्वारा एक coinfected मेजबान में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा modulations काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम VA लागू कर सकते हैंऐसे ऊतक विज्ञान, immunohistochemistry, प्रतिरक्षा सेल आबादी के cytometry विश्लेषण, या ब्याज के ऊतकों या शरीर के तरल पदार्थ को साइटोकाइन और केमोकाइन का पता लगाने के लिए पीसीआर और एलिसा के रूप में कुख्यात अच्छी तरह से स्थापित तरीके. यह इस तरह के माउस मॉडल कुछ सीमाएं हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए. एमटीबी से संक्रमित लोगों के बहुमत के नैदानिक ​​लक्षण के कोई संकेत नहीं के साथ एक अव्यक्त संक्रमण का विकास, जबकि चूहों प्रगतिशील फेफड़ों विकृति के साथ एक जीर्ण रोग का विकास. फिर भी, C57BL 6 / चूहों एमटीबी संक्रमण को अपेक्षाकृत प्रतिरोधी रहे हैं और मानव तपेदिक रोगियों में मनाया के रूप में शास्त्रीय granulomas विकसित नहीं है. नतीजतन, माउस में immunopathological प्रतिक्रियाओं उचित न तो अव्यक्त और न ही सक्रिय मानव तपेदिक की बीमारी को प्रतिबिंबित करते हैं. आदमी और माउस में अव्यक्त और पुरानी बीमारी के बीच विसंगति के बावजूद, चूहों बड़े पैमाने पर एमटीबी संक्रमण को नियंत्रित करने और जांच करने के लिए मूल्यवान और अपरिहार्य औजार हैं कि मेजबान कारकों की पहचान और अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैसंक्रामक रोगों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया. महत्वपूर्ण बात है, एमटीबी संक्रमण के लिए संवेदनशीलता अधिक इस्तेमाल किया जन्मजात माउस उपभेदों और ऐसे डीबीए या C3H के रूप में अधिक अतिसंवेदनशील तनाव के बीच काफी भिन्न सह और एकल संक्रमण के अध्ययन में शामिल किया जा सकता है. इसके अलावा, के अलावा यहाँ बताया रोगज़नक़ प्रजातियों से, ब्याज (जैसे चिकित्सीय आइसोलेट्स) के किसी अन्य माइकोबैक्टीरियम प्रजातियों का इस्तेमाल किया जा सकता है. कोई भी मलेरिया मॉडल मानव रोग अलग माउस मॉडल के सभी पहलुओं replicates, जबकि इसी तरह, बारीकी से स्वाभाविक रूप से प्राप्त कर लिया मानव मलेरिया संक्रमण के विभिन्न पहलुओं जैसे लगते है. उदाहरण के लिए, पी. berghei ANKA और पी. yoelii YM/17XL व्यापक रूप से पी. के साथ, मानव (पी. फाल्सीपेरम प्रेरित) गंभीर मलेरिया के मॉडल का अध्ययन कर रहे हैं berghei ANKA मानव मस्तिष्क malari है 14,15 के लिए एक शानदार मॉडल के रूप में माना जा रहा है. पी. berghei NK65 hyperparasitaemia और तीव्र मलेरिया एनीमिया के लिए एक शानदार मॉडल है, और हाल ही में किया गया हैमलेरिया से जुड़े तीव्र श्वसन संकट सिंड्रोम (एमए ARDS 16) के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में वर्णित है. वर्णित coinfection मॉडल का उपयोग करना, हम हाल ही में दिखा सकता है कि समवर्ती पी. berghei NK65 संक्रमण जीर्ण तपेदिक 1 exacerbates.

इसके अलावा अलग कृंतक मलेरिया परजीवी का उपयोग करने से, संक्रमण की घटनाओं का क्रम और समय अंतर्निहित अनुसंधान प्रश्न के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है. क्षेत्र में, सहवर्ती प्लाज्मोडियम संक्रमण एमटीबी संक्रमण के समय उपस्थित या बाद में प्राप्त किया जा सकता है. दोनों स्थितियों में एमटीबी और प्लाज्मोडियम के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अलग ढंग से प्रभावित किया जा सकता है. इसलिए, चूहों से पहले या एमटीबी संक्रमण के बाद या तो प्लाज्मोडियम स्पोरोजोएट्स से संक्रमित हो सकते हैं. इसके अलावा, चूहों अलग अलग समय पर चुनौती दी जा सकती जीर्ण बनाम तीव्र पर प्लाज्मोडियम प्रेरित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के प्रभाव का आकलन करने के लिए एमटीबी के बाद संक्रमणतपेदिक. मलेरिया तपेदिक coinfection के अध्ययन के लिए एक मलेरिया परजीवी का चयन करते समय महत्वपूर्ण बात है,, एक कुछ कृंतक प्लाज्मोडियम उपभेदों कुछ माउस उपभेदों में गंभीर बीमारी का कारण है और एमटीबी पुरानी और असुरक्षित में लंबे समय से स्थायी संक्रमण का कारण बनता है, जबकि केवल दिनों या हफ्तों के भीतर संक्रमण का शिकार पता होना चाहिए कि चूहों. इसलिए, coinfection के समय प्रायोगिक पशुओं की अकाल मृत्यु से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.

कई रोगज़नक़ प्रजातियों के साथ एक साथ संक्रमण से मेजबान उन्मुक्ति के मॉडुलन खराब समझ बनी हुई है. एक coinfected होस्ट की प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ प्लाज्मोडियम बातचीत और coinfections रोगजनन, रोग परिणाम, टीकाकरण, immunodiagnostics, और चिकित्सा को प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे हमारी समझ के लिए योगदान देगा - हमारी प्रयोगात्मक coinfection मॉडल माइकोबैक्टीरियम की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों मच्छर प्रजनन के लिए मरियम एस्टर धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम रिसर्च सेंटर Borstel से घर में धन के द्वारा समर्थित और लाइबनिट्स केंद्र संक्रमण से वित्त पोषण शामिल हो गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buraton Schülke active ingredients: aldehyds (formaldehyde, glutaraldehyde, oxalaldehyde, ethyl hexanal)
Middlebrook 7H9  Sigma M0178 For Mtb broth cultures
Middlebrook 7H11  BD Biosciences 283810 Agar medium for Mtb culture
Middlebrook OADC enrichment medium BD Biosciences 212240 Add to 7H9 and 7H11 for Mtb culture
Staining Dish Science Services E62542-12
24-slide Holder w/Handle Science Services E62543-06
Giemsas Azur-Eosin-Methylene blue solution Merck Millipore 109204
Wright´s stain Sigma W0625
Inhalation Exposure System Glas-Col
Nebulizer-Venturi Glas-Col
Ice cream cups Häagen-Dazs Used as mosquito cages
Metal-frame mosquito cages BioQuip Products 1450A

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References

  1. Mueller, A. -K., et al. Natural Transmission of Plasmodium berghei Exacerbates Chronic Tuberculosis in an Experimental Co-Infection Model. PLoS ONE. 7, e48110 (2012).
  2. Korbel, D. S., Schneider, B. E., Schaible, U. E. Innate immunity in tuberculosis: myths and truth. Microbes Infect. 10, 995-1004 (2008).
  3. Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annu. Rev. Microbiol. 63, 195-221 (2009).
  4. Cirimotich, C. M., Dong, Y., Garver, L. S., Sim, S., Dimopoulos, G. Mosquito immune defenses against Plasmodium infection. Dev. Compar. Immuno. 34, 387-395 (2010).
  5. Page, K. R., et al. Mycobacterium-induced potentiation of type 1 immune responses and protection against malaria are host specific. Infect. Immun. 73, 8369-8380 (2005).
  6. Hawkes, M., et al. Malaria exacerbates experimental mycobacterial infection in vitro and in vivo. Microbes Infect. 12, 864-874 (2010).
  7. Scott, C. P., Kumar, N., Bishai, W. R., Manabe, Y. C. Short report: modulation of Mycobacterium tuberculosis infection by Plasmodium in the murine model. Am. J. Trop. Med. Hyg. 70, 144-148 (2004).
  8. Hoffman, S. L., Doolan, D. L. Malaria vaccines-targeting infected hepatocytes. Nat. Med. 6, 1218-1219 (2000).
  9. Mueller, A. K., et al. Genetically attenuated Plasmodium berghei liver stages persist and elicit sterile protection primarily via CD8 T cells. Am. J. Pathol. 171, 107-115 (2007).
  10. Mueller, A. K., Labaied, M., Kappe, S. H., Matuschewski, K. Genetically modified Plasmodium parasites as a protective experimental malaria vaccine. Nature. 433, 164-167 (2005).
  11. Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216, 160-162 (1967).
  12. Vaughan, J. A., Scheller, L. F., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Infectivity of Plasmodium berghei sporozoites delivered by intravenous inoculation versus mosquito bite: implications for sporozoite vaccine trials. Infect. Immun. 67, 4285-4289 (1999).
  13. Coleman, J., Juhn, J., James, A. A. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J. Vis. Exp. , e228 (2007).
  14. Franke-Fayard, B., et al. A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
  15. Lin, J. W., et al. Loss-of-function analyses defines vital and redundant functions of the Plasmodium rhomboid protease family. Mol. Microbiol. 88, 318-338 (2013).
  16. Bancroft, J. D. G., M, Theory and Practice of Histological Techniques. , Churchill Livingstone. New York. (2007).
  17. Schneider, B. E., et al. A role for IL-18 in protective immunity against Mycobacterium tuberculosis. Eur. J. Immunol. 40, 396-405 (2010).
  18. Craig, A. G., et al. The role of animal models for research on severe malaria. PLoS Pathog. 8, e1002401 (2012).
  19. de Souza, J. B., Hafalla, J. C., Riley, E. M., Couper, K. N. Cerebral malaria: why experimental murine models are required to understand the pathogenesis of disease. Parasitology. 137, 755-772 (2010).
  20. Van den Steen, P. E., et al. Immunopathology and dexamethasone therapy in a new model for malaria-associated acute respiratory distress syndrome. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, 957-968 (2010).

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संक्रामक रोगों अंक 84 coinfection माउस टीबी मलेरिया, प्राकृतिक प्रसारण
प्राकृतिक ट्रांसमिशन पर क्षय रोग मलेरिया coinfection अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मॉडल<i> माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</i> और<i> प्लाज्मोडियम berghei</i
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Mueller, A. K., Behrends, J., Blank, J., Schaible, U. E., Schneider, B. E. An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (84), e50829, doi:10.3791/50829 (2014).

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